Введение к работе
Актуальность исследования. Значительное ухудшение экологической обстановки за последние десятилетия вызывает серьезные опасения относительно генетических последствий действия мутагенов окружающей среды на человека. Модельные эксперименты в системе in vitro показати, что широкий спектр внешнесредовых факторов приводит к мутационным изменениям в клетках человека (Бочков, Чеботарев, 1989). Имеются также сведения об увеличении частоты спонтанных абортов, пороков развития, мертворождений а некоторых друпіх показателей в результате контакта с вредными факторами в быту или на производстве, что принято трактовать как косвенное подтверждение генотоксичности (Гигиенические критерии состояния окружающей среды, вып. 46, 1989).
Однако, к настоящему времени не получено убедительных доказательств роста частоты каких - либо наследственных заболеваний в результате ухудшения экологической обстановки. Наоборот, имеются сведения о том, что действие мутагенов, в том числе и таких сильных, как радиация, не приводит к генетической патологии у детей (Петрушкнна, Мусаткова, 1993; Czeizel et al., 1991: Forni, Bertazzi, 1987; Rudiger, 1991; Shelby, 1994; Vogel, 1992). Отсутствие мутагенных эффектов в потомстве человека противоречит как представленням об уровне мутабильности человеческих клеток, так и экспериментальным исследованиям на животных, где убедительно продемонстрированы наследственные изменения в результате действия экзогенных мутагенов (Воробцова, 1988).
Можно предположить, что необнаружение генетических эффектов экологических мутагенов у человека не отражает реальную ситуацию, но вызвано недостатком адекватных методов оценки.
Чтобы получить представление о ходе мутационного процесса у человека, важно иметь информацию о состоянии генома половых клеток. Развитие медицинских технологий сделало принципиально возможным исследование оонитов, сперматозоидов и преимпланташюнных эмбрионов человека (Pellestor, 1991). Эти технологии создавались для целей медицинской практики - борьбы с бесплодием. В последние годы в связи в активизацией работ по оплодотворению in vitro, - расширением сети центров экстракорпорального оплодотворения, увеличением потока больных и совершенствованием медицинской техники - открылись возможности проведения исследовательских программ в области генетики в периоде раннего эмбриогенеза человека. Так, проводится пренмплантационное определение пола плода, разрабатываются и внедряются методы преимпланташюнной диагностики
наследственных болезней (Dyban et al., 1993; Griffin et al., 1993). Несомненный интерес представляло бы использование гамет и эмбрионов человека для оценки действия внешнесредовых факторов на геном, однако практические возможности реализации такого подхода еще не исследованы.
Оценка мутагенной опасности для половых клеток различных веществ и соединений, с которыми контактирует современный человек, требует применения модельных экспериментов. В условиях эксперимента можно установить степень генотоксичности изучаемых воздействий и подойти к пониманию механизмов, лежащих в их основе. Если в отношении мужских половых клеток человека существует принципиальная возможность экспериментирования с изолированными сперматозоидами, то женские половые клетки представляют собой уникальный материал, не допускающий проведения экспериментальных исследований. Здесь существенную помощь в оценке действия мутагенов окружающей среды на женские половые клетки могут оказать опыты на ооцитах лабораторных животных. Для этого необходимо создание экспериментальных систем, позволяющих наиболее точно моделировать изменения, происходящие в женских половых клетках под действием внешнесредовых мутагенов. Особый интерес представило бы изучение мутагенного действия таких веществ и воздействий, с которыми человек контактирует в повседневной жизни.
Мутагенные факторы окружающей среды повреждают геном как половых, так и соматических клеток. Если эффект повреждения половых клеток может проявиться в последующих поколениях, то мутации в соматических клетках затрагивают генетический материал тканей организма человека. Анализ генных мутаций в соматических клетках человека (гликофориновый тест, мутации гена HPRT) представляет собой перспективное направление в изучении мутагенеза, однако в настоящее время эти методики находятся в стадии разработки и возможности их практического применения весьма ограничены. Основной объем информации о мутагенном действии факторов среды в популяциях человека получают с помощью цитогенетических тестов, среди которых ведущее положение занимает учет частоты хромосомных аберраций. Предлагаются также иные методические подходы (такие, как анализ микроядер, индукция преждевременной конденсации хромосом), в числе которых перспективным в эксперименте показал себя метод сестринских хроматидных обменов. Однако, прежде, чем использовать СХО для выявления действия средовых мутагенных факторов, необходимо оценить его информативность в популяционных исследованиях.
Применение адекватных онтогенетических методов дает возможность выявлять действие мутагенных факторов на производстве, в быту и при возникновении чрезвычайных ситуаций. Важность такого рода исследований обусловлена не только их социальной значимостью (компенсаторные выплаты за вредные условия и т.д.), но и потенциальной опасностью мутагенных воздействий для здоровья человека. Вопрос о судьбе генетических повреждений, индуцированных экзогенными мутагенами, об их роли в развитии заболеваний у человека далек от своего разрешения. Необходимы дальнейшие исследования, включающие мониторное наблюдение за пострадавшими в течение длительного периода после воздействия. Анализ цитогенетических изменений в отдаленном периоде после действия мутагенных факторов позволит подойти к решению еще одной важной проблемы - проблемы ретроспективной биодозиметрни и бионндикации мутагенных воздействий на организм человека.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск наиболее адекватных цитогенетических методов оценки действия экологических мутагенов на половые и соматические клетки человека, сопоставление разрешающей способности и практической значимости различных способов хромосомного анализа при решении конкретных проблем экологической генетики.
Дня достижения цели исследования перед работой поставлены следующие задачи:
-
Оценить возможность использования ооцнтов и сперматозоидов человека для изучения мутационного процесса в человеческой популяции.
-
Разработать модельные системы на лабораторных животных для изучения действия средовых факторов на женские гаметы и с их помощью определить степень мутагенной опасности ряда внешнесредовых факторов (алкоголь, гербицид, стресс).
-
Изучить применимость теста СХО для выявления мутагенных факторов в популяции человека.
-
Проанализировать с помощью цитогенетических тестов степень мутагенной опасности ряда химических производств.
-
Изучить отдаленные эффекты действия радиационного фактора на геном соматических клеток человека (на примере ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС), определить характер элиминации хромосомных повреждений во времени и оценить возможности цитогенетических методов ретроспективной биодозиметрии и биоиндикации радиационных воздействий.
Научная новизна исследования.
-
Впервые в рамках одной работы проведено изучение действия мутагенов окружающей среды как на половые, так и на соматические клетки; продемонстрированы ограничения в использовании ооцитов и ранних эмбрионов, полученных при выполнении программы экстракорпорапьного оплодотворения у человека, а также "хомячкового теста" (визуализации хромосом спер-миев) для популяционных исследований.
-
Впервые всесторонне апробированы в качестве модельной тест-системы для оценки мутагенных воздействий средовых факторов ооциты лабораторных грызунов. Продемонстрирована особая чувствительность преовуляторной стадии диакинез - метафаза I и эффективность экспериментальных воздействий в этом периоде для детекции генетических последствий таких экологических мутагенов, как гербицид 2,4-Д, алкоголь и стресс.
-
Сформулирована концепция, получившая название периконцептолопі-ческой (от слова conception - оплодотворение, зачатие), согласно которой кратковременное воздействие на самых ранних этапах эмбриогенеза способно индуцировать хромосомные аномалии у человека.
-
Впервые обращено внимание на необходимость унификации измерений частоты сестринских хроматидных обменов (СХО) при популяционных исследованиях с учетом показанных в работе высокой степени вариабельности частоты СХО у одних и тех же индивидуумов и достоверной изменчивости этого показателя в зависимости от времени суток. Предложено использовать более адекватную статистическую обработку для установления мутагенных эффектов в условиях вредных производств.
-
Накоплен уникальный материал о хромосомной нестабильности у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, свидетельствующий о смещении спектра хромосомных аберраций в сторону аберраций хромосомного типа, а также наличии у части ликвидаторов цитогенетических маркеров радиационного воздействия даже по прошествии длительного временного интервала (6 и более лет) после аварии.
Практическая значимость работы. Практическая значимость исследования состоит в обосновании концепции периовуляторной охраны плода, предусматривающей максимальную защиту заключительных этапов оогенеза и раннего преимплантацнонного развития эмбриона от действия неблагоприятных средовых факторов. Мероприятия, направленные на осуществление периовуляторной охраны плода, позволят снизить частоту ранней эм-брионапьной смертности, рождения детей с хромосомными аномалиями и генетически детерминированными пороками развития.
Предложен новый методический подход к ретроспективной оценке действия радиационного фактора. Бионндикация радиационного воздействия, производимая с помошьго предлагаемой схемы цитогенетического обследования, способствует снятию социального напряжения у пострадавших, выбору адекватной тактики лечения больных, а также разрешению экспертных вопросов.
Апробация работы. Основные результаты работы и обобщения были доложены и обсуждены на съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982; Москва, 1987), на Всесоюзных и Российском съездах медицинских генетиков (Киев, 1983; Алма-Ата, 1990; Москва, 1994), XIV Ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 1984), Советско- Польском симпозиуме по проблемам раннего развития человека (Варшава, 1988), научных сессиях ИАГ (Ленинград, 1988,1990,1992), заседаниях Всесоюзного общества научного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Ленинград, 1980,1984,1988,1989), заседаниях Общества медицинских генетиков (Ленинград, 1990,1991,1992), III Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990), VI конференции Европейской ассоциации акушеров и гинекологов (Москва, 1991), VI Всесоюзной конференции "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды" (Ленинград, 1991), научно-практической конференции "Стратегия экологической безопасности России (Санкт-Петербург, 1992), симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз "(Москва, 1992,1994), научной конференции "Актуальные вопросы ретроспективной, текущей и прогнозной дозиметрии облучения в результате Чернобыльской аварии" (Киев, 1992), VI Ежегодной конференции немецкого общества генетиков человека (Дюссельдорф, 1994), II Международной конференции "Радиобиологические последствия ядерных аварий" (Москва, 1994), рабочем совещании по проблемам биодозиметрии (Париж, 1994).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, с том числе дез авторских свидетельства на изобретения.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 264 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Имеется приложение. В диссертации 30 таблиц и 20 рисунков. Список литературы содержит 506 названий.