Введение к работе
Аетуэльность_темы. К настоящему времени подавляющее большинство цитогенетических исследовании, направленных на выявление частот встречаемости хромосомных аберраций в клеточных популяциях, проводится с использованием методов, требующих предварительного культивирования клеток в условиях in vitro. Однако, частоты хромосомных аберрации, выявленные одним и тем же методом в клеточных популяциях in vitro и in vivo не совпадают (Бочков, 1971). Накопление знании о динамике возникновения кариотипических нарушении и распространения аберрантных клонов в клеточных популяциях in vivo (на Фоне несоизмеримо большего объема информации, накопленного с использованием методов in vitro) представляется на настоящем этапе развития биологии принципиально важным. Такая информация может быть получена путем изучения частот встречаемости клеток с определенными видами морфологических аномалий ядер, поскольку установлено, что значительная часть спектра хромосомных аберрации после завершения деления клеток приводит к Формированию морфологически измененных ядер (Алов, 1972). Наличке клеток с аномальными ядрами может указывать на тот Факт, что клетки, в которых возникли хромосомные аберрации, делятся и изменяют кариотипическии профиль популяций. Следует сразу признать, что цитогенетические тесты in vivo, основанные нз учете определенных морфологических изменений ядер, совсем яе исключают классический метаФазныи метод учета хромосомных аберрации, а наоборот могут дополнять его, облегчая выявление случаев с повышенными частотами хромосомных аберраций.
К наиболее информативным показателям, характеризующим морфологические аномалии ядер, которые возникают в результате кариотипических нарушений, могут быть отнесены микроядра, хромосомные мосты и "хвостатые" ядра. Микроядра в клетках образуются в процессе деления из хромосомного материала, потерявшего контакт с веретеном митотического аппарата. Они включают в себя хроматин либо ацентрических Фрагментов, либо целых хромосом (хроматид). Частота встречаемости клеток с микроядрами свидетельствует о частоте возникновения клеток с измененными кариотипами и является базовым показателем 3 МИКрОЯДерНОМ Тесте CMuUer, Streffer. 19933. Хромосомиые
аберрации дицентрического типа приводят к Формированию клеток с хромосомными мостами (Алов, 1972). Известно также, что дицентри-ческие хромосомы, являясь маркерами радиационных воздействии, час-
то образуют хромосомные мосты, после разрыва которых в интерфазе Формируются клетки с полумостами или, говоря иначе, с "хзостзтыми" ядрами (ПрокоФьева-Еельговская, 1961).
Для изучения зномэлии ядер и установления их взаимосвязи с цитогенетическим гомеостазом в клеточных популяциях in vivo представляются интересными и перспективными программы селекции, направленные как на повышение, так и на понижение частот спонтанного образования клеток с аномальными ядрами. В ходе реализации таких селекционных программ должны проявиться причинно-следственные связи между кариотипическои изменчивостью и Формированием аномальных ядер в клеточных популяциях, а данные о динамике отбора позволят определить вклад наследственных и средовых Факторов, обусловливающих кариотипическую изменчивость. Метод отбора на генетическую стабилизацию и дестабилизацию клеточных популяции имеет как практическое значение для биотехнологии, так и научный интерес, поскольку полученные в результате такой селекции сублинии, контрастные по признаку "частота клеток с аномальными ядрами", могут оказаться удобной моделью для Фундаментальных исследовании мутационного процесса.
Изучение аномалии ядер в клеточных популяциях дп vivo может представлять интерес в радиобиологических исследованиях, поскольку известно, .что воздействие ионизирующей радиации на клеточные популяции приводит к появлению в них клеток с аномально измененными ядрами с Лаптева-Попова и др., 1959; Dienstbier et ai., 1964; Глуз-ман и др., 1992). К настоящему времени известен достаточно широкий спектр морфологических типов ядерных аномалии, однако их классификация и полные сведения об их генезе отсутствуют. Большой интерес, на наш взгляд., вызывает такой вид аномалии, при которой ядро имеет достаточно длинньш хроматиновыи вырост в пространство цитоплазмы и выглядит внешне как "хвостатое" ядро. Возможно, что появление "хвостатых" ядер связано с возникновением дицентрических хромосом и поэтому метод, основанный на определении частоты встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами, в перспективе может быть использован в радиационно-эпидемиологических исследованиях, так как опыт ликвидации последствий радиационных аварии показал необходимость разработки и внедрения краткосрочных информативных методов для обследования облученного контингента с Гуськова, 1996;». Однако, для внедрения такого метода в практику требуется детальное изучение
otinwa тгтдтї ттдтта "толлтотгг?" аттоп tav mntiotnmoo хяпг> na ппоаатха пгїомлшїТїлг
цитогекетических механизмов их образования, морфологических особенностей, а также определение фоновых частот встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами в популяциях человека и животных.
Исходя из сказанного выше, изучение аномальных ядер в клеточных популяциях in vivo представляєтея актуальным. Новые знания о мутационном процессе могут быть получены путём проведения клональ-ного анализа и селекции по признакам, манифестирующим аномалии ядер. Еместе с тем, очевидно, что наряду с общепризнанным методом учета аномалии ядер - микроядерным тестом, существует перспектива для развития новых методов, основанных на учете других Форм аномалии ядра.
Поэтому целью настоящей работы явилось изучение морфологических аномалий ядер, указывающих нз сдвиги цитогенетического го-меостаза в популяциях нормальных и злокачественных клеток млекопитающих. Основное внимание предполагалось уделить селекции клеточных популяции in vivo по признаку "частота встречаемости клеток с аномальными ядрами" и разработке нового метода, основанного на
Определении "ХВОСТаТЫХ" ЯДер В КЛеТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ in vivo.
При этом были поставлены следующие задачи:
-
Изучить Фенотигическую и наследственную гетерогенность клонов перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами".
-
Провести искусственный отбор клонов клеток перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс и опухолевых узлов миеломы sp г/о мышеи с повышенными и с пониженными частотами встречаемости клеток с микроядрами и с хромосомными мостами. Определить коэффициент реализованной наследуемости пг признаков "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами" в исследованных клеточных популяциях.
-
Провести сравнительный анализ показателей кзриотипической изменчивости в клеточных популяциях, отселектированных как на повышенную, так и на пониженую частоту клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.
-
Определить степень злокачественности по показателю "метастатический потенциал" популяция клеток с повышенной и с пониженной в результате отбора частотами клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.
6. Определить основные морфологические типы "хвостатых" ядер
тттл/тлтгтггптэ ттл irrmova rjr шглэптт.пг tjt rtrva тт TfrwtjrrT, тдтг V тголг'тлптлтгатттл
Изучить гетерохромзтин и ядрышки в "хвостатых" ядрах. Установить радиочувствительность показателя "частота клеток с "хвостатыми" ядрами" и выяснить характер дозовои зависимости.
7. Определить связь между частотой встречаемости клеток с
"хвостатыми" ядрами и частотами доцентриков, ана-и тедсхраз с хро
мосомными мостами, интерФазных клеток с хромосомными мостами, кле
ток С МИКрОЯДраМИ В КЛеТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ in vivo.
-
Определить частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, микроядрами и хромосомными мостами, а также эритроцитов с микроядрами в периферической крови у здоровых доноров и у облученных пациентов".
-
Определить частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови в популяциях крупного рогатого скота.
10. Изучить частоты встречаемости лимфоцитов с аномальными
ядрами у больньос лейкозом коров.
Научная_новизна_и_тедр^тотеская_значимость:
Продемонстрирована Фенотипическая и наследственная гетерогенность клонов опухолевых клеток in vivo по признакам, указывающим на ядерные аномалии.
Впервые проведены искусственные отборы в популяциях соматических клеток in vivo, направленные на повышение и на снижение частот встречаемости клеток с аномальными ядрами. Показано, что спонтанная нестабильность кариотипа клеток в значительной степени зависит от Факторов внешней среды при несомненной роли наследственных Факторов. В результате проведенной селекции установлена взаимосвязь между различными вицами аномалий ядер и показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность.
Зарегистрирована отрицательная корреляция между показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность опухолевых клеток и их злокачественность. Показано, что искусственный отбор .на повышение спонтанной частоты клеток с микроядрами и искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с хромомосомными мостами приводит в конце концов к репродуктивной гибели популяций клеток.
Представлена классификация основных морфологических типов "хвостатых" ядер и показана их видовая специфичность. Изучены свойства хроматина "хвостов" ядер лимфоцитов.
Определены Фоновые показатели частот встречаемости лимфоцитов
с "хвостатыми" ядрами в периферической крови у мужчин, женщин и детей. Выявлены повышенные частоты встречаемости клеток с аномальными ядрами в периферической крови у пациентов, облученных 6-Ю лет назад. Показатель "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" впервые был использован з цитогенетическом прескрининге.
В популяциях крупного рогатого скота определены частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами и выявлено повышение частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической КрОВИ in vivo у КОрОВ бОЛЬНЫХ ЛЄЙК030М.
П2актическая_ценность_2абдты. Разработанные и апробированные способы селекции клеточных популяции на стабильность генома могут быть использованы в промышленноа биотехнологии (Госпатент РФ su 180619S аз сі г Nis^-oo s/oo, 1ээг; по заявке n 95111988 от 11.07. 1995 принято положительное решение о выдаче патента). Количественный и качественный учет исследованных Форм аномалий ядер в клеточных популяциях in vivo может в перспективе- использоваться для экспресс-оценки цитогенетического гомеостаза в онкологической практике и в цитогенетическом прескрининге облученного контингента (получена приоритетная справка сі г ы э/оо з^-об в 1997 г). Метод учета аномалий ядер в соматических клетках может использоваться в популяциях сельскохозяйственных животных в экспертизе экологической чистоты сельхозпродукции.
Апвдбация_рзботы. Материалы диссертационной работы были представлены на 1-м Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), Всесоюзной конференции "Генетика соматических клеток" (Звенигород, 1989), на Международной конференции "Митоз и расхождение хромосом" (Ленинград, 1990), Международной конференции "Биотехнология-1994" (С-Петербург, 1994), Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных с С.-Петербург, Пушкин, 19943, 16-м Международном конгрессе по проблемам канцерогенеза (Нью-Дели, 1994), Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве (Боровск, 1995), 3-м Международном симпозиуме по хромосомным аберрациям (Эссен, 1995), Конференции по детской гематологии "От науки к практике" (Санкт-Петербург, 1995), Международной конференции ВОЗ "Последствия для здоровья после Чернобыльской катастрофы (Женева, 1995), Конференции ЕАЙ (Лилиехаммер, 1996), 24-м съезде Международного гематологического общества (Дюссельдорф, 1996), Международном конгрессе по клиническая химии (Лондон, 1996), Международ-
ной конференции "Радиация и здоровье" <Бир Шива, Израиль, 1996), 1-ом Европейском патогенетическом конгрессе (Афины, 1997), 3-м съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), Международной конференции "Малые дозы радиации: биологические зффєктьі и контроль регуляции" с Севилья, 19973, Международной конференции "Стратегия экологической безопасности" с С.-Петербург, 1997э, Научно-практической конференции "Медико-социальные аспекты проблем ветеранов-атомщиков и пути их решения" (С.-Петербург, 1997), Международном конгрессе по проблемам метастазирования (Хьюстон, 1997), 8-й и 9-й конференциях германского общества медицинских генетиков сГеттин-ген, 1996, Инсбрук, 1997).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 45 печатных работ.
В экспериментах использовали белых беспородных крыс и мышеи линии balb/c разводки питомника РАМН "Рапголово", а также свиней породы ландрас, выращенных во ВНИИФиБПЖ сг. Боровсю.
Группу облученных пациентов составили 160 мужчин в возрасте от 30 до 72 лет, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации 6-Ю лет назад. По данным истории болезни 154 человека из этой группы получили малые дозы облучения с до 0,25 еуз и 6 человек получили большие дозы облучения с более 1,5 <зуз. Также была исследована выборка детей (п=в4), проживавших на территории, подвергшейся загрязнению радионуклидами, или эвакуированных с таковой в возрасте от 1 до 13 лет. Контрольные группы составили 89 здоровых мужчин в возрасте от 19 до 60 лет, 50 женщин в возрасте от 20 до 60 лет и 94 ребенка в возрасте от 3 до 6 лет, не подвергавшихся ранее с по анкетным данными радиационному воздействию.
Исследуемые выборки крупного рогатого скота включали коров и быков из различных регинов России и ближнего зарубежья. В таблице 1 приведены пол, порода и хозяйства, в которых выращивались обследованные животные. В исследованиях влияния леикозного процесса на аномалии ядер клеток периферической крови были изучены следующие три выборки. Первая выборка включала 25 коров, у которых РИД-мето-дом выявлено носительство вируса blv и гематологическим методом выявлена гематологическая стадия лейкоза. Вторую выборку составили 25 РИД-положительЕых животных, в периферической крови которых не
Таблица 1.. Изученные выборки крупного рогатого скота.
наблюдалось увеличения числа лимфоцитов. Контрольная выборка была представлена 25 здоровыми животными со стабильной РИД-отрицатель-ноя реакцией на протяжении нескольких лет (данные ветеринарной станции г. С.-Петербурга). Без коровы содержались з одинаковых условиях (совхоз "Красная славянка" Ленинградской обл.). Всего было изучено 58 быков и 227 коров.
В работе использованы субштаммы перевивной рабдомиоезркомы РА-2 крыс: РА-23 (высокий метастатический потенциал клеток (Каминская, Бахтин, 1989)), РА-24 (низкий метастатический потенциал (Гужова, Бахтин, 1988 )) и РА-22 ( повышенная терморезистентность клеток (Федорова и др, 1989 )). Клетки зсех субштаммов после внутривенного введения образует экспериментальные метастазы только в легких привитых животных. Свьпяе 95 экспериментальных метастазов РА-2 имєкут уницеллкхлярное происхождение (СтепзЕьян, Бахтин, 1980; Каминская, 1986), т.е. являются клоками.. Экспериментальные мета-
стазы (клоны) РА-2 получали введением суспензий одиночных опухолевых клеток в хвостовую вену крысам. После прививки клеток животных, предварительно усыпив ЭФироМ, декапитировали, вычленяли лёгкие и отпрепаровывали клоны. Для получения внутрибрюшинных (в/б) узлов миеломы sp 2го мышеи 1 млн. .клеток вводили внутрибрюшинно.
Частоту встречаемости клеток с микроядрами (ЧКМ) и частоту встречаемости клеток с хромосомными мостами (ЧКМс) в клеточных популяциях исследуемых опухолей определяли в мазках-отпечатках, для чего отпрепарованные клоны рабдомиосаркомы РА-2 крыс и в^б узлы миеломы sp г/о мышей разрезали пополам и получали от них отпечатки на предметных стеклах. Мазки-отпечатки Фиксировали 96%-ым этиловым спиртом, высушивали и окрашивали красителем Гимзы или Флуорохромом Хехст 33258. В каадом мазке-отпечатке анализировали по 200 - 1000 целых'клеток. Поврежденные клетки не учитывали. ЧКМ и ЧКМс выражали в процентах. Частоты патологических митозов определяли на препаратах, приготовленных таким же способом.
Схема, по которой проводили искусственные отборы по признаку "ЧКМ" ( РА-2 и sp^/o ) и признаку "ЧКМс" ( РА-2 ), представлена на рис. 1, Отпрепарованные клоны <в/б узлы) разрезали надвое, одну половину использовали для приготовления мазка, а другую помещали во Флакон со средой 199. В мазках от каждого клона (в^б узла) подсчитывали по 200-500 целых клеток. После определения ЧКМ (ЧКМс) отбирали клоны (в/б узлы) с минимальными и с максимальными для данной выборки показателями, получали из них суспензии клеток и взодили их внутривенно крысам (внутрибрюшинно мышам).
^М
Рис.1. Схема проведения искусственного отбора по признакам "частота клеток с микраядрами" и "частота клеток с хромосом ными мостами"
Частоты микроклеток в мазках-отпечатках вл5 узлов миеломы sp 2x0 мышеи определяли на 10 000 целых клеток в 3 000 полях зрения.
Содержание ДНК в популяциях клеток определяли методой проточной цитометрии суспензии клеток (1 млн. клеток в 1 мл) после окрашивания их бромистым зтидием и оливомицином (Розанов, 1988) совместно с Ю.М. Розановым и Н.В. Бычковой.
Для получения препэратов метаФазных хромосом приготовленную из опухолевых узлов клеточную суспензию инкубировали с колхицином при 37С, после чего готовили препараты стандартным способом. Для подсчета хромосом отбирали окрашенные по Гимза мета
Кинетохоры в микроядрэх клеток рзбдомиосарксмы РА-2 крыс и миеломы sp г/о мышеи определяли методом непрямой икмуноФлуоресцен-
ЦИИ ( Henning et al. . 1Э88).
Для оценки метастатического потенциала использовали величину КОЕ ( колонеобразующие единицы ) - число опухолевых узлов в легких привитых животных в пересчете на 100 тыс. внутривенно введенных жизнеспособных клеток ( Пелевина и др., 1978 ).
Коэффициент реализованной наследуемости ь2 признаков "ЧКМ" и "ЧКМс" определяли по отношению селекционного ответа Мышей и венозную гепаринизированную кровь облучали на установке РУМ-17 (ВМедА, С.-Петербург) тормозными Х-лучами в дозах 0,5; 1,0;1,5; 2,0 Gy, при мощности дозы 0,65 у/мин, во вращающихся кассетах, по 8 особей на дозу и пенициллиновых Флаконах, соответственно. Гематологические препараты периферической крови и костного мозга (из бедренной кости мышей и грудины коров) получали обычным способом. Мазки высушивали. Фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали красителем Гимзы. Частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, микроядрами и хромосомными мостами определяли в выборках из 500 лимфоцитов. Не учитывали малые лимфоциты и клетки с признаками дегенерации и повреждений. Препараты метаФазных хромосом человека получали путем культивирования ФГА-сткмулированшх лимфоцитов через 48 ч. Дифференциальное окрашивание метаФазных хромосом проводили по G-методу с использованием трипсина (Мзягрегор, Взрли, 1986). Препараты двуядерных лимфоцитов в цитохалазшовом блоке получали по методу, описаному Анкинои и соавторами (Анкина и др., 1991). Ядрышки в ядрах лимфоцитов выявляли окрашиванием ядрышковых организаторов нитратом серебра (Мамаев, 1980). Блоки гетерохроматина определяли в свежеприготовленных мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому, а блоки гетерохроматина в культивированных in vitro лимфоцитах - методом С-окра- ШИВаНИЯ С ИСПОЛЬЗОВаНИеМ ГИДрОКСИДа барИЯ (Sumner et al. . 1971). Локализацию центромерных сигналов, выявленных таїте, и тело-мерных сигналов, выявленных птс, в ядрах лимфоцитов человека проводили совместно с Ю.А.Логиновой с использованием неизотопнаго варианта ДВуХЦВеТНОЙ ФЛуОреСЦеНТНОИ ГИбрИДИЗаЦИИ in situ (Lichter et al. . 1992). Для статистической обработки данных использовали программы ДЛЯ IBM PC Microstat И Statgraph, МвТОДЫ ПарЗМЄТрИЧЄСК0Й И непараметрической статистики.