Цитогенетические и физиологические эффекты гамма-излучения и импульсно-периодического рентгеновского излучения в соматических клетках человека Беленко Андрей Александрович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 16

1.1 Воздействие ионизирующего излучения на генетический материал клетки 16

1.2 Действие импульсно-периодического рентгеновского излучения (ИПРИ) на биологические объекты 20

1.3 Ионизирующее излучение и индивидуальная радиочувствительность 22

1.3.1 Биомаркеры радиационного воздействия 26

1.3.1.1 Анализ фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК 28

1.3.1.2 Микроядерный тест 39

ГЛАВА 2. Материалы и методы 45

2.1 Материалы 45

2.2 Дизайн исследования 46

2.2.1 Схемы проведения экспериментов 50

2.2.1.1 Анализ генотоксического действия наносекундного ИПРИ на лимфоциты периферической крови человека и опухолевые клетки MOLT-4 50

2.2.1.2 Оценка цитогенетических эффектов ИПРИ в малых дозах с использованием микроядерного теста 50

2.2.1.3 Анализ влияния мощности дозы ИПРИ на биологический эффект 51

2.2.1.4 Анализ влияния окислительного стресса на эффективность репарации ДНК в лимфоцитах человека после воздействия ИПРИ 52

2.2.1.5 Анализу зависимости цитогенетических эффектов от типа излучения (наносекундное ИПРИ и непрерывное гамма-излучение) 52

2.2.1.6 Анализ генотоксического действия гамма-излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в лимфоцитах периферической крови человека 52

2.2.1.7 Анализ генотоксического действия гамма-излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в экспраэмбриональных фибробластах мезодерны 53

2.2.2 Облучение материала 53

2.3 Методы 54

2.3.1 Получение и культивирование материала 54

2.3.1.1 Получение и выделение лимфоцитов из периферической крови человека 54

2.3.1.2 Получение и культивирование опухолевых клеток человека MOLT-4 55

2.3.1.3 Получение и культивирование первичных экстраэмбриональных фибробластов человека 55

2.3.2 Фиксация материала 56

2.3.2.1 Фиксация лимфоцитов периферической крови человека для анализа фокусов белков репарации ДНК (H2AX и 53ВР1) 56

2.3.2.2 Фиксация клеток опухолевой линии MOLT-4 для анализа фокусов белков репарации ДНК (H2AX и 53ВР1) 57

2.3.2.3 Фиксация первичных экстраэмбриональных фибробластов человека для анализа фокусов белков репарации ДНК (H2AX)

2.2.3 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов 57

2.3.3 Получение изображений и оценка фокусов белков репарации ДНК H2AX 58

2.3.4 Приготовление препаратов двухъядерных цитокинез-блокированных соматических клеток человека для анализа микроядер 59

2.3.5 Получение центромеро-специфичных ДНК-зондов и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 59

2.3.6 Методика анализа экспрессионных профилей генов в лимфоцитах инидивидов, дифференцированных по чувствительности к действию радиации

2.3.7.1 Выделение РНК 61

2.3.7.2 Очистка РНК 61

2.3.7.3 Проверка качества РНК 62

2.3.7.4 Введение флуоресцентной метки в образец РНК 63

2.3.7.5 Очистка флуоресцентно-меченных образцов РНК 63

2.3.7.6 Гибридизация меченых образцов РНК на микрочипах 64

2.3.7.7 Оценка экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени 64

2.3.8 Статистический анализ данных 65

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 67

3.1 Анализ генотоксического действия наносекундного импульсно-периодического

рентгеновского излучения в дозах до 320 мГр в соматических клетках человека 67

3.1.1 Влияние малых доз ИПРИ на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови 69

3.1.2 Влияние малых доз ИПРИ на опухолевые клетки линии MOLT-4 72

3.1.3 Оценка частоты цитогенетических повреждений в лимфоцитах периферической крови человека после воздействия ИПРИ в дозах до 100 мГр 78

3.1.4 Анализ зависимости уровня фокусов репарации ДНК в лимфоцитах человека от мощности дозы ИПРИ 81

3.1.5 Анализ зависимости гиперчувствительности к малым дозам ИПРИ от окислительно-восстановительного гомеостаза лимфоцитов периферической крови 84

3.1.6 Сравнительный анализ действия наносекундного ИПРИ и стандартного гамма-излучения 60Со на лимфоциты периферической крови человека в дозах 0,5-2,0 Гр 90

3.2 Оценка индивидуальной радиочувствительности 94

3.2.1 Влияние спонтанного уровня фокусов H2AX на радиационно-индуцированный

ответ соматических клеток человека поле оюлучениея 2,0 Гр гамма-излучения 94

3.2.1.1 Оценка связи спонтанного уровня фокусов H2AX с частотой радиационно-индуцированных микроядер в лимфоцитах человека 95

3.2.1.2 Анализ зависимости цитогенетических эффектов ИИ от спонтанного уровня H2AX в фибробластах экстраэмбриональной мезодермы абортусов человека 101

3.2.2 Анализ профилей экспрессии генов радиационного ответа в группах индивидов с повышенной и пониженной чувствительностью к ионизирующему излучению 105

3.2.2.1 Оценка радиационно-индуцированного уровня экспрессии генов между группами индивидов с различной радиочувствительностью 106

3.2.2.2 Оценка статистической значимости наблюдаемых различий экспрессионных профилей в исследуемых группах без поправки FDR 108

3.2.2.3 Анализ профилей экспрессии генов, представленных несколькими олигонуклеотидными пробами на микрочипе 109

3.2.2.4 Функциональная аннотация генов связанных с индивидуальной радиочувствительностью 112

3.2.2.5 Анализ профилей экспресии генов методом ПЦР в реальном времени 118

3.3 Общая характеристика генов, выявленных при анализе уровня экспрессии в

лимфоцитах «радиочувствительных» и «радиорезистентных» индивидов 120

3.3.1 Гены, ассоциированные с различной чувствительностью к действию ионизирующего излучения 120

3.3.2 Гены, кодирующие белки комплекса репарации ДНК 121

3.3.3 Гены, ассоциированные с развитием апоптоза и аутофагии 122

3.3.4 Гены, кодирующие белки клеточного ответа на повреждающее действие ДНК124

3.3.5 Гены некодирующих РНК 125

3.3.6 Гены с иными функциями, экспрессия которых значимо различалась между исследуемыми группами индивидов 126

Заключение 130

Выводы 136

Список литературы 137

• Ионизирующее излучение и индивидуальная радиочувствительность
• Анализ генотоксического действия гамма-излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в экспраэмбриональных фибробластах мезодерны
• Методика анализа экспрессионных профилей генов в лимфоцитах инидивидов, дифференцированных по чувствительности к действию радиации
• Оценка статистической значимости наблюдаемых различий экспрессионных профилей в исследуемых группах без поправки FDR

Введение к работе

Актуальность проблемы. Повышенный радиационный фон, профессиональное облучение работников АЭС при контакте в производственных условиях с радиационным воздействием, возрастающее использование радиации в медицине и другие факторы отягощают наследственность человека и провоцируют возрастание частоты генетических и онкологических заболеваний (Голуб Е.В., 2009; Петров В.М. и др., 2009; Ильинских Н.Н. и др., 2014).

В настоящее время существует значительный перечень источников ионизирующего излучения (ИИ), использующихся в различных сферах деятельности. Относительно недавно были разработаны и уже успешно применяются в научной и производственной областях источники импульсно-периодического рентгеновского излучения (ИПРИ) (Артемов К.П., 2004; Соковнин С.Ю., 2007), которые обладают более выраженным биологическим действием по сравнению с непрерывным излучением. Подобные излучения имеют особенность, заключающуюся в том, что при высокой мощности дозы в импульсе средняя доза не выходит за рамки диапазона малых доз (200 мГр). При этом каждый из параметров облучения может вносить свою значимую роль в формирование ответной реакции биологических объектов, что определяет вариантный характер ответа на действие ИПРИ различных клеточных типов (Большаков М.А. и др., 2005; Булдаков М.А. и др., 2011; Князева И.Р. и др., 2011). В этой связи актуальность оценки роли каждого из параметров ИПРИ в формировании биологического эффекта в клетках, различающихся по физиологическому статусу (степени дифференцировки, пролиферации, состоянию систем антиоксидантной защиты), не вызывает сомнений.

Основой для расчета рисков, связанных с воздействием ионизирующего излучения на живые организмы, в настоящее время остается линейная беспороговая модель, предполагающая линейную экстраполяцию результатов, полученных в исследованиях действия высоких доз радиации, на диапазон малых доз (Cleaver J., 2005; Brenner D., Sachs R., 2006; Mossman K., 2009; Siegel J., Stabin M., 2010). Однако анализ данных мировой литературы показывает, что эффекты малых и больших доз ионизирующего излучения существенно различаются между собой (Рождественский Л.М., 1999; Fleck C., 1992; Knops K. et al., 2012). Наблюдаемые различия во многом обусловлены активацией различных сигнальных путей и механизмов клеточного ответа (Tartier L. et al., 2000; Yu H., 2012; Lall R. et al., 2014). Имеются данные об изменении профилей экспрессии генов (Amundson S. et al., 1999; Sokolov M. et al., 2007; Nosel I. et al., 2013) и белков (Kim J. et al., 1996; Ding L. et al., 2005; Yang F. et al., 2012; Zhang G. et al., 2014). В то же время, эффекты ИИ, регистрируемые в клетках после воздействия в малых дозах, до сих пор являются недостаточно изученными. В этом плане особое внимание привлекают к себе феномены, которые не находят объяснения с позиции линейной беспороговой модели, в частности феномен гиперрадиочувствительности клеток.

Возрастающее влияние ионизирующей радиации в профессиональной сфере деятельности и в медицинских учреждениях, а также появление новых источников излучения, ставит перед современной наукой новые задачи (Любимова Н.Е., Воробцова И.Е., 2008; Голуб Е.В., 2009; Прокопьева В.Д. и др. 2014; Hande M. et al., 2005; Jakob V. et al., 2005). В то же время, одной из актуальных задач, по-прежнему, остается оценка индивидуальной чувствительности организма к действию ИИ, что имеет особое значение для диагностики и лечения широко круга онкологических заболеваний (Ильинских Н.Н. и др., 2014; Pajic J. et al., 2015). На сегодняшний день решению данной проблемы посвящены многочисленные научные работы, однако полученные в них результаты носят противоречивый характер. Оценка индивидуальной чувствительности организма к действию ионизирующей радиации затруднена тем, что ее формирование обусловлено не только физиологической конституцией объекта, но и физическими параметрами самого источника излучения, длительностью и интенсивностью воздействия (Григорьев А.Ю., 1991; Дружинин В.Г. и др., 2009; Smart V. et al. 2003; Bolegenova N. et al., 2009; Fratta E. et al., 2011; Ginsberg G. et al., 2011).

Накоплен обширный материал, демонстрирующий вклад в формирование индивидуальной радиочувствительности, помимо физиологических особенностей, генетической составляющей каждого конкретного индивида. Имеются данные о зависимости феномена индивидуальной радиочувствительности от полиморфизма генов систем клеточной защиты, в том числе репарации ДНК (Гончарова И.А. и др., 2003; Дружинин В.Г. и др., 2011; Filippi A. еt. а1., 2005; Kiuru А. et al., 2005; Skjelbred С. et al., 2006). В то же время, вопрос о механизмах реализации эффектов острого и хронического действия ионизирующего излучения, в особенности на молекулярном и клеточном уровне, является открытым.

Другой проблемой изучения индивидуальной радиочувствительности является поиск специфических биомаркеров. В настоящее время оценка радиационно-индуцированных повреждений проводится с использованием различных цитогенетических методов (Сальникова Л.Е. и др., 2013; Gatti R., 2001; Borgmann К. et al., 2008). Классическим методом оценки кластогенных эффектов радиации является анализ индуцированных хромосомных аберраций и микроядер (Godderis L. et al., 2006; Fenech M., 2007). Однако особый интерес для оценки индивидуальной радиочувствительности представляет исследование уровня радиационно-индуцированных фокусов белков репарации ДНК, а именно белка H2AX (Озеров И.В., 2015; Decordier I. et al., 2010). Данный метод является перспективным, поскольку позволяет анализировать генетически-детерминированные эффекты, учитывая влияние факторов внешней и внутренней среды организма (Sedelnikova O. et al., 2008; Andreassi M., 2011; Rodriguez-Rocha H. et al., 2011). Недостаточность данных о зависимости генотоксических эффектов ИИ от активности системы репарации ДНК на момент облучения обусловливает актуальность исследований, направленных на оценку влияния спонтанного уровня фокусов H2AX на индивидуальную радиочувствительность соматических клеток человека.

Цель исследования: оценить цитогенетические эффекты наносекундного импульсно-периодического рентгеновского излучения и непрерывного гамма-излучения в соматических клетках человека с различным физиологическим статусом.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК в соматических клетках с различным репарационным потенциалом после воздействия наносекундного импульсно-периодического рентгеновского излучения в малых дозах.

2. Установить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах периферической крови в зависимости от мощности дозы наносекундного импульсно-периодического рентгеновского излучения.

3. Выявить роль окислительного стресса в индукции репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах периферической крови после воздействия наносекундного импульсно-периодического рентгеновского излучения.

4. Провести сравнительный анализ уровня фокусов H2AX, индуцированных наносекундным импульсно-периодическим и непрерывным ионизирующими излучениями в лимфоцитах периферической крови в дозах 0,5-2,0 Гр.

5. Оценить зависимость кластогенных и анеугенных радиационно-индуцированных эффектов в соматических клетках со спонтанной и индуцированной пролиферацией in vitro от активности системы репарации двунитевых разрывов ДНК.

6. С использованием полнотранскриптомного анализа выявить дифференциально экспрессирующиеся гены в лимфоцитах индивидов, различающихся по эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК, после воздействия непрерывным гамма-излучением в дозе 2,0 Гр. Научная новизна исследования: Впервые с помощью анализа

флуоресцентных фокусов белков репарации ДНК H2AX и 53BP1 установлено снижение эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК в соматических клетках человека с различным репарационным потенциалом после воздействия ИПРИ в дозах 12-72 мГр. Впервые показано, что лимфоциты периферической крови и опухолевые клетки MOLT-4 имеют дифференциальный характер клеточного ответа на действие наносекундного ИПРИ в диапазоне 12-72 мГр, который зависит от частоты повторения импульсов: минимальная эффективность репарации в лимфоцитах наблюдается после воздействия с частотой 13 имп./с, а в клетках MOLT-4 – после 8 имп./с, соответственно. Выявленное снижение эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах обусловлено влиянием мощности дозы ИПРИ и не зависит от окислительно-восстановительного статуса клеток. В сравнительном аспекте охарактеризовано генотоксическое действие наносекундного ИПРИ и непрерывного гамма-излучения в дозах до 2,0 Гр in vitro. Впервые установлена зависимость между спонтанным уровнем фокусов H2AX, активностью систем репарации и индивидуальной радиочувствительностью человека. Впервые показана обратная зависимость кластогенного эффекта радиации от

спонтанного уровня фокусов H2AX в лимфоцитах периферической крови человека после воздействия терапевтических доз гамма-излучения in vitro. Впервые определены дифференциально экспрессирующиеся гены в лимфоцитах индивидов с различным репарационным потенциалом.

Теоретическая и практическая значимость: Впервые получены данные о генотоксическом действии малых доз наносекундного ИПРИ на соматические клетки человека in vitro. Установлены особенности формирования биологического ответа клеток в зависимости от мощности дозы, дозы за один импульс и частоты повторения импульсов низкодозового ИПРИ. Показан дифференциальный характер действия малых доз ИПРИ на нормальные и опухолевые клетки человека, что открывает перспективы для разработки новых прецизионных методов лучевой терапии. Исследована зависимость формирования радиационно-индуцированного биологического ответа от физиологических особенностей клеток (окислительного статуса, пролиферативной активности, состояния систем репарации ДНК) и выявлены основные механизмы его реализации. Полученные результаты позволяют глубже понять особенности ответа клеток человека на воздействие импульсно-периодических ионизирующих излучений, что может быть использовано как в медицинских целях, так и для регламентации санитарно-гигиенических норм радиационной безопасности. Выявленная обратная зависимость частоты центромеро-негативных микроядер от спонтанного уровня фокусов H2AX дает возможность использовать уровень фокусов белка H2AX в качестве маркера индивидуальной радиочувствительности человека in vitro. На основе полученных данных о дифференциальной экспрессии генов в лимфоцитах радиочувствительных и радиорезистентных индивидов может быть сформирована панель экспрессионных маркеров для определения индивидуальной радиочувствительности. Она может найти применение как в сфере медико-генетического консультирования при профессиональном отборе индивидов для работы на радиохимических предприятиях, так и в медицине для лучевой терапии злокачественных образований.

Результаты настоящей работы могут быть использованы при чтении лекционных курсов в ВУЗах по программам «Генетика», «Экологическая физиология» «Основы безопасности жизнедеятельности».

Положения, выносимые на защиту:

7. Соматические клетки человека с различным репарационным потенциалом (лимфоциты периферической крови и клетки опухолевой линии MOLT-4) дифференцированно отвечают на импульсно-периодическое рентгеновское излучение в диапазоне малых доз 12-72 мГр, демонстрируя минимальную активность системы репарации двунитевых разрывов ДНК при частоте повторения импульсов 13 и 8 имп./с, соответственно.

8. В лимфоцитах периферической крови человека после облучения непрерывным гамма-излучением в дозе 2,0 Гр in vitro частота радиационно-индуцированных центромеро-негативных микроядер обратно пропорциональна спонтанному уровню фокусов H2AX.

3. Спонтанный и радиационно-индуцированный экспрессионные ответы

лимфоцитов периферической крови человека зависят от фонового уровня

фокусов H2AX.

Апробация работы: Результаты диссертационного исследования были обсуждены на научных конференциях и симпозиумах разного уровня, в том числе: на научных студенческих конференциях «Старт в науку» (Томск, 2010, 2013 гг.); международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011-2013 гг.); международной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Томск, 2011 г.); региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012 г.); 6-м семинаре по репарации ДНК «6^th DNA Repair Workshop» (Словакия, 2012 г.); 39-й ежегодной конференции Европейского общества по исследованию радиации (Италия, 2012 г.); 18-м Международном симпозиуме по сильноточной электронике (18-SHCE) в рамках международного конгресса «International Congress on Energy Fluxes and Radiation Effects» (Томск, 2014 г.); международной молодежной научной конференции «Современные проблемы генетики, клеточной биологии и биотехнологии» (Томск, 2014 г.); научной конференции с международным участием «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных функций в норме и патологии» (Томск, 2014 г.); региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», в рамках II форума молодых ученых U-NOVUS (Томск, 2015 г.); VII международной научной школе молодых ученых по экологической генетике «Генетическая токсикология», посвященной 150-летию открытий Г. Менделя (Санкт-Петербург, 2015 г.).

Отдельные разделы диссертационного исследования выполнены при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 14-04-31867, № 12-04-00893, № 12-04-32046), государственных контрактов ФЦП (№ 8596, № П1080, № 16.512.11.2063) и АВЦП (№ 2.1.1/13778).

Декларация личного участия автора. Автором самостоятельно выполнен анализ литературы по теме диссертации, проведено планирование исследования, экспериментальная работа, анализ, обработка, обобщение и интерпретация полученных результатов. Написание текста рукописи диссертации выполнено автором лично.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, в том числе 5 статей в журналах перечня ВАК РФ и 18 публикаций в материалах отечественных и зарубежных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 21 рисунком, 7 таблицами. Библиография включает 535 источников литературы, из которых 79 источников отечественной литературы.

Ионизирующее излучение и индивидуальная радиочувствительность

Начало исследованиям природы биологического действия ионизирующего излучения ипульсной природы было положено в работе Ponette V. с коллегами в 1996 году при использовании импульсного гамма-излучения для облучения in vitro клеток животных и человека (Ponette V. et al., 1996). С этого момента все большую актуальность стало приобретать теоретически и практически направленное изучение эффектов действия ионизирующего излучения на биологические объекты в импульсном режиме с различными параметрами.

К настоящему времени разработаны генераторы импульсно-периодического рентгеновского излучения, генерирующие импульсы длительностью от единиц до десятков наносекунд, в дозах от 10 мкГр до нескольких мГр за импульс при частотах повторения от единиц до ста импульсов в секунду и энергией квантов от единиц кэВ до сотен МэВ. Характерной особенностью такого типа излучения является то, что при высокой мощности дозы в импульсе средняя доза не выходит за рамки диапазона малых доз (разовая эквивалентная доза до 0,1 Зв (10 сЗв или 100 мЗв) или 10 бэр; поглощенная доза до 0,1 Гр (10 сГр или 100 мГр) или 10 рад.) (Артемов К.П. и др., 2004; Соковнин С.Ю., 2007). Импульсный характер излучения отличается от непрерывного порционным характером передачи энергии за определенный промежуток времени, а также сложностью взаимодействия и зависимостью каждого из отдельных параметров воздействия, что в свою очередь отражается на конечном эффекте. Биологическое действие подобного рода излучений все еще очень мало изучено. Особый интерес оно представляет тем, что его эффекты во многом определяются частотой повторения импульсов (Литвяков Н.В. и др., 2006; Большаков М.А. и др., 2007; Жаркова Л.П. и др., 2008; Булдаков М.А. и др., 2011; Князева И.Р. и др., 2011; Керея А.В. и др., 2014; Litvyakov N.V. et al., 2005).

В настоящее время, благодаря усилиям ряда ученых, получены данные об общем влиянии импульсно-периодического рентгеновского излучения на биологические объекты. Установлено, что ИПРИ влияет на различные показатели функционирования живых систем: на индивидуальное развитие дрозофилы (Большаков М.А. и др., 2001; Князева И.Р. и др., 2007), на биохимические показатели крови и печени мышей и крыс (Большаков М.А. и др., 2005; Князева И.Р. и др., 2007), на уровень ПОЛ мембран и содержание карбонилированного белка в сыворотке крови и гомогенате печени мышей, на уровень АФК в клетках печени (Князева И.Р. и др., 2007; Bolshakov М. et al., 2005), на состояние митохондрий гепатоцитов и эритроцитов (Жаркова Л.П. и др., 2010; Князева И.Р. и др., 2013). Анализ суспензии митохондрий после воздействия ИПРИ в дозе 7,2 Гр и частотами 10-22 имп./с., показал изменение активности металлосодержащих ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, а также высокую вариабельность эффекта от частоты повторения импульсов (Князева И.Р. и др., 2013). В эксперименте с облучением мышей (беспородная линия) ИПРИ с частотами 13 и 16 имп./с (при суммарных дозах за сеанс воздействия 47 и 58 мГр соответственно) было выявлено снижение общего количества клеток селезенки на 30% с последующим усилением пролиферативной активности спленоцитов на 46% (Булдаков М.А., 2009). Показано, что в сравнении с действием непрерывного излучения, клетки печени более чувствительны к импульсно-периодическому режиму воздействия (Коровин М.С., Большаков М.А., 2004). Облучение мышей ИПРИ в дозе 0,2 Гр с частотами повторения импульсов 13, 16 и 22 имп./с ведет к повышению возбудимости мозга, в то время как воздействие в дозе 1,0 Гр при аналогичных значениях частоты повторения импульсов заметно ее снижает (Керея А.В. и др., 2014). Установлено, что воздействие малых доз ИПРИ с частотами повторения импульсов в диапазоне 8-22 имп./с оказывает сильное цитостатическое действие на клетки мастоцитомы Р-815, карциномы Эрлиха и клеток HeLa in vitro и in vivo (Литвяков Н.В. и др., 2006; Булдаков М.А. и др., 2011). Однако в случае облучения in vivo, максимальный цитостатический эффект ИПРИ существенно снижается (Булдаков М.А. и др., 2011).

В то же время, для этих результатов, описывающих цитотоксический эффект ИПРИ, общим и характерным было то, что величина эффекта зависела от частоты повторения импульсов, мощности дозы, а также дозы излучения. Таким образом, становится очевидна высокая биологическая эффективность импульсно-периодического рентгеновского излучения. Однако биологические особенности воздействия ИПРИ на сегодняшний день все еще остаются крайне малоизученными. Поэтому, актуальным является вопрос о природе феномена гиперчувствительности соматических (нормальных и опухолевых) клеток человека к воздействию ИПРИ. Для ясного понимания общих закономерностей и механизмов биологического действия излучений подобного типа в формировании биологических эффектов необходимым является дальнейшее изучение действия ИПРИ в общем (доза, средняя мощность дозы), и вклад каждой из характеристик (частота повторения импульсов, мощность дозы в импульсе) излучения в отдельности. Это, в свою очередь, позволит приблизиться к пониманию механизмов большей биологической эффективности импульсно-периодических излучений по сравнению с непрерывным излучением, что чрезвычайно важно в теоретическом и практическом плане.

Оценка индивидуальной радиочувствительности человека является одной из самых сложных и наиболее актуальных задач радиационной биологии и медицинской радиологии. Возможность прогнозировать реакцию опухолевой ткани на лучевую терапию представляет огромный интерес, как с практической, так и с теоретической точки зрения (Дарьялова C.Л. и др., 1990; Саенко А.С., Замулаева И.А., 1995; Attard-Montalto S. et al., 1996; Mirjolet C. et al., 2015). Основной задачей практической радиотерапии является эффективное повреждение всех опухолевых клеток наряду с минимальным токсическим воздействием на окружающие их нормальные ткани и, как следствие, улучшение общего пострадиационного состояния пациента и качества его жизни. Однако для большинства онкобольных применимая для лечения доза ИИ, ограничена риском возникновения побочных эффектов. Эта проблема особенно актуальна в тех случаях, когда эффективность лечения ограничена высокой радиорезистентностью опухолевой ткани (Киселева Е.С., 1996; Hayabuchi N., 2004; Gerweck L. et al., 2006). Кроме того, успех лучевой терапии, равно как и тяжесть пострадиационных эффектов, помимо поглощенной тканями дозы ИИ за все время облучения, сильно зависит от области воздействия (проявляет выраженную ткане- и органоспецифичность), сопутствующих заболеваний пациентов, фракционирования дозы и многих других факторов.

Анализ генотоксического действия гамма-излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в экспраэмбриональных фибробластах мезодерны

Анализ зависимости цитогенетических эффектов от типа излучения (ИПРИ и стандартного гамма-излучения) проводили при облучении лимфоцитов периферической крови человека непрерывным гамма-излучением и наносекундным ИПРИ в дозах 0,5; 1,0 и 2,0 Гр с постоянной средней мощностью дозы 13,67 мГр/с. При воздействии на клетки ИПРИ также использовали следующие частоты повторения импульсов: 8, 13 и 25 имп./с (с мощностями дозы в импульсе 0,138; 0,263; 0,425 мГр/нс, соответственно). Временную динамику фокусов H2AX оценивали спустя 30 мин, 2 ч, 4 ч и 18 ч после облучения.

Все эксперименты по оценке генотоксических и физиологических эффектов в соматических клетках человека с использованием наносекундного ИПРИ проводили не менее чем в 3 повторностях.

Для анализа цитогенетических эффектов непрерывного -излучения суспензию лимфоцитов каждого из 54 индивидов после выделения делили на 2 части, одну из которых облучали в дозе 2,0 Гр, а вторая выступала в качестве контроля. В необлученных лимфоцитах периферической крови проводили анализ фокусов белков репарации ДНК H2AX и оценивали частоту микроядер, в то время как в облученных лимфоцитах оценивали только частоту микроядер. На основе полученных данных по анализу микроядер и фокусов H2AX были сформированы 2 группы по 3 индивида в каждой. Одну группу составили индивиды с высоким спонтанным уровнем фокусов H2AX и низкой частотой радиационно-индуцированных микроядер (относительно 2-ой группы). В другую группу вошли индивиды, у которых фоновый уровень фокусов H2AX, наоборот, был низким, а частота индуцированных гамма-излучением in vitro микроядер высокой (относительно 1-ой группы). В каждой группе индивидов проводили анализ экспрессионных профилей, результатом которого явилось выявление генов, экспрессия которых значимо отличалась между исследуемыми группами.

Фибробласты экстраэмбриональной мезодермы медицинских абортусов размораживали, вводили в культуру и наращивали до образования монослоя в соответствии со стандартными методами (Rooney D., Czepulkowski B., 1992). После достижения монослоя часть клеток подвергали воздействию гамма-излучения в дозе 1,0 Гр, другая часть клеток являлась контрольной. В облученных и необлученных культурах производили смену среды с последующей фиксацией и анализом материала. Для анализа фокусов H2AX клетки фиксировали на 2 временных точках, через 30 мин и 24 часа после облучения. Процедура фиксации клеток для анализа микроядер проводилась спустя 72 ч после облучения в соответствии со стандартным протоколом (Rooney D., Czepulkowski B., 1992).

В качестве непрерывного ионизирующего излучения было использовано излучение стационарного гамма-терапевтического аппарата Theratron Equinox (Best Theratronics, Канада) источника гамма-излучения 60Co (мощность дозы – 0,67 Гр/мин). Дозиметрию проводили с использованием спиральной компьютерной томографии (СКТ) в системе дозиметрического планирования ХiO, программы для 3D/IMRT/VMAT планирования облучения. Программа позволяет производить расчет параметров облучения как для аппаратов гамма-терапевтического излучения, так и для линейных ускорителей. Облучение проводилось на базе отделения радиологии ФГБНУ "Томского НИИ онкологии" (г. Томск). В качестве источника импульсно-периодического рентгеновского излучения нами использовалось тормозное излучение электронов сильноточного электронного пучка на аноде ускорителя Sinus 150 (ускоряющее напряжение 260 кВ, сила тока 4 кА, энергия фотонов с максимумом 90-100 кэВ, длительность импульса 4 нс). Измерения доз производили на различных расстояниях от коллектора (3-70 см) вдоль оси системы с использованием термолюминесцентного дозиметра КДТ-02М (Россия) и электростатического дозиметра с кварцевым волокном серии «Arrowech» модель 138-S (США). Облучение ИПРИ проводилось на базе Отдела физической электроники «Института сильноточной электроники» СО РАН (г. Томск).

Забор цельной крови для проведения экспериментов на лимфоцитах периферической крови в объеме 8-32 мл (в зависимости от задачи диссертационного исследования) осуществляли из локтевой вены в вакуумные пробирки типа Vacutainer (BD Bioscience, США), покрытые изнутри натриевой солью гепарина. Выделение лимфоцитов проводили путем центрифугирования в градиенте Фиколл-урографин (=1,077 г/см3) (ПанЭко, Россия) по общепринятой методике (Fisher D. et al., 1998). В начале работы готовили однократный фосфатный буфер (1PBS), который нагревали до 37С в термостате и смешивали с цельной кровью в соотношении 1:1. Затем аккуратно наслаивали полученную смесь на раствор Фиколл-урографина (3/4 от смеси цельной крови с PBS) в пробирки типа фалькон объемом 15 мл и центрифугировали 30 мин на 1000 об./мин. После осаждения, полученную клеточную суспензию разводили до конечной концентрации 3106 клеток/мл в среде для культивирования RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 10%-ый (от общего объема) раствор эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Sigma, США). Затем суспензию клеток помещали в пластиковые центрифужные пробирки (Greiner, США) и транспортировали во льду для проведения процедуры облучения. 2.3.1.2 Получение и культивирование опухолевых клеток человека MOLT-4

Опухолевые клетки линии MOLT-4 были любезно предоставлены «Томским НИИ онкологии» (г. Томск). Клеточная линия MOLT-4 была получена от пациента с острой лимфобластной лейкемией. В клеточной линии обнаружена замена G/A в кодоне 248 гена TP53. Кариотип клеток гипертетраплоидный (результат анеуплоидии), модальное число хромосом – 96. Линия MOLT-4 была заморожена и хранилась (при -70С) в банке культур «Томским НИИ онкологии». Культивирование клеток осуществлялось в соответствии с общепринятой методикой по стандартному протоколу (Nakashima M., 1988). Клетки культивировали в СО2 инкубаторе при температуре 37С в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Sigma, США) в стандартных пластиковых культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см2 (Nunc, США). Клетки наращивали до концентрации 3106 клеток/мл, в увлажненной атмосфере СО2 инкубатора при 5% концентрации СО2, после чего производили пересев клеток в свежую среду. Частота пересева составляла 1 раз в 2-3 дня, в зависимости от скорости набора необходимой концентрации клеток до конечной концентрации во флаконе 0,5106 кл/мл. Таким образом, клетки постоянно поддерживались в экспоненциальной фазе роста. Аналогично лимфоцитам периферической крови, опухолевые клетки линии MOLT-4 для проведения эксперимента помещали в пластиковые центрифужные пробирки (Greiner, США) и транспортировали во льду для проведения процедуры облучения. Использование опухолевых клеток линии MOLT-4 было обусловлено несколькими причинами и прежде всего тем, что клетки, будучи полученными из Т-клеточного рака, обладают многими характеристиками, сходными с лимфоцитами периферической крови, что облегчает сравнение результатов, полученных с использованием этих типов клеток.

Методика анализа экспрессионных профилей генов в лимфоцитах инидивидов, дифференцированных по чувствительности к действию радиации

Известно, что исходный уровень критических повреждений ДНК в клетках человека определяется активностью его систем репарации, что влияет на формирование конечного биологического эффекта при действии мутагенных факторов различной природы, а также отражается на спонтанном уровне фокусов H2AX. В то же время, работа систем репарации ДНК во многом обусловлена физиологическими особенностями самого организма, его состоянием, наличием патологий (Andreassi M., 2011; Migliore L., 2011), зависит от пола и возраста индивида (Sedelnikova O. et al., 2008; Fenech M. et al., 2011), может быть обусловлена вредными привычками, например, курением (Brandom W. et al., 1990; Иванов К. и др., 2013). Однако в настоящем исследовании не было выявлено статистически значимого влияния возраста индивидов на спонтанный уровень фокусов H2AX (R = 0,25, p = 0,09). Также не было обнаружено значимого влияния возраста на частоту микроядер обоих типов, как в контроле, так и после облучения (R = 0,15, p = 0,31), и пролиферативную активность стимулированных к делению лимфоцитов периферической крови всех индивидов (R = 0,09, p = 0,55). Не было показано статистически значимых различий по уровню спонтанных и радиационно индуцированных фокусов H2AX, частот центромеро-негативных и центромеро позитивных микроядер, а также пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови в группе курящих и не курящих индивидов.

Таким образом, наиболее важным результатом, полученным в ходе оценки влияния спонтанного уровня двунитевых разрывов ДНК на частоту микроядер в лимфоцитах периферической крови человека после облучения 2,0 Гр гамма-излучения в условиях in vitro, является обратная зависимость частоты радиационно-индуцированных центромеро-негативных микроядер (кластогенный эффект ионизирующей радиации) от уровня фокусов H2AX в контрольных образцах тех же индивидов. Это говорит о том, что исходно высокий уровень активности систем репарации ДНК, обусловленный нарушением целостности генетического материала (двунитевые разрывы ДНК) в дальнейшем может приводить к снижению общего генотоксического действия ионизирующей радиации и, как следствие, к уменьшению частоты радиационно-индуцированных хромосомных аномалий. Таким образом, в настоящем исследовании впервые была показана зависимость цитогенетических эффектов в лимфоцитах периферической крови человека от спонтанного уровня повреждений ДНК. Учитывая, что величина спонтанных повреждений генетического материала, а также активность систем репарации ДНК значительно варьируют у разных индивидов, то выявленный в настоящем исследовании феномен может быть использован в качестве прогностической модели оценки индивидуальной радиочувствительности в условиях in vitro.

В проведенных на лимфоцитах периферической крови человека экспериментах была обнаружена обратная корреляция между исходным (спонтанным) уровнем фокусов H2AX и частотой радиационно-индуцированных микроядер. Для проверки того, является ли обнаруженный нами феномен обратной зависимости кластогенных эффектов радиации от спонтанного уровня фокусов H2AX специфичным только для лимфоцитов или же такая закономерность наблюдается и в других типах клеток, был проведен аналогичный эксперимент на 18 линиях первичных экстраэмбриональных фибробластов человека, которые облучались стандартным -излучением 60Co в дозе 1,0 Гр.

Уровень фокусов H2AX в необлученных экстраэмбриональных фибробластах варьировал от 0,56 до 1,93 фокуса на клетку и в среднем составлял 1,01 ± 1,42 фокус/клетку. Через 30 минут после облучения уровень фокусов H2AX значимо повышался до 10,21 ± 5,17 фокуса/клетку (p=0,0006) с последующим снижением к 24 часам после облучения до уровня, не отличающегося значимо от контрольного (0,77 ± 0,36 фокуса/клетку). Эффективность репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК, оцененная в части линий (n=9) как доля исчезнувших фокусов H2AX к 24 часам после облучения, в среднем составляла 97%. Частота центромеро-негативных микроядер значимо повышалась с 3,86 ± 2,12% в контроле до 45,33 ± 19,23% после облучения (p=0,000002).

Через 24 ч после облучения выявлено статистически значимое повышение как уровня фокусов H2AX (p=0,0006), так и частоты центромеро-негативных (p=0,000002) и всех (p=0,000003) микроядер относительно контрольных значений. Была показана значимая положительная корреляция между фоновым и радиационно-индуцированным уровнем фокусов H2AX (R=0,56, p=0,019), центромеро-негативных (R=0,52, p=0,038) и всех микроядер (R=0,76, p=0,00056) в экстраэмбриональных фибробластах человека. Значимой корреляции между фоновой и радиационно-индуцированной частотой центромеро-позитивных микроядер (R=0,32, p=0,22) не выявлено (рис. 17). Это свидетельствует о том, что в экстраэмбриональных фибробластах человека способность к репарации двунитевых разрывов ДНК, вызванных действием фоновых факторов, вероятно, отражает также потенциал репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК.

Оценка статистической значимости наблюдаемых различий экспрессионных профилей в исследуемых группах без поправки FDR

Аналогичные гену CRNDE изменения в уровне экспрессии были показаны для гена ADAMTS1, повышенная экспрессия которого наблюдалась в лимфоцитах периферической крови «радиорезистентных» индивидов. В необлученных лимфоцитах экспрессия ADAMTS1 была выше соответствующего уровня «радиочувствительных» индивидов в 3,25 раза, а после облучения – в 4,16 раза (табл. 1).

ADAMTS1 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1) – ген, кодирующий белки семейства ADAMTS, которые содержат несколько функциональных модулей, включая пропептидную область, металлопротеиназный и дизинтегрин-подобный домены, а также тромбоспондиновый (TS) мотив 1 типа (NCBI: 9510). Впервые ген ADAMTS1 был выявлен в клетках рака толстой кишки (Kuno K. et al., 1997; Lind G. et al., 2006; Ahlquist T. et al., 2008).

Экспрессия гена ADAMTS1 имеет разнонаправленный характер в нормальных и опухолевых клетках, что может свидетельствовать о его роли в про- и антионкогенной активности. Изменение экспрессии гена сопровождается процессом малигнизации (Ricciardelli C. et al., 2011; Freitas V., et al., 2013) и опухолевой васкуляризацией (Gustavsson H. et al., 2008; Kohno T. et al., 2010). В нормальных тканях экспрессия ADAMTS1 выражена слабо, хотя повышение уровня экспрессии отмечено в клетках сердечной мышцы, где ассоциировано с ранними патофизиологическими изменениями при инфаркте миокарда (Nakamura K. et al., 2004). Показано его участие в процессах органогенеза (Mittaz L. et al., 2004; Gnther W. et al., 2005), формировании кровяных и лимфатических сосудов (Lee N. et al., 2006; Misra S. et al., 2008; Brown H. et al., 2010), фолликулогенезе (Brown H. et al., 2006) и овуляции (Brown H. et al., 2010). Отмечена активность ADAMTS1 в процессах ангиогенеза и развития мочеполовой системы (Ng Y. et al., 2006; Brown H. et al., 2006).

В настоящем исследовании, повышенный уровень экспрессии ADAMTS1, как в необлученных, так и в облученных лимфоцитах периферической крови «радиорезистентных» индивидов, вероятно, обусловлен протеканием в их организме воспалительных процессов. В связи с этим, радиационно-индуцированное увеличение экспрессии ADAMTS1 связано с усилением защитных реакций организма и, как следствие, повышением воспалительных процессов, что не противоречит литературным данным (Freitas V., et al., 2013).

FOXM1 (Forkhead box M1) – ген, кодирующий белки-регуляторы транскрипции семейства FOX (Forkhead box protein), которые имеют в своем составе консервативный ДНК-связывающий домен (Myatt S., Lam E., 2007; OMIM: 602341). Экспрессия FOXM1 играет ключевую роль в прогрессии клеточного цикла, регулирует прохождение клеткой чекпойнта в G2/M фазе и достигает максимального уровня в S и G2/M фазах клеточного цикла (Wierstra I., Alves J., 2007).

Ген FOXM1 является протоонкогеном (Myatt S., Lam E., 2007), нарушенная экспрессия которого ассоциирована с развитием многих солидных опухолей (Wonsey D., Follettie M., 2005; Kim I. et al., 2006; Chan D. et al., 2008). Кодируемые геном FOXM1 белки, также участвуют в процессах клеточной дифференцировки и пролиферации, регуляции клеточного цикла, хромосомной сегрегации, обладают ангиогенной активностью (Kwok J. et al., 2010; Karadedou C. et al., 2011). Показана роль FOXM1 в поддержании клеточного метаболизма (Laoukili J. et al., 2007) и лекарственной устойчивости (Kwok J. et al., 2010; Millour J. et al., 2010). Имеются сведения об участии гена в процессах апоптоза (Koo C. et al., 2012), регуляции большого числа G2/M специфичных генов, в том числе Plk1, Nek2 и CENPF (Laoukili J. et al., 2005) и репарации ДНК (Kwok J. et al., 2010; Monteiro L. et al., 2012; Park Y. et al., 2012). Показано, что клетки с инактивированным FOXM1 более чувствительны к действию различных факторов мутагенной природы и подвержены деструкции генетического материала в большей степени (Zhou J. et al., 2014). Наоборот, в клетках с активной экспрессией этого гена процессы репарации ДНК более эффективны (Monteiro L. et al., 2013).

В настоящем исследовании, высокий уровень экспрессии гена FOXM1 наблюдался в лимфоцитах периферической крови «радиорезистентных» индивидов (табл. 1). Это может свидетельствовать о более эффективной репарации ДНК повреждений, индуцированных 2,0 Гр гамма-излучения in vitro, обусловленной активной работой гена, что согласуется с литературными данными.

LGALS2 (Lectin, Galactoside-Binding, Soluble, 2) – ген, кодирующий белки, объединенные на основе гомологии углевод-распознающего домена в семейство галектинов (NCBI: 3957). Разные представители этого семейства обладают способностью образовывать связи с различными клеточными рецепторами, что обуславливает широкий спектр их регуляторных возможностей (Rabinovich G. et al., 2004; Rabinovich G., Toscano M., 2009). В частности гомодимерный белок Gal-2 (галектин-2), кодируемый геном LGALS2, способен связываться с лимфотоксином- (LTA) и участвовать в LTA опосредованном процессе органогенеза и дифференцировки Т-лимфоцитов, где является эффектором проапоптотической гибели активированных Т-клеток (Ozaki K. et al., 2004; Sturm A. et al., 2004). Взаимодействие Gal-2 с мембранным рецептором CD14 оказывает огромное влияние на индукцию провоспалительных и противовоспалительных процессов через активацию CD14/TLR4 сигнального пути (Paclik D. et al., 2011; Yildirim C. et al., 2015). Показана роль LGALS2 в клеточной пролиферации и активации эпителиального барьера, миграции клеток, продукции цитокинов, процессах клеточной адгезии и апоптоза (Paclik D. et al., 2008; Liu F., Rabinovich G., 2010; Di L. et al., 2011; Liu F. et al., 2012).

В настоящем исследовании, низкий уровень экспрессии гена LGALS2 был обнаружен в лимфоцитах периферической крови «радиорезистентных» индивидов. Вероятно, это обусловлено усилением сигналинга о нарушении клеточного гомеостаза за счет повышенного спонтанного уровня повреждений ДНК и ингибирование активности цитокинов, что в свою очередь отражается на пострадиационной выживаемости клеток. В необлученных лимфоцитах, экспрессия гена была статистически значимо ниже относительно «радиочувствительных» индивидов в 20,85 раз, а после облучения in vitro – в 30,25 раз (табл. 1). Таким образом, полученные в настоящей работе результаты солласуются с данными литературы.

RBFOX2 (RNA-binding protein, Fox-1 homolog 2) – ген, также известный как RBM9 (RNA-binding-motif protein 9), RTA (repressor of tamoxifen action) и HNRBP2 (hexaribonucleotide-binding protein 2), кодирующий РНК-связывающий белок, который регулирует альтернативный сплайсинг связываясь с 5 -UGCAUGU-3 элементами и предотвращает присоединение U2AF2 к 3 -концу сайта сплайсинга (UniProtKB: O43251; Underwood J. et al., 2005; Yang G. et al., 2008). Ген RBFOX2 участвует в регуляции альтернативного сплайсинга тканеспецифичных экзонов, дифференциального сплайсинга экзонов в процессе эритропоэза, а также транскрипции рецепторов стероидных гармонов (Ponthier J. et al., 2006; Kuroyanagi H. et al., 2007; Zhang C. et al., 2008).

Экспрессия RBFOX2 и его регуляторная роль обусловлена специфическим действием доменов белка RBFOX2, который состоит из С-концевого домена (CTD), доменов RRM (RNA recognition motif) и 2 альтернативных N-концевых доменов. Снижение экспрессии одной из форм RBFOX2, а именно FOX2, ассоциировано с развитием рака молочной железы и яичников, где оказывает модулирующее влияние на процесс сплайсинга и пролиферативную активность клеток и может выступать в качестве супрессора патологических преобразований (Venables J. et al., 2009). Изменение специфики доменов RBFOX2 оказывает существенное влияние на экспрессию гена RBFOX2 и, как следствие, негативно сказывается на его транскрипционной активности и регуляции сплайсинга (Arya A. et al., 2014).

В настоящем исследовании повышенный уровень экспрессии гена RBFOX2 был обнаружен в необлученных лимфоцитах «радиорезистентных» индивидов (в 2,9 раза). В тоже время, облучение клеток 2,0 Гр гамма-излучения in vitro приводило к статистически значимому снижению экспрессии гена в этой группе (в 3 раза) и увеличению в группе «радиочувствительных» индивидов (в 3,2 раза). Таким образом, после облучения, экспрессия гена RBFOX2 была статистически значимо выше в лимфоцитах периферической крови «радиочувствительных» индивидов (в 3,2 раза) (табл. 1). Вероятно, это обусловлено тем, что радиационно-индуцированное изменение экспрессии генов в лимфоцитах индивидов обоих сравниваемых групп осуществляется не только по конкретным генам, но и по их отдельным сплайсинговым вариантам. В результате этого, достигается большая пластичность в реализации клеточного ответа на действие ионизирующей радиации. Таким образом, наблюдаемое разнонаправленное изменение экспрессии RBFOX2 в лимфоцитах «радиорезистентных» и «радиочувствительных» индивидов до и после облучения согласуется с данными литературы (Arya A. et al., 2014).