Введение к работе
Актуальность темы. К настоящему времени известно, что рІЧІК—гены человека локализованы в ядрышкообразующих районах коротких плеч 5-ти пар акроцентрических хромосом: 13, 14, 15, 21, 22. С введением п 70-х голах в цитогспетичсскую практику метода окраски ядрышкообразующих районов серебром (Ag-метод), возникла возможность изучения экспрессии рибосомных генов непосредственно на хромосомных препаратах (Bloom, Goodpasture, 1976; Howell, Black, 1980). Было показано, что характер серебрения ЯОР зависит не только от наличия рибосомных генов на хромосоме, но и от их функционального состояния, и, что только транскрипцнонно активные в предшествующей интерфазе блоки генов окрашиваются серебром (Miller et al., 1976: Pathak, Elder, 1980; Harlung et al., 1983). Разработаны подходы н охарактеризованы различия индивидов по количеству транскрипцнонно активных рибосомных генов в ЯОР (Мхйтарова и др., 1988; Ляпунова и др., 1988). Часть копий гена рРНК находится в репрессированном состоянии. Их выявление может быть осуществлено путем сопоставления относительного числа генов рРНК в каждом ЯОР (гибридизация in situ с зондом рДНК) с размером Ag-ЯОР тех же хромосом данного индивида. Однако, лишь в единичных случаях сделаны попытки выявления репрессированных копий гена в индивидуальных ЯОР (Taniravahi et al., 1981; Мхйтарова и др., 1988; Garkavtsev et al., 1988). Существующие данные не дают представления о разнообразии геномов по наличию репрессированных генов рРНК в отдельных ЯОР и геноме в целом. Не ясно, могут ли репрессированные копии гена рРНК быть реактивированы в измененных условиях функционирования клетки. А именно эти признаки генома могут быть особенно важными для адаптивных способностей организма при изменениях факторов внутренней и внешней природы.
В последние годы появилась тенденция использовать цнтогенетическин показатель— участие пкроцентричеАнх хромосом (АХ) в ассоциациях (АсА.Х) — для диагностических и прогностических целей при острых заболеваниях, затрагивающих иммунную систему (Фролов, 1985; 1989) и при развитии опухолей (Miller et al., 1978; Pedrazzini and Slavutsky, 1991). Известно, что способность AX вступать в ассоциации так же, как интенсивность серебрения их ЯОР, отражает функциональное состояние ЯОР. Показана связь между этими параметрами (Warburton et al., 1976; Miller etal., 1977; de Capoa et al., I97S). Показано также, что ассоциативный индекс (AID, определяемый кик процент мета-фаз с АсАХ, Ьілвисит от длительности интерфазы и/или скорости пролиферации клеток (Жданова, Дерягин, 1974; Sigmund, 1979; Созанский 1983; Фролов, 1985). Наряду с этим, в ряде работ на основе снижения АИ в клетках под воздействием облучения или химических мутагенов делается вывод о Повреж-
дении ЯОР и снижении уровня транскрипции рибосомных генов (Kirsch-Volders et al., 1978; Hens, 1978; Verschaeve el al., 1979; di Lernia et al., 1981; 1982). В связи с этим, важной задачей является выяснение вопроса — действительно ли снижение АИ сопровождается уменьшением активности ЯОР.
Все вышесказанное определило цель и задачи предлагаемого исследования.
Цель'и задачи исследования. Целью настоящего исследования было выделение морфо-функционалышх вариантов ядрышкообразующих районов хромосом человека на основе сравнительного анализа представленности активных и неактивных копий генов рРНК в ЯОР с помощью цитогснстичсских методов исследования; изучение встречаемости вариантов ЯОР в разных парах акро-центрических хромосом и в хромосомных наборах разных индивидов; изучение некоторых функциональных свойств вариантов ЯОР человека.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
-
Изучить Ag—варианты ЯОР с одновременной идентификацией хромосом в выборке кариотипически нормальных индивидов.
-
Провести сравнительную оценку количества копий гена рРНК (интенсивность гибридизации с рДНК) в ЯОР тех же индивидов.
-
Оценить частоту встречаемости в популяции генетически нормальных индивидов вариантов ЯОР, содержащих заметное количество "молчащих" генов рРНК. і
-
Провести сравнительный анализ показателей ассоциативных способностей акроцентрических хромосом и интенсивности их окраски серебром (размер Ag-ЯОР), выявить степень взаимосвязи между этими признаками.
-
Осуществить попытку реактизнрования "молчащих" генов рРНК в клетках индивидов, имеющих ЯОР с запасными копиями гена.
Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые выделены 4 морфо-функциональных варианта ЯОР, различающихся по присутствию копий рибосомного гена и относительному количеству активных и неактивных копий. Охарактеризованы межиндивидуальные различия по встречаемости разных вариантов ЯОР. Обнаружена неравномерность их межхромосомного распределения: выявлена высокая частота хромосомы 15 с полным отсутствием копий гена рРНК; показано, что ЯОР хромосомы 21 существенно чаще других имеют запасные копии рибосомного гена. Впервые осуществлена верификация разделения гомологов в парах акроцентрических хромосом после Ag-окраски на основе сравнения методом хи-квадрат теоретических и эмпирических частот парных событий. На основе использования культур клеток индивидов, для которых охарактеризованы свойства всех 10 ЯОР, впервые предложен цитогене-, тический метод, позволяющий изучать модификацию активности генов рРНК. Подтвердив тот факт, что вероятность участия акроцентрической хромосомы в ассоциации коррелирует с размером расположенного на ней Ag-ЯОР, мы пока-
зали, что снижение ассоциативного индекса, сопровождающее укорочение интерфазы, не связано с уменьшением транскрипции генов рРНК и ЯОР.
Практическая ценность работы. Предложенный в работе цнтогенетнческин подход для описания комплекса рибосомных генов в индивидуальных ЯОР и в геноме в целом позволяет: (а) характеризовать геномы отдельных индивидов по набору генов рРНК, что может быть важным для оценки адаптивных возможностей организма; (б) проводить сравнение геномов по этим признакам у индивидов в пределах популяции, в разных популяциях в связи с условиями существования и пр. Это предоставляет новые возможности дня популяцнон-ной генетики человека. Выявленная особенность ЯОР хромосом 21 пары (высокая частота хромосом с запасными копиями гена рРНК) может быть использована для поиска новых возможностей объяснения причин нерасхождения хромосом 21 пары, приводящей к появлению трисомии 21 (синдром Дауна). Предложенная экспериментальная модель для изучения регуляции активности рибосомных генов открывает неограниченные возможности для выявления факторов, способных модифицировать работу генов рРНК. Установление того факта, что снижение частоты участия акроцентрических хромосом в ассоциациях не сопровождается уменьшением активности генов рРНК в ЯОР, позволит более корректно использовать ассоциативные признаки хромосом в диагностических и прогностических целях.
Основные положения, выдвигаемые на зашиту:
-
Функциональные варианты ЯОР хромосом человека полиморфны по присутствию копий рибосомного гена и относительному количеству активных и неактивных копий гена. Могут быть выделены 4 морфо-функциональных варианта ЯОР.
-
Наборы ядрышкообразующих районов хромосом разных индивидов различаются по присутствию 4-х морфо—функциональных вариантов ЯОР.
-
Существуют различия в межхромосомном распределении вариантов ЯОР.
-
Ассоциативный индекс отражает общее количество активных генов рРНК в геноме, но только в том случае, если анализируются быстро пролифериру-ющие клетки. При этом частота участия в ассоциациях данного ЯОР пропорциональна размеру его Ag-ЯОР.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на II Всесоюзной конференции "Геном человека" (Переславль-Залесскнн, 1991); на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С.Петербург, 19п1); на 26 ежегодной конференции Европейского общества генетиков человека (Париж, 1994); на объединенном научном семинаре Института генетики человека МГНЦ РАМН (1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных ре-