Введение к работе
Актуальность темы. В современных условиях нарастания генотоксиче-ских факторов среды возрастает актуальность проблем мутагенеза. Одним из последствий воздействия таких факторов на клетки являются аберрации (структурные мутации или перестройки) хромосом. Они играют важную роль в эволюции эукариотических организмов и репродуктивной гибели клеток, могут быть одной из причин наследственных болезней и канцерогенеза у человека. Аберрации хромосом широко используются для оценки генетического риска различных мутагенных факторов среды (Бочков, Чеботарев, 1989; Шевченко, 1995). Вместе с тем механизмы их возникновения изучены недостаточно.
Общепризнано, что мутагены вызывают потенциальные повреждения (ПП), которые в условиях активного метаболизма превращаются в структурные аберрации. Важную роль при этом играют процессы репликации и репарации ДНК (Дубинин, 1994; Kimball et all, 1959; Bender et al., 1974; Akifyev, 1995). Однако неясно, влияют ли репликация и репарация на промежуточные превращения ПП или на окончательную реализацию их в мутации. Одно из решений этого вопроса связано с установлением периода необратимой реализации (фиксации) аберраций в митотическом цикле.
В работах Л.И.Лебедевой и В.Л.Чубыкина (1975, 1983) было показано, что существуют два механизма фиксации аберраций, один из которых действует в интерфазе (он характерен для спонтанного мутагенеза), а другой -при митозе (он характерен для индуцированного мутагенеза). В частности, реализация подавляющего числа радиационно-индуцированных аберраций происходит в митозе.
Представление о важной роли митоза в реализации радиационно-индуцированных аберраций является новым. Имея в виду дальнейшую разработку экспериментально-теоретической модели хромосомного мутагенеза, мы продолжили изучение динамики необратимого образования перестроек хромосом в митотическом цикле.
Цель и задачи исследования. Основой для постановки исследования явилась гипотеза Л.И.Лебедевой и В.Л.Чубыкина (1975) о существовании двух классов перестроек хромосом, различающихся стадией реализации в клеточном цикле. Целью данной работы было дальнейшее изучение закономерностей реализации двух классов перестроек хромосом при спонтанном и индуцированном мутагенезе. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Изучить динамику реализации радиационно-индуцированных ПП в аберрации хромосом во время митоза и выяснить, с какими специфическими процессами митоза сопряжена реализация аберраций.
-
Выяснить, влияет ли применяемая в цитогенетической практике колхицино-во-гипотоническая обработка на реализацию аберраций в митозе.
-
Используя представления о реализации ПП в аберрации хромосом во время митоза, изучить динамику репарации радиационно-индуцированных ПП в зависимости от дозы и времени после облучения.
-
Изучить влияние клеточного осциллятора на реализацию аберраций в митозе и в интерфазе.
-
Изучить кластогенный эффект применяемых в микрохирургии глаза импульсных УФ-эксимерных лазерных излучений с длинами волн 248 нм, 223 нм и 193 нм.
Научная новизна. Впервые показано увеличение частоты радиационно-индуцированных перестроек хромосом по мере разъединения сестринских хроматид в митозе.
Впервые изучено влияние ингибиторов топоизомеразы II: кофеина (в больших концентрациях) и налидиксовой кислоты, - на реализацию структурных аберраций хромосом в митозе. Высказано предположение об участии топоизомеразы II в реализации структурных аберраций.
Впервые показано, что колхициново-гипотоническая обработка клеток в метафазе приводит к изменению спектра аберраций: увеличению частоты разрывов и уменьшению частоты обменов хромосом.
Впервые цитогенетическими методами изучена динамика репарации ПП в. зависимости от дозы и времени после облучения. Показано, что ионизирующие излучения вызывают два типа ПП, различающиеся скоростью репарации. Определено соотношение между частотами двух типов ПП в зависимости от дозы и времени после облучения. Полученные данные использованы для возможного объяснения немонотонной зависимости частоты аберраций от дозы облучения.
Впервые показано, что при радиационно-индуцированном мутагенезе возникновение разрывов хромосом в интерфазе сопряжено с активацией ос-цилляторного процесса блокирования клеток в G2 периоде. Поскольку разрывы хромосом в интерфазе характерны для спонтанного мутагенеза, высказано
предположение, что их возникновение тоже связано с функционированием клеточного осциллятора.
Впервые изучены цитогенетические эффекты УФ-эксимерных лазерных излучений на роговицу глаза млекопитающих (мыши). Показано кратковременное и относительно небольшое увеличение частоты разрывов хромосом в интерфазе в роговице облученного глаза, не выходящее за пределы индивидуальных колебаний частоты спонтанных разрывов хромосом.
Практическая ценность. На примере эффектов ионизирующих и лазерных УФ-излучений с длинами волн 248, 223 и 193 нм показано, что дифференциальный анализ двух классов структурных аберраций хромосом увеличивает разрешающую способность цитогенетических методов при генетическом мониторинге и скрининге факторов среды на мутагенную активность. Результаты исследования были использованы при клинических испытаниях разработанной в Институте теплофизики СО РАН офтальмологической установки на основе эксимерного лазера. Методы исследования могут быть рекомендованы для изучения мутагенной активности также других факторов.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всесоюзном рабочем совещании "Механизмы радиационного мутагенеза", Москва, 1988; на 1 Всесоюзном радиобиологическом съезде, Москва, 1989; представлены тезисами на научной конференции "Актуальные проблемы радиационной биологии и радиационной генетики", Обнинск, 1990; на 2 Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз", Москва, 1995. Материалы диссертации докладывались на отчетных научных сессиях ИЦиГ, Новосибирск, 1986, 1991, 1996.
Публикации. Приведенные в диссертации результаты изложены в десяти публикациях; шести научных статьях, трех тезисах докладов и одном препринте.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, пяти глав, включающих результаты и обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 19 рисунков.