Введение к работе
Актуальность проблемы. Фиксация азота в клубеньках бобовых растений (сем. Fabaceae) яшіяется одним из важнейших процессов, обеспечивающих использование азота живыми организмами. Знание молекулярно-генетических механизмов этого процесса позволит создать эффективные системы азотфиксации.
Одной из первостепенных задач в исследованиях симбиотической азотфиксации является выяснение системы генетического контроля бобово-ризобиального симбиоза со стороны высшего растения. Детальное знание этой системы не только позволит понять тонкие механизмы взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями, но и значительно облегчит селекцию сортов бобовых растений и комплементарных штаммов ризобий, способных формировать высокоэффективные симбиотические системы.
Интенсивное изучение генетического контроля бобово-ризобиального симбиоза со стороны растения-хозяина началось лишь в течение последних 10-15 лет, благодаря широкому применению экспериментального мутагенеза. В исследованиях по выявлению симбиотических генов макросимбионта были использованы более 10 видов бобовых растений (Phillips, Teuber, 1992). Наибольший прогресс в идентификации симбиотических генов был достигнут для одного из наиболее изученных генетических объектов - гороха посевного (Pisum sativum L.), для которого на сегодняшний день было выявлено около 30 таких генов (Sagan et al., 1995). Большинство из них контролируют ранние стадии развития симбиоза (Weeden, LaRue, 1992). В то же время, генетический контроль ряда поздних стадий развития симбиоза (гены, контролирующие эти стадии, типы их взаимодействия и последовательность функционирования), связанных с формированием инфекционных нитей и дифференцировкой симбиосом, оставался малоизученным. Поэтому главной задачей данной работы являлся генетический анализ контроля данных стадий развития бобово-ризобиального симбиоза со стороны макросимбионта.
Данная работа финансировалась Международным проектом "Интербиоазот-2000", ГНТП "Приоритетные направления генетики", РФФИ (гранты 95-04-12573, 96-04-50361, 97-04-50033), Международным научным фондом - ISF (гранты #R6K00O, #R6K300), Научным департаментом НАТО (гранты HTECH.LG 941297 и 971210), грантом фонда Фольксваген (1/72 935), Соросовскими стипендиями 1995-1997 гг. (гранты а193-б, а96-14, а97-730), стипендией Мэрии С.-Петербурга 1997 г. (грант М97-2.4К-814). Цель и ??»ддчи исследования. Целью данной работы являлось выявление, анализ взаимодействия и последовательности функционирования симбиотических генов в процессе развития клубеньков.
Конкретными задачами данной работы являлись: 1. Выявление новых генов гороха (Pisum sativum L.), контролирующих становление азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями на различных стадиях, с
2 использованием естественной изменчивости по симбиотическим признакам, экспериментального мутагенеза и гибридологического анализа;
2. Фенотипичсская характеристика вновь полученных симбиотических мутантов и
идентификация стадий развития симбиоза, контролируемых выявленными генами;
-
Локализация новых симбиотических генов гороха на генетической карте.
-
Создание двойных мутантных линий с последующей фенотипическои характеристикой для анализа типов взаимодействия и последовательности функционирования симбиотических генов, контролирующих близкие стадии развития.
Научная новизва. С использованием ЭМС-мутагенеза линии SGE получено 8 новых Nod", 2 Nod+/" и 14 Fix" симбиотических мутантов гороха. Показано, что мутанты SGENod'-l, SGENod"-3, SGEFix'-l и SGEFix"-2 характеризуются новыми, неизвестными ранее для гороха фенотипами: 1) блок инициации роста инфекционных нитей и массовые скручивания корневых волосков у SGENod"-l и SGENod"-3, 2) гипертрофированные инфекционные нити и аномалии инфекционных капель" у SGEFix'-l и 3) запертые" инфекционные нити и отсутствие эндоцитоза у SGEFbr-2. Анализ фенотипов Nod" и Fix" мутантов, индуцированных на линии SGE показал сложный генетический контроль процесса развития инфекционной нити со стороны растения, который должен быть разделен на 5 стадий: 1) инициация роста инфекционных нитей, 2) развитие инфекционной нити в корневом волоске, 3) последующее ее развитие в кортексе корня, 4) завершающее развитие в тканях молодого клубенька, 5) формирование инфекционных капель. Также впервые для Fix" мутантов бобовых было показано наличие температурозависимости проявления мутаций линий SGEFix"-1 и SGEFix"-2. Генетический анализ показал, что мутации у линий SGEFix"-1 и SGEFix"-2 произошли в ранее неизвестных симбиотических генах гороха. Впервые на генетической карте гороха были локализованы симбиотические локусы sym-27 и sym-Z, причем с использованием локуса sym-Z впервые была доказана целостность группы сцепления IB. Впервые для гороха были созданы линии, несущие в одном генотипе 2 рецессивные Fix" мутации. Фенотшшческий анализ двойных мутантных линий RBT, RBT2 и RBT3 впервые позволил доказать порядок функционирования пар симбиотических генов Sym-ЗІ и Sym-13, Sym-Yn Sym-13 и Sym-Z и Sym-Y.
Практическая значимость. Картированные локусы sym-Z и sym-27 могут служить новыми маркерами генетической карты гороха и использованы для тонкого картирования районов, их содержащих. Использование комбинаций одиночных и двойных мутантных линий позволит выявить молекулярные и биохимические маркеры различных стадий развития бобово-ризобиального симбиоза. Nod", Fix" мутанты и исходные линии могут быть использованы как модели для изучения роли симбиотрофного типа питания азотом в структуре урожая гороха.
Апробация работы. Основные результаты данной работы были представлены на X и XI Международных конгрессах по азотфиксации (С.-Петербург, 1995, Париж, 1997); I и II
Европейских конференциях по азотфиксации (Сегед, 1994 и Познань, 1996); на 1-ом съезде
ВОГИС (Саратов, 1994); 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995); на
конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и
ветеринарии" (Москва, 1996); на IV Германо-российском рабочем совещании по
биотехнологии (С.-Петербург, 1996); на 2-ой Международной конференции по анатомии и
морфологии растений (С.-Петербург, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка
литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 19
таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает наименований.