Введение к работе
Актуальность темы. Использование биотехнологических методов в репродукции крупного рогатого скота обуславливает необходи -мость детального изучения процессов мейоэа, оплодотворения и
-раннего эмбрионального развития. Многие фундаментальные иссле
дования проведены на лабораторных животных. Однако, экстрапо -ляция- этих данных на домашних животных зачастую затруднительна и даже ошибочна. В последние годы достигнуты значительные успехи в использовании технологии пересадки эмбрионов при совершенствовании сельскохозяйственных животных. Активизируются иссле -дования, связанные с возможностью получения ценных сельскохо -зяйственных животных путем мающуляций с ранними зародышами для создания химер и трансгенных эмбрионов с.уникальным генотипом особей, отличающихся высокой продуктивностью, устойчивостью к стрессам и заболеваниям.
Исходным моментом во всех этих исследованиях является нали -чиє в достаточном количестве эмбрионов, ооцитов и зигот. Вот почему получила большое распространение" технология оплодотворения ооцитов, созревших вне организма. В ее основе лежит возможность получения эмбрионов иэ ооцитов, выделенных из яичников коров, выбракованных по каким-то причинам и убитых на мясоком -бинате. Перспективность такого подхода к решении проблемы показана в опытах по выращиванию вне организма зародышей, иэ кото -рых при последующей пересадке реципиентам было получено потом -ство (Эрнст Л.К. и др. 1983, 1992, Lu, Gordon 1989).
Возможность получения эмбрионов коров иэ созревших вне организма яйцеклеток представляет не только коммерческий интерес, но и является удобной базой для разработок методов генетической и клеточной инженерии. В то же время дозревание и оплодотворе -ние ооцитов іп Уіигоявляется. одной из самых удачных моделей изучения завершающих этапов мейоза и раннего эмбриогенеза мле -копитащих.
В настоящее время разработаны методы, позволяющие получать достаточно высокий процент ооцитов на стадии метафазы -П, однако, при последующем оплодотворении лишь треть из них развива -ется до стадии морулы и бластоциста (Berg и,вгед,І987).
Успех культивирования зависит от многочисленных факторов, из которых одним из самых важных является создание системы культивирования, обеспечивающей полноценное дозревание ооцитов, компетентных к оплодотворению и дальнейшему развитию в эмбрионы. Понятно, что моделирование процессов нуклеарного и цитоплазма-тического созреваний ооцитов, оплодотворения и раннего эмбриогенеза становится возможным на основе познания механизмов мей-' оза в оогенезе крупного рогатого скота. Однако, многие вопро -сы регуляторних механизмов мейоза и раннего эмбриогенеза до сих пор окончательно не выяснены. Так, остается открытым вопрос о причиие ингибирования созревания ооцитов, хотя найден целый ряд веществ, получивших общее название ИСО (ингибиторы созревания ооцитов), природа которых является объектом исследования. Немногочисленны и противоречивы данные, касающиеся изучения асинхронности ядерного и цитоплазматического созревания яйце -клеток. Гипотезируются причины низкого выхода эмбрионов на стадиях бластоцисти.
Заманчивая идея использования огромного запаса ооцитов, содержащегося в яичниках убитых животных, до сих пор не стала реальностью, так как данные по получению эмбрионов от' индивиду -альных животных свидетельствуют о малом выходе качественных ооцитов у отдельных особей. (Borg.Brem ,1990, Эрнст, Прокофьев и др.І99-і).
Необходимость в получении новых углубленных знаний, касающихся биохимических и цитоген'етических особенностей мейоза и раннего эмбриогенеза обусловили направление наших исследований.
Цель и задачи исследований. Выяснить и уточнить особенное -ти мейоза у коров на основе использования различных моделей дозревания и оплодотворения ооцитов вне организма и разработать цлтоморфофункциональные критерии оценки качества ооцит-кумулюс-ных комплексов.. Стандартизировать отдельные этапы технологии созревания и оплодотворения ооцитов i" vitro , Для достижения цели решались следующие задачи:
- изучить влияние гомологичной фолликулярной жидкости (М) и ео пептидов на майоэ и оплодотворяемость ооцитов крупного рогатого скста;
- определить временные параметры мейотических преобразова
ний хромосом в ооцитах при их культивировании в системах с ис -
пользованием структурных элементов фолликула, ФЇЇ и ее пептидов;
- выявить эффект ФЖ,- ее пептидов и некоторых-факторов-рос^-
та на синтез ДШ в клетках гранулезы;
исследовать характер ооцит-кумулюсных взаимодействий при созревании ооцитов в различных культуральных системах;
разработать количественные морфофункциональные критерии оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов и тканей фолликулов;
изучить потенции к развитию в эмбрионы ооцитов, прокультивированных в различных культуральных системах;
показать возможность прогнозирования степени компетентности исследуемых ооцитов к оплодотворению и дальнейшему развитию
в эмбрионы на основе разработанного комплексного теста качества ооцитов, включающего цитоморфологическуга характеристику ооцит -кумулюснбго комплекса и определения функционального состояния ооцита.
Научная новизна и практическая значимость работы. Работа имеет фундаментально-прикладное значение и представляет первое всестороннее, комплексное исследование мейоза и оплодотворения ооцитов коров на основе сравнительного анализа различных моде -лей созревания яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма. Полученные данные представляют научную основу для работ в области технологии оплодотворения in vitrq клеточной и генетической инженерии. В работе впервые:
установлено преимущество систем дозревания ооцитов, основанных на использовании структурных элементов фолликула, ФЖ и ее белков;
разработан комплексный тест оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов по дцерно-цитоплазматическому состоянию ооцита и цитоморфологической характеристике окружающих его кумулюсных клеток. (Положительное решение на изобретение №140702 );
продемонстрирована возможность стандартизации условий культивирования за счет исключения сыворотки из среды дозревания ооцитов и использования вместо нее высокомолекулярных белков фолликулярной жидкости (УМ). (Положительное решение на изобретение К> 132304 );
выявлен положительный эффект катионных белков Ш (молекулярной -массой от 60 до 90 кДа) и катионного мозгового нейрит-стимулирующего белка ДМСБ7 (молекулярной массой 15 кДа) на мейоз ооцитов коров. (Авт.свид.№ 1659474);
показано, что деструктивным изменениям в фолликулярных клетках сопутствуют нарушения механизмов транспорта электронов в дыхательной цепи;
выявлены различные потенции ооцитов к партеногенетическо-му развитию в зависимости от условий их дозревания;
разработаны модели внефолликулярного дозревания ооцитов, основанные на использовании ткани фолликула и БЖ (приоритет -ная справка № 50649S8 ).
Апробация работы.. Материалы диссертационной работы доложены на ХХШ международной конференции ЕАЖ (Ленинград, 1982 г.), на I Всесоюзной конференции по цитогенетика с.-х. животных (Ленинград, 1985 г.), на Всесоюзном совещании "Трансплантация эмбрионов с.-х.животных" (Алма-Ата, 1989 г.), на научно-методическом совещании "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино - 1989 г.), на Всесоюзном совещании "Фундамен -тальное и практическое применение в медицине с.-х. достижений биотехнологии" (Тарту, 1986 г.), научном семинаре "Использова -ние современных методов исследований в биологии" (Ленинград -Пушкин, 1988 г.) на Всесоюзной научно-технической конференции "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве, ветеринарии, медицине" (Ленинград, 1988 г.), Всесоюзной научной конференции "Физиология продуктивных животных - решению Продовольственной программы СССР" (Тарту - 1989), Международном симпозиуме "Через ооцит к эмбриону" (Чехословакия, 1990 г.)> Бее--союзном совещании "Проблеуш развития биотехнологии в животно -водстве" (Москва, Дубровицы, 1990г.), научно-производственной конференции "Новые методы селекции и биотехнологии в животноводстве" (Киев, 1991), Российско-германском симпозиуме "Достиже -ния биотехнологии в животноводстве" (Москва,Дубровицы, 1992г.)., Публикации. По теме диссертации опубликовано 38 работ, 06t»8M работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и предложений, списка
использованной литературы, включающего 256 источников, в т.ч. 199 иностранных. Работа изложена на '0 таблиц.
--- МАТЕРИАЛЫ-И-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена с применением современных морфологических, гистологических, цитологических, цитогенетических, генетических, биохимических, биофизических и биотехнологических методов.
В экспериментах использовали реактивы и биопрепараты отече-*' ственного и импортного производства, а также Ш и ее белки, которые выделяли из фолликулов методом ono et all (1986) с после -дующим фракционированием и гель-фильтрацией. В исследованиях использовали фракции Бй молекулярной массой от 5 до 15 кДа, по -лученные в сотрудничестве с коллегой из лаборатории химии белка С.-Петербургского Государственного университета Гойло Т.А. и сотрудником НИЩ-(ФРГ) Мартином Гёце. Фракцию катионных белков из ФЖ получали путем экстракции Ъ% нею. (Гончарова,Романюк и др.1987г.).
Электрофорез белков проводили в полиакргаїамидном геле пв методу Корнберга (1975). Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури (IQ6I г.).
Объектом исследования служили овариальные ткани, Ш и ооцит-кумулюсные комплексы крупного рогатого скота черно-пестрой породы. При получении материала для исследований учитывали возраст животного, физиологическое состояние генитального тракта (в экспериментах использовали яичники животных без признаков видимой патологии). Животных овариоэктомиромли на конвейере С.-Петербургского мясокомбината, . яичлики . помещали в термос и доставляли в течение 1,5-2 часов в лабораторию при температуре 37,5С. В соответствии с поставленными задачами в экспериментах использовали технологические приемы моделирования мейоза и ран -него эмбриогенеза, суть которых представлена на схеме (рис.1).
Ооцит-кумулюсные комплексы извлекали из фолликулов диамет -
ром от 3 до б мм аспирацией или разрезом, который проводили с
использованием разработанного нами устройства для рассечения
фолликулов (рацпредложение за № !::/. ). Все процедуры по
отыыву, анализу качества гамет и эмбрионов, оплодотворению ооцитов проводили с помощью разработанного нами минитермоэкси-катора, обеспечивающего оптимальные режимы температуры и газового состава (рацпредложение за № I3I/6).
Овариоэктомия убитых животных
Цитоморфо-функциональ-ная оценка
Выделение ооцитов из фолликулов
Дозревание ооцитов
Оплодотворение ооцитов
Капацита -ция сперматозоидов^
Культирование зигот и эмбрионов
Получение культуры клеток эпителия яйцевода
Рис.1. Структурно-логическая схема проведения экспериментов
В своих исследованиях мы использовали различные модели до -зревания ооцитов вне организмаІрис.2).
Базовой средой для культивирования служила ТС-І99 с сывороткой и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина). В качестве заменителя сыворотки использовали БФЖ в концентрации от 5 до 15. Для получения ткани фолликула последний выделяли из яичника и оценивали его качество. Нормальными счи -тали фолликулы, имею;цие высокий тургор, прозрачную оболочку и хорошо развитуа сеть кровеносных сосудов в теке. Препарирован -нуо ткань помещали в пенициллиновый флакон с 5 мл среды и культивировали в течение 24 часов при температуре 38-39С. Для приготовления гистологических препаратов фолликулы фиксировали в растворе Буэна. При гистологическом анализе учитывали число пикиотических ядер в клетках теки и гранулезы. І^ранулезу полу-wojw аз фолликулов диаметром от 3 до 6 мм. Клетки гранулезы
использовали для роста монослоя или для кондиционирования-сред. Наличие ростстимулирущей активности Ш, БФН и некоторых факторов роста определяли по интенсивности вклюцения 3Н-тимиди— на в ДНК клеток гранулезы (Адаме, 1983 г.).
Овариоэктомия убитых
животных
Дозревание) ооцитов |
Аспирация фолликулярной жидкости
ІСультиЕирование ооцитов в 1С-І99 с сывороткой
Рис.id. Методы моделирования дозревания ооцитов вне организма
После і!4-^6-часового культивирования ооциты оплодотворяли свежепслученными или замороженными сперматозоидами предварительно капацктированными по методу Parrish (1986).Через 36-48 часов ранние зародыши помечали в предварительно полученную культуру эпителиальных клеток яйцевода коров (їді et аЦІ989). Контроль за ядерным созреванием ооцитов и оценку эмбрионов осуществляли с помощью цитогенетического метода ( Tarkowaki ' , 1966).
функциональное состояние ооцитов определяли по соотношению коферментов окислительного фосфорилирования НАДН/ФАД и содержа -нию внутриклеточного кальция. Состояние ооцитов оценивали по интенсивности флуоресценции НАДН и ФАД. Для определения кальция' использовали флуоресцентный зонд (хлортетрациклин в концентрации ,і5 мкмоль).
Параметры проведения люминесцентного анализа:длины волн
возбуждения НАДН - 365 им, ФАД - 436 нм, кальция - 380-400 нм;' регистрацию флюоресценции проводили на спектрах: 465 (НАДН), 530 (ФАД), Са- 530 нм. Время облучения - до 10 сек.
Морфологическое состояние клеточных и тканевых культур фолликула, ооцитов, эмбрионов, их цитогенетические и гистологические препараты исследовали под микроскопом " OLIMPUS "." '
Материал документировали микрофотографиями. Фотографирование осуществляли на пленке "Микрат-300". Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами, і