Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 11
Формирование представлений о мутационном процессе 11
1.1. Первые гипотезы о причинах мутационных изменений 11
1.2. Вклад физиологической теории мутационного процесса М. Е. Лобашева в формирование современных представлений о мутационных изменениях генетического материала 13
1.3. Современные представления о мутационном процессе 15
1.4. Методы выявления первичных повреждений ДНК
1.5. Методы генетической токсикологии для выявления мутаций и хромосомных аберраций 23
1.6. Альфа-тест как метод для выявления фенотипического проявления первичных повреждений и наследуемых изменений генетического материала 26
1.6.1. Генетические механизмы, лежащие в основе альфа-теста 27
1.6.1.1. Жизненный и клеточный циклы гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae 27
1.6.1.2. Генетический контроль типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 30
1.6.1.3. Переключение типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 31
1.6.2. Генетические события, учитываемые в альфа-тесте 34
1.6. Постановка задачи 41
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе 43
2.2. Плазмиды 44
2.3. Среды и условия культивирования 45
2.4. Реактивы 46
2.5. Стандартные методы генетики дрожжей 46
2.6. Молекулярно-генетические методы 46
2.7. Обработка клеток эталонными мутагенами 47
2.8. Фотореактивация 47
2.9. Тесты на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию 2.10. Определение общей частоты "незаконной" гибридизации и цитодукции. 48
2.11. Определение типа спаривания "незаконных" гибридов и цитодуктантов 49
2.12. Количественный тест на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину 50
2.13. Процедура синхронизации дрожжевых клеток перед проведением проточной
цитометрии 50
2.14. Подготовка образцов для проточной цитометрии 51
2.15. Микроскопия с флуоресцентной окраской DAPI (4 ,6-диамидино-2-фенилиндол) 51
2.16. Статистические методы 52
Глава 3. Результаты 54
3.1. Исследование фенотипического проявления модификаций оснований ДНК, индуцированных аналогами оснований, в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции 54
3.1.1. Влияние 6-N-гидроксиламинопурина на частоту наследуемых и ненаследуемых повреждений ДНК 54
3.1.2. Влияние накопления эндогенного 8-окcогуанина на частоту наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала 60
3.2. Влияние инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями на частоту наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала, выявляемых в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции 63
3.3. Изучение способности пиримидиновых димеров проявляться фенотипически в альфа-тесте 67
3.4. Исследование фенотипического проявления двунитевых разрывов ДНК в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции 71
3.5. Изучение природы "незаконных" гибридов, потерявших хромосому III 76
3.6. Изучение фенотипического проявления первичных повреждений генетического материала в клеточном цикле 79
3.6.1. Подбор условий для синхронизации дрожжевых штаммов, используемых в альфа-тесте 79
3.6.2. Тест на "незаконную" гибридизацию с использованием синхронизированных на стадии G1 дрожжевых культур 86
3.6.3. Тест на "незаконную" цитодукцию с использованием дрожжевых культур, заблокированных на стадии G1 90
Глава 4. Обсуждение 95
4.1. Молекулярная природа первичных повреждений, способных проявляться фенотипически 95
4.2. Особенности устранения различных типов первичных повреждений в ходе клеточного цикла 96
4.3. Преимущества и ограничения альфа-теста 105
Заключение 107
Выводы 108
Список литературы
- Современные представления о мутационном процессе
- Молекулярно-генетические методы
- Влияние 6-N-гидроксиламинопурина на частоту наследуемых и ненаследуемых повреждений ДНК
- Особенности устранения различных типов первичных повреждений в ходе клеточного цикла
Введение к работе
Актуальность темы. Живые организмы постоянно испытывают разнообразные воздействия генетически активных факторов, которые нарушают стабильность генома (Абилев и Глазер, 2015). Изменение темпов мутирования под действием экзогенных и эндогенных факторов может существенно отразиться на численности и генетической структуре популяции, а также здоровье человека и приспособленности растений и животных к условиям обитания. Дестабилизация генетического материала является причиной возникновения многих наследственных и онкологических заболеваний человека, а также приводит к снижению жизнеспособности организмов и ускоряет процесс старения клеток (Friedberg et al., 2006; Hoeijmakers, 2009; Bernstein et al., 2013). Согласно современным представлениям, в основе абсолютного большинства наследуемых изменений генетического материала лежат первичные повреждения ДНК, такие как одно- и двунитевые разрывы ДНК, модификации оснований, пиримидиновые димеры, 6-4 фотопродукты, аддукты, разрывы сахаро-фосфатного остова молекулы ДНК (Pages and Fuchs, 2002; Friedberg et al., 2006). Процесс устранения первичных повреждений ДНК включает несколько этапов и может занимать длительное время. В результате репарации поврежденной ДНК первичные повреждения либо бесследно устраняются, либо превращаются в генные мутации и хромосомные перестройки, или индуцируют реципрокную рекомбинацию, что приводит к изменению фенотипических признаков организма (Friedberg et al., 2006). Влияние наследуемых изменений генетического материала на фенотип организмов изучено достаточно хорошо, но данные о характере и механизмах фенотипического проявления первичных повреждений ДНК ещё до момента их превращения в мутации или устранения системами репарации практически отсутствуют. Для решения этой актуальной задачи мы применили подход, разработанный на кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета, который получил название альфа-тест.
Степень разработанности темы. Хорошо изучены последствия накопления генных и геномных мутаций в канцерогенезе, выявлены мутантные аллели некоторых генов, которые тесно связаны с риском развития наследственных и онкологических заболеваний (Friedberg et al. 2006; Pierce, 2012; Alberts et al., 2015). Тем не менее, первые этапы становления генных и геномных мутаций (Лобашев, 1946), а именно: механизмы возникновения и взаимопревращения первичных (предмутационных) повреждений ДНК, а также временные параметры и эффективность их устранения системами репарации – требуют дальнейшего более глубокого изучения. В настоящее время разработано много методов для регистрации генных и геномных мутаций различных типов (Kumari et al., 2008), но из-за врменного характера первичных повреждений эти методы не позволяют прослеживать весь процесс превращения первичных повреждений ДНК в наследуемые изменения генетического материала, а также сопоставлять фенотипическое проявление первичных повреждений и наследуемых изменений генетического материала. Альфа-тест – единственная из известных систем, позволяющая регистрировать фенотипическое проявление первичных повреждений ДНК и отличать его от проявления наследуемых изменений генетического материала. К настоящему времени продемонстрирована эффективность альфа-теста для выявления генетически активных физических и химических факторов, а также для изучения результата инактивации ряда генов системы синтеза ДНК в
обход повреждений и репарации ДНК с двунитевыми разрывами (Степченкова и др., 2009; Kochenova et al., 2011). Данные, полученные нами ранее, подтверждают, что альфа-тест является адекватным подходом для регистрации фенотипического проявления первичных повреждений ДНК и наследуемых изменений генетического материала, возникающих как спонтанно, так и при воздействии различными мутагенами.
Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы: изучить характер фенотипического проявления первичных повреждений генетического материала и их вклада в наследственную и модификационную изменчивость у дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием альфа-теста.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Оценить способность первичных повреждений различных типов:
модификаций оснований, двунитевых разрывов, пиримидиновых димеров,
индуцированных эталонными мутагенами, а также модификаций и неспаренностей
оснований, возникших на фоне дефектов систем репарации, проявляться
фенотипически.
2. Определить временные параметры процесса устранения и
фенотипического проявления первичных повреждений относительно стадий
клеточного цикла.
Научная новизна. В представленной работе впервые установлена молекулярная природа первичных повреждений ДНК, способных проявляться фенотипически в альфа-тесте, а также исследована возможность их фенотипического проявления в зависимости от стадии клеточного цикла, на которой возникли повреждения. Впервые с использованием изогенных штаммов дрожжей было проведено комплексное исследование эталонных мутагенов и дефектов систем репарации в альфа-тесте, состоящем из двух взаимодополняющих систем: тестов на "незаконную" гибридизацию и "незаконную" цитодукцию. Дополнительно в ходе исследования было установлено, что дрожжевые клетки, потерявшие хромосому III, способны вступать в гибридизацию.
Теоретическая и практическая значимость работы. Изучение процесса преобразования первичного повреждения в наследуемое изменение генетического материала представляет особый интерес, как с теоретической, так и с практической точек зрения. Исследования в этой области важны для понимания механизмов становления мутаций, реципрокной и других типов рекомбинации и иных нарушений генетического материала, а также для дальнейшего развития генетической токсикологии и исследования механизмов, блокирующих мутагенез. Полученные результаты вносят вклад в развитие теории мутационного процесса, а также будут полезны для дальнейшего изучения взаимодействия систем репликации и репарации генетического материала, и исследования точности репарации, и понимания фундаментальных механизмов изменчивости. Результаты работы могут быть использованы в исследованиях в области общей биологии и генетики, мониторинга состояния окружающей среды, а также для разработки и совершенствования систем тестирования генетической активности факторов, обладающих потенциальной мутагенной и канцерогенной активностью, что необходимо для защиты генома человека и животных от эндогенных и экзогенных мутагенных факторов. Полученные нами результаты могут быть использованы в лекциях по курсам "Репликация, репарация и мутагенез", "Молекулярная генетика", "Частная генетика дрожжей", "Механизмы модификаций. К общей
теории изменчивости", читаемых на кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета, а также в образовательном процессе в биологических и медицинских высших учебных заведениях России.
Методология и методы исследования. В представленной работе использован интегральный подход, сочетающий методы классической и молекулярной генетики, современные молекулярно-генетические и цитологические подходы. В работе использован широкий спектр молекулярно-генетических методов (клонирование генов, трансформация клеток дрожжей и бактерий, полимеразная цепная реакция, методы по дизайну праймеров и плазмид, метод индукции потери хромосом), методы флуоресцентной микроскопии, проточная цитометрия, компьютерный анализ данных и статистические методы для оценки достоверности результатов. Исследование проводили с использованием в качестве модельного объекта эукариотических микроорганизмов грибов Saccharomyces cerevisiae.
Положения, выносимые на защиту. Модификации оснований и двунитевые разрывы ДНК могут проявляться фенотипически в альфа-тесте до их устранения системами репарации или превращения в наследуемые изменения генетического материала. Неспаренности оснований не имеют самостоятельного фенотипического проявления в альфа-тесте и могут быть учтены только после их превращения в наследуемые изменения генетического материала. В зависимости от молекулярной природы первичного повреждения и связанной с этим его способностью нарушать матричные процессы, большинство первичных повреждений могут фенотипически проявляться в альфа-тесте в пределах одного клеточного цикла. Если первичное повреждение произошло на стадии G1, то вероятность его самостоятельного фенотипического проявления в альфа-тесте является максимальной. Самостоятельное фенотипическое проявление первичных повреждений, возникших на стадиях S, G2 или М, может быть зафиксировано в альфа-тесте, если эти повреждения могут сохраняться в клеточном цикле до следующей стадии G1, в которой становится возможным их проявление.
Степень достоверности и апробация результатов. Данные, представленные в диссертации, опубликованы в трех статьях, в том числе, две статьи опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Материалы работы были представлены и доложены на восьми международных и Всероссийских конференциях. Достоверность экспериментальных данных, представленных в диссертации, подтверждена воспроизводимостью результатов экспериментов и доказана с применением методов математической статистики и современного программного обеспечения.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах и включает следующие разделы: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список литературы", и "Приложения". В тексте представлено 38 рисунков и 3 таблицы. Приложение состоит из 15 таблиц. Список литературы содержит 221 источник.
Современные представления о мутационном процессе
Впервые предположение о существовании предмутационных (первичных) повреждений генетического материала, и связи мутагенеза с процессом репарации было сформулировано М. Е. Лобашевым в 40-х гг. XX века. На основании работ Д. Н. Насонова и В. Я. Александрова, а также соственных экспериментальных данных М. Е. Лобашев сформулировал физиологическую гипотезу мутационного процесса. Изучая механизмы приспособления организма к факторам среды, Д. Н. Насонов и В. Я. Александров установили, что при воздействии повреждающими агентами в клетках растений и животных наблюдаются закономерные обратимые изменения, которые приводят к увеличению сорбционных свойств тканей в отношении некоторых красителей. [36]. Авторы этой работы сделали вывод о том, что различные по своей природе воздействия вызывают в клетке однотипную неспецифическую реакцию с характерным комплексом изменений, и предположили, что в основе обратимых изменений лежит обратимая денатурация белков цитоплазмы [36]. М. Е. Лобашев предположил, что изменение количества красителя, адсорбированного тканью, служит показателем степени повреждения клеток и позволяет оценивать чувствительность клеток разных организмов к различным воздействиям. Это предположение было проверено Михаилом Ефимовичем в экспериментах по воздействию высокой температурой на лягушек и мышей, которых предварительно содержали при разных температурных режимах [33]. На основе этих исследований был сделан вывод о том, что изменение некоторых свойств живого вещества клетки происходит при перемене условий и при этом смещается порог повреждений, который может сохраняться некоторое время после изменения внешних условий [33]. М. Е. Лобашевым были проведены дополнительные эксперименты по окраске нейтральротом половых клеток дрозофилы при воздействии на них высокой температурой и рентгеновским облучением. Было показано, что эти воздействия приводят к обратимому увеличению сорбционных свойств цитоплазмы половых клеток, а восстановление клетки к исходному состоянию зависит от глубины воздействия и условий, при которых оно происходит. Изменение сорбционных свойств цитоплазмы можно рассматривать как косвенный показатель временных изменений в клетке [33]. На основе этих экспериментальных данных для объяснения механизмов возникновения мутаций М. Е. Лобашев предложил новую гипотезу, согласно которой в основе мутационных изменений лежат некоторые обратимые повреждения клетки, которые являются выражением реакции живой системы на неблагоприятную перемену условий среды. Мутации возникают при крайних отклонениях условий существования организма от оптимума, выводящих его за пределы возможности адаптивных реакций на перемену условий [33]. Частота возникновения мутаций зависит не только от глубины наносимого клетке повреждения, но и от способности клетки к репарации, под которой понимается скорость восстановительных процессов после прекращения действия агента [33]. Основные положения гипотезы М. Е. Лобашева изложены в его диссертации на соискание степени доктора биологических наук "О природе действия внешних условий на динамику мутационного процесса" и в статье "Физиологическая (паранекротическая) гипотеза мутационного процесса" [33, 37].
Таким образом, в физиологической гипотезе мутационного процесса впервые были связаны два понятия мутация и репарация. Появление физиологической гипотезы направило развитие представлений о механизме возникновения мутаций как процесса. Стало понятно, что само по себе повреждение генетического материала в результате действия мутагена еще не мутация. Появление мутации – это сложный физиологический процесс, при котором становление мутации осуществляется в процессе репарации ДНК с повреждением по принципу нетождественного восстановления. Репарация ДНК с повреждением может быть неточной и тогда она приводит к мутационному изменению, либо точной, что приведет к восстановлению исходной структуры генетического материала. Несмотря на то, что физиологическая гипотеза исходила из представления о белковой природе генетического материала, общий принцип денатурации-репарации макромолекул оказался применимым и к ДНК как основе генетического материала. Мировая наука пришла к пониманию связи возникновения мутаций и репарации лишь в 60-е гг. прошлого века [38].
Современные представления о причинах возникновения и становления мутаций сформировались в 60-х годах XX в. и возникли благодаря овладению методами индуцированного мутагенеза, расшифровке структуры ДНК, открытию систем репарации, репликации и рекомбинации генетического материала. Согласно современной теории мутационного процесса, основы которой были заложены в физиологической гипотезе мутационного процесса Лобашова, мутации возникают в два этапа. На первом этапе возникает первичное повреждение ДНК, которое существует в клетке некоторое время. На втором этапе происходит превращение первичных повреждений в наследуемые изменения генетического материала в результате нетождественной репарации. Таким образом, любому мутационному изменению, спонтанному или индуцированному различными факторами, предшествует первичное повреждение генетического материала.
Первичные повреждения ДНК, представляющие собой временные модификации генетического материала, возникают спонтанно в результате естественной химической нестабильности молекулы ДНК или под действием ультрафиолетового и ионизирующего излучений, активных форм кислорода, промежуточных продуктов метаболизма, экзогенных химических веществ, при ошибках в ходе репликации и нетождественной репарации, а также других экзогенных или эндогенных факторов [2, 4, 39, 40]. Повреждаться могут как азотистые основания, так и сахаро-фосфатный остов ДНК (рисунок 1). Азотистые основания ДНК могут быть модифицированы посредством их дезаминирования, метилирования, образования аддуктов и пиримидиновых димеров. Например, дезаминирование цитозина, аденина и гуанина приводит к их превращению в урацил, гипоксантин и ксантин соответственно. При спонтанном гидролизе N 16 гликозидных связей происходит потеря оснований с образованием апуриновых и апиримидиновых сайтов (АП-сайтов). При повреждении сахаро-фосфатного остова возникают одно- и двунитевые разрывы, а также могут возникать поперечные сшивки цепей ДНК [2, 39, 41].
Молекулярно-генетические методы
Независимые культуры клеток дрожжей тесторного штамма обрабатывали ГАП во время роста культуры. Для этого дрожжи выращивали в течение 16 ч в жидкой среде YEPD, содержащей ГАП в концентрации 50 мг/л. Затем клетки, обработанные таким образом, использовали в тестах на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию.
Обработку клеток камтотецином производили на твердой среде. Ночную культуру клеток тестерного штамма высевали на среду YEPD, содержащую камптотецин в концентрации 7 мг/л.
Облучение клеток тестерного штамма ультрафиолетовым светом с длиной волны 264 нм проводили на твердой селективной и полной средах. Источником излучения служили две параллельно расположенные лампы ДБ30 с мощностью излучения 4 Джс/м2. Доза облучения составляла 17 Дж/м2 или 31 Дж/м2 в зависимости от длительности обработки.
Для индукции фотореактивации клетки тестерного штамма облучали ультрафиолетовым излучением с длиной волны 365 нм в дозе 36000 Дж/м2. В качестве источника облучения служили две параллельно расположенные лампы VL-330BL фирмы Vilber с мощностью излучения 10 Джс/м2. 2.9. Тесты на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию 6-12 независимых культур тестерного штамма растили в жидкой среде YEPD в течение 16 часов при 30С на качалке. Клетки с мутацией cdc28-4 выращивали 48 часов при 22С в жидкой среде YEPD на качалке. При тех же условиях растили культуру штамма Д926, используемого в качестве партнера для скрещивания в альфа-тесте. Обработку мутагенами осуществляли согласно п. 2.7.
В тесте на "незаконную" гибридизацию по 50 или 100 мкл суспензии клеток обоих штаммов высевали на селективную среду для отбора "незаконных" гибридов. При изучении действия камптотецина (см. п. 2.7) обработку мутагеном проводили на твердой среде, поэтому клетки обоих штаммов высевали на среду YEPD и среду YEPD с камптотецином, чашки инкубировали 24 час, после чего клетки перепечатывали на селективную среду для отбора "незаконных" гибридов. В тесте на "незаконную" цитодукцию выросшие в жидкой среде клетки концентрировали в десять раз до концентрации 109 кл/мл. По 100 мкл суспензии клеток тестерного штамма и партнера для скрещивания высевали на твердую среду YEPD и инкубировали совместно 48 часов, после чего клетки перепечатывали на среду для отбора "незаконных" цитодуктантов.
Параллельно подходящие разведения клеток тестерного штамма высевали на среду YEPD для оценки выживаемости.
Общую частоту "незаконной" гибридизации или цитодукции в каждом случае вычисляли по формуле F = (Mxa)xJ, (N х Ъ) х с где М - число колоний, выросших на среде для отбора "незаконных" гибридов или цитодуктантов, N - число колоний, выросших на полной среде, a и b - соответствующие факторы разведения, с - объём культуры тестерного штамма, высеянный на селективную среду для отбора "незаконных" гибридов или цитодуктантов, d - объём культуры тестерного штамма, высеянный на полную среду для оценки выживаемости.
При определении частот "незаконной" гибридизации или цитодукции использовали 6-12 независимых культур тестерного штамма. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. 2.11. Определение типа спаривания "незаконных" гибридов и цитодуктантов
Отобранных "незаконных" гибридов распределяли по классам в соответствии с их типом спаривания и наличием ауксотрофностей по гистидину и треонину (Таблица 1.5.1). Отобранные "незаконные" гибриды скрещивали с тестерными штаммами а и типов спаривания, ауксотрофными по гистидину (2Г-П2345 и 78А-П2345). По способности "незаконных" гибридов скрещиваться с тестерными штаммами определяли тип спаривания или некопулирующий (n/m) (рисунок 10 А). Долю гибридов каждого класса определяли как отношение числа гибридов данного класса к общему числу проверенных "незаконных" гибридов. Частоту гибридов каждого класса определяли перемножением общей частоты "незаконной" гибридизации на долю данного класса.
"Незаконных" цитодуктантов также распределяли по классам в соответствии с их типом спаривания. Отобранных цитодуктантов скрещивали с тестерными штаммами а и типов спаривания, ауксотрофными по гистидину (2Г-П2345 и 78А-П2345). По способности цитодуктантов образовывать гибриды с тестерными штаммами определяли тип спаривания цитодуктантов а, или некопулирующий (n/m). Класс цитодуктантов, имеющих а тип спаривания гетерогенен и включает в себя как цитодуктантов, у которых произошло истинное переключение типа спаривания а (например, за счет перемещения кассеты) так и цитодуктантов, обладающих Alf-фенотипом, который проявляется как рецессивный тип спаривания а (a ). Для определения Alf-фенотипа цитодуктантов а типа спаривания скрещивали со штаммом 2A-P143. Затем проверяли тип спаривания полученных гибридов по их способности скрещиваться с тестерными штаммами 2Г-П2345 и 78А-П2345. Если гибрид от скрещивания цитодуктанта а типа спаривания и штамма 2A-P143 сохранял способность скрещиваться с тестерным штаммом а типа спаривания, то цитодуктант, от которого был получен данный гибрид, имел тип спаривания рецессивный а (а ). В том случае, когда гибриды исследуемого цитодуктанта и штамма 2A-P143 теряли способность скрещиваться с тестерными штаммами обоих (а и ) типов спаривания, исходного цитодуктанта относили к классу цитодуктантов, имеющих истинный тип спаривания а (рисунок 10 Б). Долю классов цитодуктантов определяли как отношение числа цитодуктантов каждого класса (а, , n/m и а ) к общему числу проверенных цитодуктантов. Частоту каждого класса цитодуктантов определяли как произведение доли класса на общую частоту "незаконной" цитодукции.
Влияние 6-N-гидроксиламинопурина на частоту наследуемых и ненаследуемых повреждений ДНК
Мы полагаем, что отсутствие индукции "незаконной" гибридизации и наличие ожидаемого эффекта в тесте на "незаконную" цитодукцию связано с тем, что в тесте на "незаконную" гибридизацию основную долю учитываемых событий составляют хромосомные нарушения, частота которых не возрастает у мутантов oggl, но, вероятно, маскирует небольшое возрастание частоты более редкого класса "мутации и временные повреждения". Поскольку мутация oggl является относительно слабым мутатором, ее эффект удалось зафиксировать в тесте на "незаконную" цитодукцию, в котором из учета исключены такие генетические события, как потеря хромосомы III, ее правого плеча и рекомбинация. Различия эффектов двух аналогов оснований ГАП и 8-ОГ, наблюдаемые в альфа-тесте, могут быть связаны еще и с их различной способностью индуцировать репарацию. На фоне отсутствия ДНК-гликозилазы, контролирующей основной путь репарации ДНК с 8-ОГ, эндогенный 8-ОГ может устраняться посредством белков эксцизионной репарации нуклеотидов и репарации ДНК с неспаренными основаниями. В последнем случае комплекс белков Msh2/Msh6/Mlh1 вырезает аденин, неправильно подставленный напротив 8-ОГ ДНК-полимеразой или ДНК-полимеразой [153, 155]. В отличие от 8-ОГ, ни одна из систем репарации не узнает ГАП у дрожжей [148], что также может сказываться на разнице в индукции частоты "незаконной" гибридизации и цитодукции двумя аналогами оснований 8-ОГ и ГАП. В связи с этим требует объяснения механизм устранения первичного повреждения, индуцированного включением ГАП в ДНК, и возникновения "незаконных" цитодуктантов типа спаривания без привлечения систем репарации. Это легко представить, имея в виду то, что ГАП не блокирует матричный синтез ДНК, а лишь вызывает замены оснований, поскольку он может образовывать пары не только с тимином, но и с цитозином. При инкубации клеток дрожжей на среде с ГАП, он включается в ДНК. Если ГАП появляется в локусе МАТа, это может привести к временному переключению типа спаривания и формированию "незаконного" гибрида или цитодуктанта. После скрещивания дрожжевых клеток ГАП больше не встраивается в ДНК, поскольку он отсутствует в среде для отбора «незаконных» гибридов и цитодуктантов. Таким образом, количество клеток с ГАП в ДНК уменьшается с каждым делением. При делении клетки, возникшей в результате "незаконного" скрещивания и содержащей ГАП в ДНК, появляются две дочерние клетки: одна из них содержит ГАП в ДНК, а вторая получает аллель, возникшую при репликации на матрице с ГАП, которая может быть либо мутантной, либо исходной в зависимости от того, какой нуклеотид был подставлен при репликации напротив ГАП. В случае с ГАП не происходит того, что принято называть репарацией, т.е. никакие системы не вырезают повреждение с последующим восстановлением исходной последовательности ДНК. Восстановление структуры ДНК происходит при переходе от родительской к дочерней клетке. В данном случае устранение повреждения растянуто на 2-3 клеточных деления, и также как при репарации, его точность определяется неоднозначностью матричного синтеза ДНК на поврежденной матрице.
Таким образом, в данной работе мы показали, что модификации оснований, индуцированные аналогами оснований ГАП и 8-ОГ, повышают частоту временных повреждений, учитываемых в альфа-тесте (рисунок 15, рисунок 18), что свидетельствует о том, что модификации оснований могут самостоятельно проявляться фенопипически. При этом большая доля первичных повреждений, индуцированных аналогами оснований, учитывается в альфа-тесте как временные повреждения, а оставшаяся часть первичных повреждений в ходе нетождественной репарации превращается в точечные мутации (приложение А-Д). Наши результаты согласуются с литературными данными о том, что ГАП и 8-ОГ индуцируют точечные мутации [150, 153].
Влияние инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями на частоту наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала, выявляемых в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукции Для определения возможности фенотипического проявления неспаренностей оснований мы изучили в альфа-тесте эффект инактивации гена PMS1, кодирующего один из основных белков системы репарации ДНК с неспаренными основаниями (MMR – mismatch repair).
Система репарации ДНК с неспаренными основаниями играет ключевую роль в поддержании стабильности генома. Субстратом белков MMR являются неканонические пары между нормальными или модифицированными основаниями. MMR работает в поздней S и ранней стадий G1. Главным образом неканонические пары оснований возникают в результате ошибок репликации, когда ДНК-полимераза ошибочно подставляет неправильные нуклеотиды. Кроме того, неспаренности могут появляться и в ходе метилирования, окислительных повреждений ДНК и рекомбинации [156]. Белки MMR узнают неспаренности и вырезают участок вновь синтезированной цепи ДНК, несущий неспаренность. Образовавшуюся однонитевую брешь застраивает репликативная ДНК-полимераза. Принципиальное отличие MMR от других систем репарации состоит в том, что в ходе MMR происходит репарация новой цепи по той цепи ДНК, которая служила матрицей в ходе репликации. Репарация ДНК с неспаренными основаниями высоко консервативная система, MMR была описана как у прокариот, так и у эукариот. У E.coli репарацию ДНК с неспаренными основаниями осуществляют три белка-гомодимера MutS, MutL и MutH [157]. У S. cerevisiae обнаружено 6 гомологов MutS, кодируемых генами MSH1-MSH6 и 4 гомолога MutL, кодируемых генами MLH1-MLH3 и PMS1 [157]. Первым гомологом MutL, идентифицированным у дрожжей, стал Pmsl. Его название отражает тот факт, что у мутантов pmsl повышен уровень пост-мейтотической сегрегации [157]. У дрожжей белок, кодируемый геном PMS1, является компонентом гетеродимера MutLoc (Mlhl-Pms1), который играет ключевую роль в осуществлении репарации ДНК с неспаренными основаниями. Этот комплекс вносит разрез с 3 или 5 стороны от неспаренного нуклеотида на вновь синтезированной цепи ДНК. Этот участок ДНК вырезает экзонуклеаза Exo1, совместно с репликативным белком А. Однонитевую брешь застраивает ДНК-полимераза и лигирует ДНК-лигаза 1 [156]. У мутантов по гену PMS1 происходит накопление неспаренностей оснований в ДНК и как следствие повышение частоты замен нуклеотидов.
Мы показали, что в тесте на "незаконную" гибридизацию делеция гена PMS1 повышает общую частоту "незаконной" гибридизации в 4 раза и индуцирует потерю хромосомы III, ее правого плеча, совместно учитываемых генных мутаций и временных повреждений, рекомбинацию, и не влияет на частоту конверсии (рисунок 19) (приложение Ж).
Особенности устранения различных типов первичных повреждений в ходе клеточного цикла
Модификации оснований устраняют белки эксцизионной репарации оснований на стадии G1. Репарацию ДНК с повреждениями, индуцированными УФ-излучением, главным образом осуществляет эксцизионная репарация нуклеотидов на стадии G1. Белки эксцизионной репарации нуклеотидов активны не только на стадии G1, но и совместно с белками гомологичной рекомбинации участвуют в устранении двунитевых разрывов при репликации. Неспаренности оснований, делеции или инсерции длиной в несколько нуклеотидов, возникшие при репликации, устраняет система репарации ДНК с неспаренными основаниями. Если повреждение по каким-то причинам не устраняется на стадии G1 и сохраняется в ДНК до стадии S, то оно может блокировать репликацию. Тем не менее, не все первичные повреждения блокируют матричные процессы. Например, модификации оснований не вызывают остановку репликации или транскрипции и могут существовать в клетке несколько клеточных циклов, а для их превращения в мутацию необходимо 2 или 3 раунда репликации [150, 155]. Для аналогов оснований показано, что основные репликационные ДНК полимеразы Pol и Pol в ходе синтеза ДНК могут подставлять ГАП вместо аденина или реже вместо гуанина, при этом 3 - 5 экзонуклеазная активность этих ДНК-полимераз может исправлять несоответствие оснований, вызванное встраиванием ГАП [214]. ДНК-полимераза Pol может осуществлять синтез на матрице, содержащей 8-ОГ, подставляя аденин напротив 8-ОГ, но не очень эффективно [153, 215]. Благодаря скоординированной работе ДНК-полимераз Pol и Pol , которая осуществляет синтез в обход повреждений, повышается эффективность этого процесса [199]. 8-ОГ может точно и эффективно обходить ДНК-полимераза Pol , которая в отличие от репликативных ДНК-полимераз подставляет цитозин напротив этого повреждения [134]. Это позволяет модификациям оснований сохраняться в клетке несколько клеточных циклов еще до их превращения в мутации.
Для того, чтобы проследить судьбу первичных повреждений от момента их возникновения до устранения системами репарации в зависимости от стадии клеточного цикла, незаменимым инструментом оказался альфа-тест. Это возможно не только потому, что с помощью альфа-теста можно фиксировать самостоятельное фенотипическое проявление первичных повреждений, но и вследствие тесной связи генетического контроля типа спаривания у дрожжей с клеточным циклом. Кроме того, нам удалось существенно увеличить разрешающую способность альфа-теста при переходе на использование культур, заблокированных на стадии G1, исключительно на которой возможна гибридизация дрожжевых клеток. Однако прежде чем переходить к анализу результатов, полученных с использованием заблокированных на стадии G1 дрожжевых культур, важно понять, сколько времени необходимо клеткам гетероталличных дрожжей для переключения типа спаривания - а на уровне фенотипа. Согласно литературным данным, в норме при транспозиции кассеты в локус МАТ и замещении МАТа на МАТa у гомоталличных дрожжей переключение типа спаривания происходит достаточно быстро, за один клеточный цикл [97]. При этом в клетке, переключившей тип спаривания с на a, должно одновременно происходить быстрое отключение экспрессии STE3, кодирующего рецептор для а-фактора, прекращаться синтез -фактора, а также запускаться экспрессия STE2, кодирующего рецептор для -фактора, и синтезироваться а-фактор [97]. Мы показали, что клеткам гетероталличных дрожжей при переключении типа спаривания — а не нужно проходить полный клеточный цикл для избавления от продуктов, специфичных для клеток типа спаривания, и они могут скрещиваться на той же стадии G1, на которой произошло это переключение типа спаривания. Это заключение следует из данных о том, что клетки с мутацией cdc28-4, заблокированные на стадии G1 при температуре 37оС, не могут перейти на следующую стадию клеточного цикла, но они переключают свой тип спаривания, вследствие нарушения экспрессия МАТ, и на той же стадии вступают в скрещивание, частоту которого мы оценили в тестах на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию.
Для анализа данных, полученных с помощью альфа-теста, важно также ответить на вопрос о том, не препятствуют ли такие существенные нарушения в локусе МАТа, как разрывы, протяженные делеции или даже потеря плеча или целой хромосомы III скрещиванию дрожжевых клеток. Мы попытались ответить на этот вопрос, изучив в альфа-тесте генетическую активность камптотецина и эффект индукции транскрипции в центромере хромосомы III. Камптотецин существенно индуцирует частоту наследуемых изменений генетического материала, в том числе, потерь хромосом III (рисунок 26), а также первичных повреждений (рисунок 27). Наши данные о том, что потеря хромосомы III не препятствует скрещиванию клеток дрожжей, а, наоборот, существенно стимулирует образование "незаконных" гибридов (рисунок 29), важны для понимания того, когда двунитевые разрывы, индуцированные камптотецином, инициируют потерю хромосомы III (до или после скрещивания) и могут ли двунитевые разрывы проявляться фенотипически. Клетки дрожжей могут скрещиваться только в стадии G1 [83, 85]. Основное воздействие камптотецин оказывает в стадии S, вызывая появление двунитевых разрывов при нарушении работы топоизомеразы I в ходе репликации [161, 162]. Ранее в нашей лаборатории при исследовании эффекта камптотецина в альфа-тесте на фоне инактивации гомологичной рекомбинации, было показано, что штаммы с мутацией rad52 не способны расти на среде с камптотецином, а также камптотецин не индуцирует "незаконную" гибридизацию у этих штаммов (А. А. Ширяева, личное сообщение). Это происходит потому, что двунитевые разрывы, индуцированные камптотецином, в стадии S в отсутствии гомологичной рекомбинации остаются не устраненными, клетки останавливаются и не могут перейти в следующую стадию, и, следовательно, не могут достичь стадии G1, где они могли бы вступить в копуляцию, и таким образом выжить. Из этих данных следует, что двунитевые разрывы, индуцированные камптотецином на стадии S, к стадии G1, когда возможно скрещивание дрожжевых клеток, в ходе нетождественной рекомбинационной репарации превращаются в генные мутации или инициируют потерю хромосомы III, ее правого плеча, генную конверсию и рекомбинацию. Поэтому при воздействии камптотецином переключение типа спаривания в основном происходит уже после завершения репарации ДНК с двунитевыми разрывами и закрепления первичных повреждений в форме наследуемых изменений. Тем не менее, под действием камптотецина мы зафиксировали увеличение частоты "незаконной" цитодукции, которое происходит за счет класса временных повреждений (рисунок 27). Именно этот класс отражает долю тех первичных повреждений, которые успели проявиться фенотипически еще до момента репарации ДНК с этим повреждением, т.е. привели к переключению типа спаривания и формированию "незаконного" гибрида или цитодуктанта. Эти данные указывают на то, что в тесте на "незаконную" цитодукцию какая-то часть двунитевых разрывов успевает проявиться фенотипически еще до их устранения системой рекомбинационной репарации на стадии S/G2. Мы предполагаем, что индукция частоты временных повреждений в тесте на "незаконную" цитодукцию происходит за счет тех двунитевых разрывов, которые возникают на стадии G1, например, при блокировании камптотецином топоизомеразы I, которая участвует не только в репликации, но и в транскрипции и структурной реорганизации хроматина [164, 216, 217]. Показано, что топоизомеразы I и II, контролируя суперспирализацию ДНК, участвуют во всех стадиях транскрипции: инициации, элонгации и терминации. У эукариотических клеток транскрипция затруднена тем, что ДНК упакована в нуклеосомы и в ходе элонгации происходит суперспирализация, возникающая при расплетании двойной цепи ДНК. Для того чтобы РНК-полимеразы не останавливались, топоизомераза I осуществляет релаксацию путем внесения однонитевого разрыва в ДНК. В ходе инициации Top1 убирает негативные спирали, способствуя разборке нуклеосомы. При элонгации совместно Top1 и Top2 снижают спиральное напряжение индуцированное активностью