Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы Факторы, обеспечивающие эффективную терминацию трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и их взаимодействие 10
1.1. S. cerevisiae как объект генетики 10
1.2. Общие сведения о процессе трансляции у дрожжей S. cerevisiae
1.2.1. Состав рибосомы и регуляция синтеза компонентов рибосомы 16
1.2.2. Инициация трансляции 21
1.2.3. Элонгация трансляции 23
1.2.4. Терминация трансляции и рециклирование рибосом 25
1.2.5. Деградация РНК с преждевременным стоп-кодоном 26
1.3. Контроль эффективности терминации трансляции 28
1.3.1. Влияние последовательности и стабильности мРНК на вероятность считывания стоп-кодона 28
1.3.2. Роль тРНК в считывании стоп-кодонов 29
1.3.3. Роль рРНК и рибосомных белков в считывании стоп-кодонов 31
1.3.4. Влияние изменений в белках, принимающих участие в терминации трансляции, на эффективность этого процесса 32
1.3.5. Влияние белков, участвующих в других этапах трансляции, на терминацию трансляции 34
1.3.6. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодонов 34
1.4. Прионы дрожжей 36
1.4.1. Разнообразие и общие свойства прионов дрожжей 36
1.4.2. Связь [PSI+] с терминацией трансляции 41
1.4.3. [NSI+] и терминация трансляции 42
1.4.4. MOD5, [MOD+] и терминация трансляции 42
1.4.5. [ISP+] 43
1.5. Заключение 49
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Штаммы 51
2.2. Среды и методы культивирования 53
2.3. Методы генетики дрожжей 55
2.4. Методы микроскопии 55
2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.5.1. Выделение ДНК 56
2.5.2. Выделение РНК 57
2.5.3. Плазмиды, конструирование и проверка плазмид 57
2.5.4. ПЦР, обратная транскрипция и гибридизация ДНК 60
2.5.5. Электрофорез нуклеиновых кислот 61
2.5.6. Получение делеций генов с помощью гомологичной рекомбинации 62
2.5.7. Секвенирование ДНК 63
2.6. Методы работы с белками 63
2.6.1. Выделение белков 63
2.6.2. Определение активности кислой фосфатазы 64
2.7. Анализ данных 64
2.7.1. Статистические методы 64
2.7.2. Анализ данных ОТ-ПЦР-РВ 65
2.7.3. Анализ изображений 65
2.7.4. Обработка данных экспрессии генов, полученных при гибридизации с ДНК-микрочипом 66
2.7.5. Работа с последовательностями нуклеиновых кислот 66
Глава 3. Результаты 68
3.1. Общая характеристика особенностей фенотипа и генотипа штамма 25-25-2В-П3982 68
3.1.1. Проверка известных данных об особенностях генотипического фона 25-25-2В-П3982 70
3.1.2. Анализ новых данных об особенностях генотипического фона изучаемого штамма 72
3.2. Влияние сверхпродукции Q/N-богатых регуляторов
транскрипции на изменение фенотипа клонов с Isp– на Isp+ 76
3.2.1. Сверхпродукция Swi1p, но не других аспарагин-глутамин-богатых регуляторов транскрипции, увеличивает частоту появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp– 77
3.2.2. Влияние сверхпродукции Swi1p на частоту появления клонов Isp+ не связано с его агрегацией 79
3.2.3. Влияние сверхэкспрессии SWI1 на частоту появления клонов Isp+ не связано с изменением уровня мРНК SFP1 83
3.2.4. В потомстве трансформантов со сверхэкспрессией SWI1 появляются автодиплоидные клоны 84
3.3. Влияние Isp-статуса штамма и делеции гена SFP1 на экспрессию белок-кодирующих генов дрожжей 87
3.3.1. В клетках Isp+, в отличие от клеток sfp1, не снижена экспрессия мишеней Sfp1p 89
3.3.2. В клетках Isp+ не изменена транскрипция большинства генов биогенеза рибосом и генов рибосомных белков 90
3.3.3. Делеция гена CRF1 не влияет на проявление фенотипа Isp+ 92
3.3.4. Делеция и сверхэкспрессия гена RPS9A не влияют на проявление фенотипа Isp+ 94
3.3.5. Транскрипционные факторы, мишени которых различаются по уровню экспрессии в клонах Isp+ и Isp– 99
3.3.6. Функциональная классификация генов, экспрессия которых изменяется при делеции SFP1 или изменении фенотипа c Isp– на Isp+ 101
3.3.7. В клетках Isp+ активирована транскрипция генов белков клеточной стенки и генов, контролирующих импорт ионов железа 101
3.3.8. В клонах Isp– усилена экспрессия генов хромосом II и IX 103
3.4. Сравнительный анализ геномов клонов Isp+ и Isp– 105 3.4.1. Секвенирование геномов подтверждает данные о вариабельной копийности хромосом II и IX 105
3.4.2. Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp–1
3.5. Поиск связи между геном SFP1 и фенотипом Isp+ 110
3.6. Поиск связи между обработкой GuHCl и изменением кариотипа 112
3.7. Анализ отдельных генов, изменение числа копий которых может объяснять различие фенотипов Isp+ и Isp– 1
3.7.1. Введение дополнительной копии his7-1 улучшает рост клонов Isp+ на среде без гистидина 118
3.7.2. Доза гена sup45-400 не определяет различие фенотипов Isp+ и Isp– 118
3.7.3. Cверхэкспрессия некоторых генов тРНК и гена TEF2 увеличивает эффективность нонсенс-супрессии 122
Глава 4. Обсуждение 124
4.1. Фенотип Isp+ и его связь с уровнем экспрессии различных генов 124
4.2. Связь фенотипа Isp– и кариотипа клона 126
4.3. Идентичность штаммов, использованных различными исследователями в ходе изучения фенотипа Isp+ 131
4.4. Влияние GuHCl на появление клонов Isp– в потомстве клонов Isp+ 132
4.5. Участие гена SFP1 в изменении фенотипа с Isp– на Isp+ 134
4.6. Участие гена SWI1 в переходе от фенотипа Isp– к фенотипу Isp+ 138
4.7. Нестабильность кариотипа исследуемых штаммов 139
4.8. Заключение 141
Глава 5. Выводы 142
Список сокращений и условных обозначений 143
Список литературы
- Инициация трансляции
- Методы работы с нуклеиновыми кислотами
- Влияние сверхпродукции Swi1p на частоту появления клонов Isp+ не связано с его агрегацией
- Идентичность штаммов, использованных различными исследователями в ходе изучения фенотипа Isp+
Инициация трансляции
Дрожжи S. cerevisiae являются очень хорошо изученным модельным объектом клеточной биологии и генетики (см. Botstein, Fink, 2011). Как пишет Карл Линдегрен (Carl C. Lindegren), изучение дрожжевой клетки началось с постулированием клеточной теории, то есть с восьмидесятых годов XIX века. В первой половине XX века, когда была выявлена плоидность клеток, началось изучение генетики дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. Lindegren, 1949). К середине XX века было картировано несколько десятков генов и описан жизненный цикл дрожжей. Изученные признаки относились как к макроскопическим свойствам колоний (цвет, структура), так и к физиологическим свойствам штаммов (способность или неспособность расти при отсутствии в питательной среде определённых веществ); кроме того, был получен ряд как спонтанных, так и индуцированных мутантов (Lindegren, 1949). Вскоре после появления методов секвенирования ДНК Фредерика Сенгера (Sanger, Coulson, 1975; Sanger et al., 1977), а также Аллана Максама и Уолтера Гилберта (Maxam, Gilbert, 1977) появились первые последовательности дрожжевых генов, среди которых были гены рибосомных РНК (Valenzuela et al., 1977; Rubtsov et al., 1980), а позже и консервативные белок-кодирующие гены, например, актин (Gallwitz, Sures, 1980). Примерно в то же время были изучены группы сцепления, включающие уже известные гены, и сделан вывод о наличии у S. cerevisiae шестнадцати хромосом (см. Инге-Вечтомов, Карпова, 1993; Duina et al., 2014). Этот вывод был впоследствии подтверждён с помощью метода пульс-электрофореза, основанного на разделении молекул ДНК большой длины (порядка десятков тысяч пар оснований или более) в агарозном геле с помощью периодической смены направления электрического поля. Следует отметить, что традиционные цитологические методы не слишком удобны в работе с S. cerevisiae, поскольку этот организм обладает сравнительно небольшими хромосомами, и это затрудняет их микроскопический анализ (см. Инге-Вечтомов, Карпова, 1993). К 1992 году число известных генов дрожжей составляло уже около тысячи (см. Goffeau et al., 1996).
Сравнительно небольшой размер генома и хорошая изученность стали причиной того, что геном S. cerevisiae стал первым полностью отсеквенированным геномом эукариотического организма. Последовательности каждой из 16 дрожжевых хромосом и митохондриального генома штамма S288C были определены совместными усилиями нескольких лабораторий; статьи выходили в период с 1992 по 1998 гг. Эти последовательности до сих пор являются отправной точкой (референсом) для большинства исследований генома дрожжей и сохранены в базе данных дрожжевого генома (Saccharomyces Genome Database, yeastgenome.org) в почти неизменном виде, если не считать некоторых уточнений, связанных, в частности, с тем, что разные научные группы использовали разные производные штамма S288C (Engel et al., 2014).
При секвенировании генома было выявлено 6275 открытых рамок считывания (ORF), которые могут кодировать белки длиной не менее 99 аминокислот, а также несколько сотен генов, предположительно кодирующих РНК (Goffeau et al., 1996). Впоследствии существование большинства этих генов было подтверждено экспериментально. Сейчас в базе данных дрожжевого генома указаны 5133 подтверждённых ORF (http://yeastgenome.org/genomesnapshot по состоянию на август 2016). Кроме того, секвенирование позволило выявить ряд интересных особенностей генома S. cerevisiae, таких как малое количество ORF с интронами (не более 4%) и событие полной дупликации генома, вероятно, имевшее место в эволюционной истории вида (Goffeau et al., 1996). Более подробное изучение этого вопроса позволило найти 55 дуплицированных участков, включающих 376 пар генов-паралогов (Wolfe, Shields, 1997), а недавно было высказано предположение, что дупликация генома следовала за спариванием клеток, принадлежащих к разным видам, и была необходима для восстановления фертильности (см. Wolfe, 2015).
Сейчас известны последовательности генома нескольких сотен штаммов дрожжей (Wei et al, 2007; Raiser, Kiml, 2012; Bergstrom et al, 2014; Song et al, 2015; Strope et al, 2015 и другие работы), и это число постоянно увеличивается. К сожалению, качество как исходных данных, так и их обработки не всегда высоко и сильно варьирует в зависимости от возможностей и целей авторов каждого исследования. В некоторых исследованиях, целью которых было выявление эволюционных связей между разными (природными и лабораторными) штаммами дрожжей (Liti et al, 2009; Bergstrom et al, 2014), авторы отдали предпочтение количеству данных в ущерб качеству анализа индивидуальных образцов и пользовались сложными статистическими методами анализа для предсказания настоящих последовательностей при объединении нескольких образцов, полученных из родственных штаммов.
Тем не менее, накопленные в результате секвенирования большого числа штаммов данные позволили утверждать, что число однонуклеотидных замен, отличающих штаммы S. cerevisiae друг от друга, относительно невелико по сравнению с близкими видами (Bergstrom et al, 2014), а также дали возможность высказать гипотезу о том, что эти различия могут быть связаны с тем, что разнообразие геномов разных штаммов S. cerevisiae создаётся в большей степени не за счёт нуклеотидных замен, а за счёт хромосомных перестроек (Bergstrom et al, 2014). Хотя эта гипотеза нуждается в дополнительной проверке, из имеющихся данных следует не менее двух важных выводов. Во-первых, относительно небольшое разнообразие последовательностей генов оправдывает использование плазмид, полученных из геномной ДНК одного штамма, для исследования мутаций в неродственном штамме. Во-вторых, относительно высокая частота хромосомных перестроек может объяснять существование репродуктивного барьера между некоторыми штаммами.
Методы работы с нуклеиновыми кислотами
Плазмида pRS426-MOT3 получена клонированием фрагмента, ограниченного сайтами рестрикции XhoI и BamHI, из pCH2 (Hongay et al., 2002) в pRS426 по тем же сайтам (Т.М. Рогоза, неопубликованные данные). Плаз-мида p426GPD-YFP получена обработкой p426GPDSWI1YFP эндонуклеаза-ми рестрикции SpeI и SmaI с последующей обработкой фрагментом Клёно-ва для разрушения выступающих однонитевых фрагментов и лигированием (П.В. Липаева, неопубликованные данные). Плазмида pRS425-sup45-400 получена клонированием участка, ограниченного сайтами рестрикции PstI и NotI, из pGRS45-sup45-400 в pRS425. Плазмида p426GPD-RPS9A получена клонированием ПЦР-продукта RPS9A, полученного на матрице геномной ДНК с помощью праймеров RPS9A-F-XmaJI и RPS9A-R-XhoI и обработанного эндонуклеазами рестрикции XmaJI и XhoI, в вектор pRS426, обработанный эндонуклеазами рестрикции BcuI и XhoI. Плазмида pRS316-his7-1,6 получена клонированием ПЦР-продукта (использованы праймеры HIS7_F_HindIII_ и HIS7_R_HindIII_), обработанного эндонуклеазой рестрикции HindIII, в вектор pRS316, вскрытый тем же ферментом. В обоих случаях в качестве источника геномной ДНК использовали штамм 25-25-2В-П3982.
Рестрикцию проводили с использованием ферментов производства Thermo Scientific в концентрации 1 единица активности на 10 мкл реакционной смеси и рекомендованных производителем буферных растворов. Для лигирования использовали лигазу фага T4 (Thermo Scientific) согласно указаниям производителя. После трансформации бактерий лигазной смесью колонии, содержащие искомую плазмиду, отбирали с помощью электрофореза грубого лизата бактериальных клеток (Barnes, 1977) и/или ПЦР с колонии (http://blog.addgene.org/ plasmids-101-colony-pcr). Затем плазмиды проверяли с помощью рестрикции и ПЦР, а последовательность вставки в сконструированных в этой работе плаз-мидах дополнительно проверяли секвенированием. Секвенирование проводили сотрудники ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».
Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали полимеразу Taq (Сибэнзим или Fermentas) в количестве 0,5 единиц активности на 10 мкл реакционной смеси, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (Синтол) в концентрации по 2 мМ, 10x буферный раствор (Сибэнзим) и праймеры (Бигль) в количестве 1,5 пМ на 10 мкл смеси. Если в качестве матрицы использовали геномную ДНК, использовали смесь полимераз Taq и hot start Taq (Сибэнзим). Праймеры, использованные в данной работе, приведены в приложении А. Оптимальную температуру отжига праймеров определяли экспериментально. Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы RevertAid (Thermo Scientific) согласно инструкции производителя. Для последующей количественной ПЦР в режиме реального времени использовали либо 2x реакционную смесь iQ SybrGreen Super Mix (Bio-Rad) (при изучении экспрессии гена RPS9B), либо 2,5х реакционную смесь с красителем EVA Green (Синтол) (во всех остальных случаях); праймеры в количестве по 8 пМ на 20 мкл реакционной смеси; 0,5 мкл полученной на предыдущем этапе реакционной смеси с кДНК; оптически прозрачные пробирки (Bio-Rad) и амплификатор CFX96 (Bio-Rad; Ресурсный центр СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»).
Мечение РНК, гибридизацию полученной кДНК с ДНК-микрочипами Yeast gene expression microarray 8 x 15K (Agilent), а также компьютерную обработку изображений проводили сотрудники Института прикладных наук г. Тулуза (Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse).
Мечение ДНК с использованием нуклеотидов Cy3-UTP (для опытной ДНК) или Cy5-UTP (для контрольной ДНК), а также гибридизацию полученной меченой ДНК с ДНК-микрочипом проводили согласно опубликованной методике (Zhang et al., 2013). В качестве контроля была использована геномная ДНК штамма PSL2 (Lee et al., 2009), любезно предоставленная М. Доминска (университет Дьюка), или геномная ДНК изолята p1 (см. 3.1). Эти эксперименты проводили в лаборатории Томаса Питеса (Thomas D. Petes) в университете Дьюка (Duke University).
Электрофорез плазмидной ДНК и ПЦР-продуктов в агарозном геле проводили согласно стандартным методикам (Sambrook et al., 1989) с использованием 1x или 0,5x буфера TBE; после окончания электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия и фотографировали с помощью цифровой видеокамеры Canon PowerShot G12. Качество РНК контролировали с помощью электрофореза в агарозном геле (1,2% агароза в буфере TAE) по наличию полос, соответствующих 18S и 26S рРНК. Электрофорез геномной ДНК дрожжей в пульсирующем поле проводили согласно опубликованной методике (Zhang et al., 2013). Экспе рименты, связанные с электрофорезом в пульсирующем поле, также проводили в лаборатории Томаса Питеса.
Делеции генов получали с помощью ПЦР согласно опубликованной методике (Wach et al., 1994): на матрице плазмиды pFA6-kanMX4 или pAG32 синтезировали гибридный ПЦР-продукт, который включал кассету kanMX4 или hphMX4 и участки, фланкирующие изучаемый ген в геномной ДНК (по 50 п.н.). Эти кассеты включают промотор и терминатор гена TEF Ashbya gossipii, контролирующие экспрессию гена kanR или hph и обеспечивающие устойчивость к генетицину (G418) или гигромицину Б соответственно. Полученным ПЦР-про-дуктом трансформировали дрожжевые клетки. Для проверки корректности интеграции кассеты из полученных клонов выделяли ДНК, которую использовали для ПЦР. При получении делеции HSP104 проверку осуществляли с помощью ПЦР с фланкирующими область замены праймерами Hsp104_F1 и Hsp104_R1 (праймеры 1 + 4 на рис. 2.1), поскольку длина гена HSP104 (около 2,7 т.п. н.) значительно превышает длину кассеты hphMX4 (около 1,5 т.п.н.). При получении делеции RPS9A или CRF1 ПЦР проводили, используя в качестве прямого праймера праймер, комплементарный последовательности ORF исследуемого гена (праймер 2 на рис. 2.1) или последовательности ORF гена устойчивости к антибиотику (праймер 3 на рис. 2.1); в случае корректной замены последовательности ожидали наличия ПЦР-продукта при использовании праймеров 3+4 и отсутствия продукта при использовании праймеров 2+4, а в случае наличия гена дикого типа — обратной ситуации. Последовательности праймеров приведены в прил. А.
Влияние сверхпродукции Swi1p на частоту появления клонов Isp+ не связано с его агрегацией
Часть экспериментов, описанных в этом разделе, проведена совместно с Т. М. Рогозой. Все эксперименты проводили по одному и тому же общему плану: трансформировали изолят Isp–, отбирали не менее 75 независимых трансформантов каждой из плазмид, после чего проверяли фенотип на средах, одновременно обеспечивающих поддержание плазмиды (не содержащих урацила или лейцина в зависимости от использованного плазмидного вектора) и позволяющих оценить эффективность нонсенс-супрессии (не содержащих гистидина или лизина). Впоследствии клоны, изменившие фенотип на His–Lys–, трижды пассировали на полной среде, а затем переносили на селективные среды без урацила или лейцина, позволяющие оценивать наличие плазмиды, а также без гистидина или лизина для оценки эффективности супрессии каждой из маркерных мутаций his7-1 и lys2-87 соответственно. Клоны, которые потеряли плазми-ду (фенотип Ura– или Leu–) и обладали несупрессорным фенотипом (His–Lys–), учитывали как клоны Isp+. В случае, если оценка супрессорного фенотипа была затруднена или потери плазмиды добиться не удавалось, полученные изоляты сеяли истощающим штрихом с целью получения отдельных колоний и аналогичным образом переносили на селективные среды. Если более половины колоний соответствовали выдвинутым критериям, клон учитывали как Isp+.
Следует отметить, что разные изоляты Isp– существенно отличаются по частоте спонтанного выщепления клонов фенотипа Isp+ в потомстве трансформантов (от полного отсутствия до 50%), причём эта частота возрастает в течение культивирования из-за того, что спонтанно возникшие клетки Isp+ делятся быстрее. По этой причине в каждом эксперименте отдельно оценивали число клонов, спонтанно приобретших фенотип Isp+ после трансформации контрольной плаз-мидой. Если доля таких клонов превышала 25%, результаты эксперимента далее не учитывали. Полученные данные (табл. 3.3) свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия SWI1, подобно сверхэкспрессии SFP1, приводит к статистически значимому увеличению частоты появления клонов Isp+. Для остальных изученных Q/N-богатых белков такого эффекта не обнаружили (табл. 3.3), хотя различие конструкций, использованных для сверхэкспрессии разных генов, не позволяет нам непосредственно сравнивать эти эксперименты и, соответственно, сделать уверенный вывод об отсутствии влияния других изученных белков.
Для проверки первых двух предположений достаточно проверить, сохраняется ли эффект в условиях заведомого отсутствия приона [SWI+] и вообще агрегации белка Swi1-YFP. Для этого провели две серии экспериментов.
Известно, что для поддержания приона [SWI+], как и большинства других прионов, необходим шаперон Hsp104 (Du et al., 2008), в то время как детерминант [ISP+] способен поддерживаться в отсутствие Hsp104 (Volkov et al., 2002), а в клетках с делецией HSP104 можно индуцировать возникновение [ISP+] с помощью сверхэкспрессии SFP1 (Rogoza et al., 2010). Мы инактивировали ген HSP104 с помощью замены его последовательности на последовательность, обеспечивающую устойчивость к гигромицину B, в изоляте Isp– (m3). Корректность изменения генома у отобранных на среде с гигромицином B клонов проверяли с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими ген HSP104: в случае замены HSP104 ожидали появления продукта меньшего молекулярного веса. Отобранный штамм (обозначен (1) на рис. 3.6) удовлетворял этому требованию и сохранил фенотип Isp–. (V (2)
Тем не менее, возможно, что на изучаемый феномен влияет возникновение неприонных агрегатов белка Swi1. Присутствие в использованной конструкции YFP позволило нам изучить внутриклеточное расположение Swi-YFP (рис. 3.7) в клетках Isp–. В части клеток мы наблюдали яркие фокусы флуоресценции неправильной формы (рис. 3.7, левая панель), что согласуется с известными данными (Du et al., 2008). В литературе также описана конструкция SWI1QC, кодирующая белок Swi1, лишённый N-концевого аспарагин-богатого участка. Эта конструкция функциональна, поскольку компенсирует отсутствие SWI1 в геноме, но продуцируемый белок не образует агрегатов (Du et al., 2010). Мы воспользовались плазмидой, кодирующей SWI1QC-YFP под контролем GPD-промотора, и выяснили, что в большинстве клеток Isp– сигнал на канале YFP зарегистрирован не был, а в случае наличия сигнала он был менее интенсивным, чем при трансформации плазмидой с полноразмерным геном SWI1-YFP (рис. 3.7, правая панель).
Тем не менее, оказалось, что сверхэкспрессия (SWI1QC-YFP) приводит к увеличению частоты возникновения клеток Isp+ в потомстве трансформантов, подобно сверхэкспрессии SWI1-YFP и SFP1. Мы сравнили частоты возникновения клонов Isp+ при сверхэкспрессии разных генов, используя 6 различных изо-лятов Isp . Для анализа полученных данных (табл. 3.5) применили обобщённую линейную модель, в которой независимой переменной являлся фактор «ген», а зависимой — соотношение клонов Isp+ и Isp после сверхэкспрессии этого гена. Все уровни фактора оказывали статистически значимое влияние на изучаемый признак, то есть отличались от влияния сверхэкспрессии гена YFP ( 0,001). Для сравнения влияния разных генов применили метод апостериорного анализа Тьюки, который показал, что влияние сверхэкспрессии SFP1 статистически значимо выше, чем SWI1-YFP ( 0,05) и SWI1QC-YFP ( 0,01), а влияние SWI1-YFP и его укороченного варианта статистически значимо не различается.
В случае сверхэкспрессии YFP проанализировано по 75 независимых трансформантов для каждого изолята; в случае остальных конструкций — по 78 независимых трансформантов.
Наконец, для дополнительной проверки предположения о взаимодействии белков Swi1-YFP и Sfp1 воспользовались известными данными о преимущественно ядерном расположении агрегатов Sfp1p (Rogoza et al., 2010). Ядра клеток, экспрессирующих SWI1-YFP, окрашивали DAPI, после чего сравнивали области свечения YFP и DAPI. Из 47 клеток, в которых был зарегистрирован чётко локализованный сигнал на обоих каналах, области флуоресценции пересекались только в 2 и не пересекались в остальных 45 случаях (типичный пример показан на рис. 3.8).
Идентичность штаммов, использованных различными исследователями в ходе изучения фенотипа Isp+
Анеуплоидия изолята m2 (Isp–), а точнее его дисомия по хромосомам II и IX, показана различными способами, и все эти методы дали сходный результат. Тем не менее, данные по экспрессии генов и данные полногеномного секвениро-вания были получены только для одного изолята Isp–, и потому могли свидетельствовать лишь о том, что в процессе культивирования, приведшем к получению изолята m2, была отобрана относительно устойчивая фенокопия штамма [isp-], а дополнительные хромосомы II и IX могли быть или не быть связаны с особенностями фенотипа. Для того чтобы показать связь кариотипа и фенотипа, мы воспроизвели событие изменения фенотипа, то есть отобрали в потомстве клонов Isp+ клоны Isp– и наоборот (см. рис. 3.25). Для последующего анализа кариотипа мы использовали ДНК клонов двух различных фенотипов (Isp+ и Isp–), однако наблюдали не менее пяти вариантов кариотипа: эуплоидный, дополнительная хромосома II, дополнительные хромосомы II и IX, дополнительная хромосома IX или дополнительная хромосома XIV (см. рис. 3.25). Поскольку хорошая изученность генома S. cerevisiae позволяет очертить круг генов, дуплицированных в каждом случае, для удобства на рис. 4.2 показана хромосомная локализация некоторых упомянутых в работе генов.
Хромосомное расположение некоторых генов, упомянутых в работе. Хромосомы упорядочены по длине. Красным цветом выделены хромосомы, дисомию по которым наблюдали в изученных штаммах.
Наиболее важным результатом стала абсолютная корреляция копийности хромосомы II и фенотипа соответствующего клона: все изученные клоны Isp+ обладали нормальной копийностью хромосомы II, а все изученные клоны Isp– оказались дисомиками по этой хромосоме (см. рис. 3.25). Несомненно, корреляция далеко не всегда основана на причинно-следственной взаимосвязи, однако мы наблюдали именно переход от одного фенотипа к другому (появление клонов одного фенотипа в митотическом потомстве клонов другого фенотипа) и выявили, что этот переход сопровождается специфическим изменением кариотипа.
Чем может быть обусловлено изменение фенотипа при появлении дополнительной хромосомы II? Следует отметить, что маркеры нонсенс-супрессии, то есть супрессируемые нонсенс-мутации his7-1 и lys2-87, расположены на этой хромосоме, в то время как ещё одна супрессируемая нонсенс-мутация, ade1-14, расположена на хромосоме I. В то время как штаммы Isp+ и Isp– различаются по эффективности роста на средах без гистидина и лизина, они не различаются по эффективности роста на среде без аденина (см. рис. 3.2). lys2-87 и ade1-14 являются нонсенс-мутациями одного типа (UGA, опал), и эффективность их супрессии в клонах Isp– сходна (рис. 3.2); тем не менее, фактор [ISP+] регулирует их различным образом. Это различие можно объяснить показанным нами увеличением дозы гена lys2-87 при неизменной дозе гена ade1-14.
Мы показали, что введение дополнительной копии his7-1 действительно приводит к улучшению роста клонов Isp+ на среде без гистидина (рис. 3.32), и предполагаем, что в регуляции роста на среде без лизина задействован аналогичный механизм. Тем не менее, дополнительной копии his7-1 оказалось недостаточно для того, чтобы воспроизвести фенотип Isp–. Мы предполагаем, что свой вклад вносят и другие гены хромосомы II; конечно, нельзя также исключить, что случайно отобранная миссенс-мутация во вносимой на плазмиде аллели his7 снижает стабильность или активность фермента His7p.
Кроме самих генов HIS7 и LYS2, на хромосоме II расположены более 450 белок-кодирующих генов, в том числе не менее 7 генов, связанных с трансляцией, и 13 генов тРНК. Ранее показано, что мутация в гене SUP45 необходима для проявления фенотипа Isp+ (Аксенова и др., 2006), однако совокупность данных, полученных ранее и в данной работе, позволяет утверждать, что дополнительная копия аллели sup45-400 не определяет супрессорный фенотип клонов Isp–. Зато мы обнаружили аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии TEF2 и генов естественных супрессорных тРНК tQ(UUG)L и tC(GCA)B (см. рис. 3.38) и предполагаем, что фенотип Isp– создаётся за счёт совместного действия дупликации генов his7-1 или lys2-87, TEF2 и, возможно, усиливается из-за дупликации генов супрессорных тРНК.
Таким образом, наши данные показывают, что смена фенотипа с Isp+ на Isp– (повышение эффективности супрессии мутаций his7-1 и lys2-87) детерминирована появлением дополнительной хромосомы II, а обратный переход — потерей этой дополнительной хромосомы.
Нельзя также исключить возможность участия других хромосом в модуляции исследуемого фенотипа. В частности, интересной представляется разница в интенсивности роста на среде без гистидина двух клонов Isp–, m1 и m2 (рис. 3.32), которые на уровне кариотипа отличаются копийностью хромосомы IX (см. 3.25). Наших данных недостаточно для того, чтобы подтвердить или опровергнуть гипотезу о влиянии копийности хромосомы IX на эффективность роста на среде без гистидина, однако такую вероятность нельзя исключить. мРНК, несущая мутацию his7-1, является субстратом NMD (Chabelskaya et al., 2007), однако ни один из основных генов, участвующих в этом процессе, не расположен на хромосоме IX. Нельзя забывать также, что мы регистрируем уровень функционального белка His7 по росту штамма на среде без гисти-дина, что лишь косвенно отражает активность His7p через концентрацию ги-стидина. В пути биосинтеза L-гистидина из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата 9 реакций, кодируемых 7-ю ферментами (см. Rebora et al., 2005). His7p катализирует шестую реакцию, субстратом для которой является фосфорибозилформи-мино-5-аминоимидазол-4-карбоксамидриботидфосфат, синтезируемый при участии фермента His6, кодируемого геном хромосомы IX (рис. 4.2). Нельзя исключить, что конечный выход гистидина может регулироваться и числом копий HIS6.