Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 10
1.1. Морфо-физиологические особенности и распространение представителей рода Pisum.
1.2. Проблемы таксономии рода Pisum. 12
1.3. Таксономические проблемы трибы Fabeae . 17
1.4. Оценка генетической вариабельности P. sativum. 19
1.5. Характеристика генома рода Pisum. 23
1.6. Строение цитоплазматических геномов P. sativum и родственных видов 31 Fabeae.
Глава 2. Материалы и методы. 35
2.1.Растительный материал. 35
2.2. Выделение растительной ДНК и РНК . 45
2.3. Проведение мультилокусного анализа. 45
2.4. Амплификация и секвенирование участков ядерного и цитоплазматических геномов.
2.5. Проведение РВ-ПЦР. 49
Глава 3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Оценка полиморфизма ядерного генома рода Pisum методами мультилокусного анализа.
3.1.1. Анализ ядерного генома представителей рода Pisum методом мультилокусного AFLP маркирования
3.1.2. Оценка полиморфизма семейства генов резистентности рода P. sativum методом мультилокусного RGA анализа .
3.2 Анализ вариабельности участков ядерного и цитоплазматических геномов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.
3.2.1. Анализ полиморфизма последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2 у рода Pisum и родственных видов Fabeae.
3.2.2. Анализ вариабельности хлоропластного генома у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae .
3.2.3. Комбинированный кластерный анализ на основе последовательностей ядерного и хлоропластного геномов представителей трибы Fabeae
3.2.4. Анализ последовательности b/c интрона митохондриального гена nad1 у образцов рода Pisum и родственных родов трибы Fabeae.
3.3. Идентификация, анализ полиморфизма и изучение экспрессии гена сахарозосинтазы (Sus1) у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.
Заключение 117
Выводы 120
Список сокращений 122
Список литературы
- Таксономические проблемы трибы Fabeae
- Выделение растительной ДНК и РНК
- Оценка полиморфизма семейства генов резистентности рода P. sativum методом мультилокусного RGA анализа
- Анализ вариабельности хлоропластного генома у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae
Таксономические проблемы трибы Fabeae
Род Pisum (Горох) является одним из пяти родов трибы трибы Fabeae (сем Fabaceae) Среди представителей рода есть как однолетние, так и двулетние и многолетние виды (Говоров, 1937; Макашева, 1962, 1975). При этом выделяемые виды, подвиды и разновидности имеют схожее морфологическое строение, за исключением некоторых особенностей (Макашева, 1962,1975).
Горох является самоопыляемой культурой, при этом опыление происходит в закрытом цветке. При неблагоприятных условиях (например, при сухой и жаркой погоде) может происходить перекрестное опыление, в этом случае опыление происходит в основном благодаря пчелам и некоторым другим насекомым. Подвиды и более таксоны рода Pisum более низкого ранга, как правило, различаются сочетанием морфологических признаков (форма листочков, толщина и длина стебля, его разветвленность, наличие антоциановой окраски, цвет и рисунок семян, восковой налет и др). Например, отличительной особенностью вида P. abyssinicum является наличие зубчатого края у листочков и прилистников, а вид P. elatius имеет более длинные стебель и междоузлия по сравнению с другими представителями Pisum (Фёдоров, 1975; Макашева, 1979).
Естественный ареал P.sativum простирается от Ирана и Туркменистана через Переднюю Азию, северную Африку и южную Европу (Макашева, 1979; Maxted, Ambrose, 2000; Maxted et al., 2010). Однако из-за раннего культивирования ( 10- 11 тыс. лет) крайне сложно определить точное местонахождение центра его разнообразия, особенно учитывая, что значительная часть Средиземноморского региона и Ближнего Востока была существенно изменена деятельностью человека и меняющимися климатическими условиями (Maxted et al., 2010).
Другой вид, P. elatius (горох высокий), распространен преимущественно в Средиземноморье, Средней Азии, на побережье Крыма и Кавказа. Ареал распространения P. abyssinicum (горох абиссинский) ограничен горными регионами Йемена и Эфиопии, и вероятно был одомашнен независимо от P. sativum (Vershinin et al., 2003). Этот вид гороха отличается исключительно коротким вегетационным периодом. Известны в основном культивируемые формы, в дикорастущем состоянии встречается редко, в основном на высоте 2000 м над уровнем моря в Эфиопии и на Аравийском полуострове.
Горох сирийский (P. syriacum = P.sativum ssp. syriacum) произрастает преимущественно в степных районах и скалистых склонах в странах Передней Азии. Горох транскавказский (P. transcaucasicum = P.sativum ssp. transcaucasicum) включает эндемичные формы Закавказья и Поволжья. Горох азиатский (P. asiaticum = P.sativum ssp. asiaticum) культивируется в основном в Передней, Центральной и Юго-Западной Азии. Является одним из примитивных возделываемых видов.
Природные образцы вида P. fulvum были найдены в Иордании, Сирии, Ливане и Израиле (Макашева, 1979)
Горох красивый (Pisum formosum), первоначально отнесенный рядом авторов к роду Pisum, в настоящее время выделен в монотипный род Vavilovia (V. formosa). Данный вид имеет схожее морфологическое строение с остальными представителями рода Pisum, но, в отличие от остальных видов гороха, растение является многолетним, имеет длинное корневище, тонкие стебли приподнимаются над почвой на 5 – 15 см. Прилистники очень узкие, полуовально-стреловидные, острые, в несколько раз мельче листочков. Листья не имеют усиков, а непарный верхний листочек превращен в острие. Цветоносы вдвое длиннее листьев, имеют один, реже два цветка. Цветки по сравнению с другими частями растения крупные.
Еще одной особенностью P. formosum является его ареал произрастания: представители вида встречаются только на высоте 2700 – 3500 м над уровнем моря в горах на каменистых осыпях, в субальпийской и альпийской зонах Кавказа, в Иране, в восточном нагорье Малой Азии. Этот вид представляет исключительный интерес для раскрытия эволюции всего рода как единственный многолетний представитель гороха, находящийся на грани исчезновения. При этом данный вид так и не удалось культивировать в лабораторных условиях. 1.2. Проблемы таксономии рода Pisum.
Помимо сельскохозяйственного значения, горох не одну сотню лет является предметом многочисленных исследований еще со времен опытов Грегора Менделя. Именно на горохе были открыты законы наследственности, положившие начало генетике как науке.
Несмотря на столь незначительное число таксономических единиц рода Pisum, среди систематиков до сих пор нет единого мнения относительно его видового состава и границ видов. Первые попытки классификации рода Pisum были предприняты еще в XVI—XVII веках, систематики того времени руководствовались только морфологическими признаками растений. Было показано, что представители как рода Pisum, так и родственных видов трибы Fabeae очень близки по морфологическим признакам, часто представители различных таксономических единиц различаются лишь незначительными особенностями.
Еще до исследований Линнея было проведено множество попыток систематизировать «горохи». Уже в середине XVI века в одном из первых печатных ботанических трудов L. Fuchsius (1543г.) различают два вида горохов: обычный мелкий полевой горох с белыми цветами и более редкий крупный огородный горох, вьющийся, с цветами телесного и белого цвета. H. Bock (1565 г.) описывает в пределах мелкосемянного полевого гороха «форму с телесно-красными цветами и семенами, становящимися бурокрасными после варки». «В пределах группы крупносемянного огородного гороха им (Бок) отмечается форма с сизо-зелеными семенами как наиболее ценная для варки.» J. Gerard (1597) впервые упоминает сахарный и штамбовый горох, J. Parkinson (1625 г.) впервые дает название сахарного гороха (P. saccharatum), а J.P.Tournefort (1700 г.) впервые выделил горох в самостоятельный род Pisum (цит. по Говоров, 1937).
Карл Линней в своей ботанической классификации выделял четыре вида гороха: помимо P. sativum и P. arvense род Pisum также включал виды P. ochrus и P. maritimum, которые позднее были отнесены к роду Lathyrus. (Linnaeus, 1753 цит.по http://linnean-online.org/view/genus/Pisum.html)
Выделение растительной ДНК и РНК
Для выделения ДНК использовались 7-10 дневные проростки индивидуальных растений анализируемых образцов трибы Fabeae.
Выделение тотальной растительной ДНК проводилось с использованием методики, предложенной Edwards с соавторами (1991) с дополнительной депротеинизацией смесью фенол/хлороформ и методики Doyle J.J (1987) для получения ДНК из растительных тканей, содержащих большое количество фенолов (V. sativa, V. faba). Обе методики позволили проводить быстрое выделение тотальной ДНК в достаточном количестве (более 5 мкг) с чистотой OD=1.6-1.8.
Выделение тотальной РНК из органов 3 индивидуальных растений P. sativum проводили с помощью набора реактивов SV Total RNA Isolation System (Promega, США). Возраст растения составил 50 дней. Выделение РНК из цветков проводилось в период его полного раскрытия, возраст плода на момент выделения РНК составлял 10-12 дней. Для минимизации индивидуальной вариабельности выделение РНК проводили трех растений каждого образца.
Концентрацию выделенной ДНК и РНК определяли на спектрофотометре Qubit 3.0 с помощью соответствующих реактивов (Invitrogen, США).
AFLP-анализ проводили по стандартной методике, предложенной Vos P. с сотрудниками (1995). Геномную ДНК каждого образца гидролизовали рестриктазами EcoRI/MseI, EcoRI/PstI 3 часа при температуре 370С, лигировали с соответствующими адаптерами и с использованием T4лигазы, затем проводили два последовательных раунда селективной амплификации.
Для первого раунда амплификации были использованы стандартные адаптерные праймеры Eco+1, Tru+1 и PstI+1 с одним/двумя селективными нуклеотидами на 3 -конце каждого праймера. Для второго раунда амплификации были использованы сочетания EcoRI/TruI и EcoRI/PstI с тремя и четырьмя селективными нуклеотидами 3 -конца каждого праймера (табл.2.2). Таблица RGA-маркирование проводили по стандартной методике, предложенной van der Linden с соавторами (2004). Рестрикцию геномной ДНК (300 нг) проводили с помощью эндонуклеазы MseI, далее полученные продукты лигировали T4 лигазой с адаптерными праймерами. Первый раунд амплификации проводили с использованием адаптерных (Mse) праймеров. Для второго раунда амплификации использовали специально разработанные IRD 700/800 NBS-праймеры (NBS2 5 GTWGTYTTICCYRAICCISSCAT-3 и NBS5 5-YYTKRTHGTMITKGATGATGTITGG-3).
Полученные амплификаты разделяли в 6%-акриламидном геле с использованием гель-анализатора LiCOR 4300 (LI-COR Biosciences GmbH, США) по стандартной методике (LiCOR operator manual).
Статистическая обработка AFLP- и RGA-спектров, анализ полиморфизма. Подсчет фрагментов геля был произведен вручную. В статистический анализ были включены только четкие, воспроизводимые фрагменты. Молекулярные панели AFLP фрагментов по каждой комбинации праймер/фермент документировали в программе Exel в виде бинарных матриц присутствия/отсутствия фрагмента 1/0. На основании построенных спектров и матриц были идентифицированы образец специфичные ДНК маркеры, были рассчитаны коэффициенты попарного генетического сходства/различий с использованием коэффициентов Jaccard и Nei -Li (пакет программ STATISTICA-10.0 и PAUP 4.0). Построение дендрограммы и определение групп генетически сходных образцов производилось с использованием программ PAUP 4.0 и TREECON-1.3b. (Swofford, 2002; Van de Peer et al., 1994). Для определения корреляции между матрицами использовали тест Мантела (пакет программ PAST).
Амплификации некодирующих участков ДНК бобовых проводилась по стандартной методике. Были использованы стандартные праймерные пары, позволяющие амплификацировать участки ядерной, хлоропластной и митохондриальной ДНК у представителей трибы Fabeae (White et al., 1990; Taberlet et al., 1991; Demesure et al., 1995; Shaw et al., 2005, 2007). Таблица 2.3. Условия проводимых реакций Участок/ локализация Последовательность прямого и обратного праймеров ITS1-5.8S-ITS2 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 TCGTAACAAGGTTCCCGTAGGTG 650 59 trnH-psbA хпДНК trnH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C 300 57 rpoBrnC хпДНК rpoB CAC CCR GAT TYG AAC TGG GG trnC CKA CAA AAY CCY TCR AAT TG 1000 59 trnYrnT хпДНК trnT CTA CCA CTG AGT TAA AAG GG trnY CCG AGC TGG ATT TGA ACC A 1000 59 trnL хпДНК TabC CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG TabD GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC 400 59 интрон генаNad1мтДНК NAD1B GCA TTA CGA TCT GCA GCT CA NAD 1C GGA GCT CGA TTA GTT TCT GC 1500 60 Амплификацию нуклеотидных последовательностей проводили с использованием набора реактивов ЗАО «Диалат ЛТД» (РФ). Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 10x буфер,1,5мкМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP, по 0,5 мкМ соответствующих праймеров, 0,2 единиц Taq полимеразы и 100 нг. геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере BioRad Т100 (Bio-Rad, США) в режиме: денатурация - 30 с. при 95С; отжиг праймера - 30 сек. при температуре соответствующей tотж праймеров; элонгация ДНК - 1 мин на 1000 п.н. при 72С; число циклов – 35; заключительная элонгация -5 мин при 72С.
Для идентификации и секвенирования полноразмерной последовательности гена сахарозосинтазы (Sus1) на основе известных последовательностей мРНК бобовых было разработано восемь праймеров: шесть праймеров локализовались непосредственно внутри гена и два - до старт-кодона и после стоп-кодона, и позволяют амплифицировать как полноразмерный ген, так и его перекрывающиеся участки длиной до 1000 п.н. (рис. 2.1)
С помощью разработанных праймеров была проведена амплификация и клонирование полноразмерных последовательностей генов-ортологов SUS1 у видов трибы Fabeae. Для амплификации полноразмерной последовательности гена сахарозосинтазы был использован набор реактивов производства LongAmp Taq MasterMix (New England BioLabs, USA). Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 12.5 мкл буфера LongAmp Taq MasterMix, по 1 мкМ соответствующего праймера, 9.3 мкл mQ и 100 нг геномной ДНК. Амплификацию полной последовательности гена SUS1 проводили в термоциклере “BioRad” T100 (США) с предварительной денатурацией - 5 минут (95С) в режиме: денатурация - 30 с. при 95С; отжиг праймера - 30 с. при температуре соответствующей tотж праймеров; синтез ДНК - 5 минут при 65С с числом циклов - 35. Заключительная элонгация ПЦР-фрагментов проводилась 10 минут при 65С.
Оценка полиморфизма семейства генов резистентности рода P. sativum методом мультилокусного RGA анализа
В целом методом AFLP маркирования был выявлен довольно высокий уровень геномного разнообразия образцов P. sativum, представленного в коллекции ВИР. В свою очередь, по данным комбинированного RAPD, SSR и ISSR анализов другими авторами была выявлена еще более широкая, чем в нашем исследовании, геномная вариабельность образцов гороха. Так, уровни генетических различий 65 образцов P. sativum, преимущественно западно-европейской селекции с привлечением дикого генофонда, составили 0,01-0,66. (Tar an et al., 2005). Также значительные генетические различия (0,21-0,74) были детектированы с у 15 индийских образцов P. sativum методом RAPD (Yadav et al., 2007). Еще более вариабельным (0,11-0,73) оказался материал из стержневой коллекции университета Banaras Hindu (Индия), изученный методом SSR-маркирования (Kumari et al., 2013).
Полученные по результатам проведенного AFLP-анализа данные были использованы для построения дендрограммы (рис. 3.4). В целом полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ярко выраженной кластеризации на основе эколого-географического происхождения анализируемых образцов.
На дендрограмме базальную ветвь формирует образец P. fulvum, все образцы P. sativum со 100% бутстреп-поддержкой формируют единый полиморфный кластер, внутри которого с низкими значениями бутстреп-поддержки (ИБ 50%) можно выделить три основные подгруппы образцов гороха. Наиболее дистальную и наиболее полиморфную подгруппу формируют образцы преимущественно восточноазиатского происхождения (Монголия, Маньчжурия, Красноярский край, Афганистан, Бутан, Япония, Индия, Казахстан, Египет). Самостоятельную ветвь образует образец #42 из Монголии. Небольшую обособленную подгруппу составляют образцы из Памира, Сирии и Ирана. В этой части дендрограммы наблюдается некоторое сосредоточение образцов из регионов первичного центра происхождения, однако основная их часть равномерно распределилась по дендрограмме.
Дополнительно к кластерному был проведен многомерный анализ главных компонент (PCA). На РСА-графике также не выявлялись отдельные группы, а анализируемые образцы формировали протяженный континуум с двумя полюсами, в одном из которых локализовались преимущественно образцы азиатского, в другом -преимущественно европейского происхождения. Большая часть образцов гороха занимала промежуточное положение между этими дистанцированными полюсами (рис. 3.5).
Анализ геномной структуры P. sativum с использованием программы STRUCTURE v2.3.4 подтвердил существование континуума форм, большинство из которых нельзя было четко отнести к какой-либо группе. Были проанализированы различные варианты количества подгрупп (к=от 2 до 15) и наилучшие результаты (LnLike=-6656.8) были получены для числа подгрупп к=5 (рис. 3.6). Однако, также никакого четкого разделения исследованных образцов гороха по эколого-географическому принципу или морфо-биологическим особенностям не наблюдалось. Образцы гороха формировали единый, но крайне полиморфный, геномный континуум. Образцы спорного таксономического статуса (transcaucasicum, abyssinicum, asiaticum) не показывали какого-либо существенного сходства и не образовывали отдельные группы, что подтверждает включение этих образцов в P. sativum. (см главу 3.1.1.1). 985555
Анализ геномной структуры дикорастущих образцов P. sativum для k=5 по данным AFLP анализа (программа STRUCTURE 2.3.4) Кластерный анализ, PCA и анализ геномной структуры не выявили кластеризации образцов P. sativum по географическому происхождению или по таксономической принадлежности. На дендрограмме с низким уровнем достоверности наблюдалась кластеризация некоторых групп образцов из регионов первичного центра происхождения гороха, что может говорить о многочисленных фактах распространения биоразнообразия из первичных центров происхождения гороха. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей. По результатам анализа образцов гороха из коллекции JIC (Великобритания) и еще семи мировых коллекций методом SSAP также отсутствовала четкая геномная структура P. sativum, а образцы различного географического происхождения образовывали несколько смешанных подгрупп (Jing et al., 2010, 2012).
Отсутствие кластеризации по географической принадлежности образцов может быть обусловлено несколькими причинами. Горох, как пищевая и кормовая культура, с древнейших времен является предметом торговли, что способствует перемешиванию генотипов. Также, эта культура характеризуется широким ареалом возделывания, что может быть связано с высокой геномной пластичностью. Геномная лабильность гороха может быть связана и с насыщенностью генома мобильными элементами, разнообразие которых, по всей видимости, и определило детектируемый генетический полиморфизм этого вида.
Таким образом, впервые был проведен молекулярный AFLP анализ и охарактеризовано генетическое разнообразие 83 образцов культурного гороха P. sativum из коллекции ВИР, оценен геномный полиморфизм отобранной субколлекции, определены наиболее сходные и различающиеся генотипы. Кластерный анализ и анализ геномной структуры P. sativum не выявили групп образцов c высокой бутстреп поддержкой. На PCA графике все исследованные образцы P. sativum формировали непрерывный континуум с двумя полюсами: в одном из которых преобладали образцы из Азии, в другом – образцы из Европы. Образцы из регионов первичного центра происхождения располагались внутри единой полиморфной группы P. sativum.
Для оценки генетической вариабельности, представленной у используемых в селекционных программах отечественных и зарубежных сортов и возможной генетической эрозии, была использована коллекция сортов гороха. Всего было отобрано 66 сортов и линий гороха, охарактеризованных по ряду морфо-биологических и хозяйственно ценных признаков (скороспелость, назначение, длина стебля, форма и размер боба, вкусовые качества и др.) (данные представлены д.б.н. Борисовым А.Ю., ВНИИСХМ).
В результате проведенного анализа было проанализировано 4 AFLP комбинации праймер/фермент (E35/T49, E35/T61, E35/T59T, E35/T55C) и получено 347 AFLP-фрагментов, из которых 224 были полиморфными (64,6%). Как и ожидалось, уровни межсортового полиморфизма были ниже, чем у дикорастущих образцов. В результате проведенного маркирования каждый из 66 анализируемых сортов и линий гороха был охарактеризован специфичным спектром AFLP-фрагментов (рис. 3.7).
На основе полученных AFLP-спектров были определены значения генетических расстояний (GD, Nei-Li) анализируемых образцов. Vежсортовой полиморфизм исследуемых образцов гороха был достаточно высок и варьировал от 0,025 до 0,261 (GDср= 0,115), в то время как для дикорастущих образцов эта величина составила 0,070-0,356 (GDср= 0,187) (см. главу 3.1.1.2).
Анализ вариабельности хлоропластного генома у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae
На дендрограмме, построенной на основе последовательностей пластидного генома образцы рода Pisum формируют единый кластер (ИБ=100%), внутри которого отдельные субкластеры образуют виды P. sativum (ИБ=95%) и P. fulvum (ИБ=97%). Образцы Vav. formosa формируют отдельную сестринскую кладу (ИБ=92%). Образцы видов Lathyrus формируют полиморфный кластер, при этом образцы L. ochrus и L. clymenum формируют обособленную группу. Образцы видов Vicia не образуют единого кластера, при этом образец Lens culinaris расположен внутри клады видов Vicia.
На дендрограмме, построенной на основе четырех участков пластидного генома и ядерных ITS-спейсеров образцы рода Pisum также формируют единый кластер (ИБ=100%) с выделением видовых субкластеров P. sativum (ИБ=99%) и P. fulvum (ИБ=100%) (рис. 3.31). Внутри субкластера P. sativum выделяется несколько групп образцов с высокой поддержкой.
Образцы видов Lathyrus на дендрограмме образуют два субкластера с высокой поддержкой, а образец L. nissolia формирует отдельную ветвь. Все образцы видов Vicia образуют единый кластер, в который также попал образец Lens culinaris, однако он имеет низкий уровень поддержки.
В целом положение образцов на суммарных дендрограмме было аналогично их положению на дендрограммах, построенных по отдельным участкам, за исключением участка rpoBrnC. Образцы видов Pisum и Vavilovia формируют обособленные кластеры, что подтверждает правомерность выделения в ранг самостоятельного рода Vavilovia. Представители родов Lathyrus и Vicia не формируют отдельные кластеры, при этом интересно отметить, что образец Lens culinaris входит в кладу Vicia, что подтверждает необходимость пересмотра классификации трибы.
Таким образом, проведенный анализ как отдельных учасков хлоропластного и ядерного геномов рода Pisum и родственных родов трибы Fabeae, так и комбинированный анализ последовательностей хлоропластного генома, и суммарный анализ участков хлоропластного и ядерного геномов подтвердил, что род Pisum состоит из двух видов – P.sativum и P. fulvum. Не подтверждено выделение образцов спорного таксономического статуса transcaucasicum, asiaticum, abyssinicum, elatius в ранг самостоятельных видов, данные образцы входят в состав вида P. sativum, при этом проведенный анализ также не показал возможность выделения данных образцов и в ранг подвидов в составе P. sativum. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae, построенная на основе четырех последовательностей пластидного генома и последовательностей ядерных ITS-спейсеров (ML, модель GTR+G).
Анализ широкой выборки образцов монотипического рода Vavilovia по всем проанализированным участкам показал их четкое отличие от образцов рода Pisum, что подтверждает правомерность выделения рода Vavilovia. Расположение образцов родов Lathyrus, Vicia и Lens на большинстве построенных дендрограмм было схоже. Образцы L. ochrus и L. clymenum формируют единую группу, которая с достаточно высокими значениями достоверности выделяется из общей группы Lathyrus. Образец Lens culinaris на всех дендрограммах формирует единую кладу с образцами рода Vicia. Полученные данные свидетельствуют от необходимости пересмотра таксономии трибы Fabeae, более детального исследования как всей трибы в комплексе, так и отдельно родов Lathyrus, Vicia и Lens.
Участки митохондриального генома растений, в отличие от хлоропластного, не часто используются в филогенетических исследованиях и оценке биоразнообразия видов и родов. Однако была показана возможность успешного использования в различных таксономических и филогенетических исследованиях растений последовательностей как интронов, так и экзонов митохондриальных генов cox, atpA, nad (Hiesel et al., 1994; Qiu, Cho, 1998; Duff, Nickrent, 1999; Soltis, Soltis. 2000). Ранее митохондриальный геном бобовых практически не использовался в анализе, за исключением единичных образцов, как например Vicia faba, Medicago truncatula, Glycine max и др., для которых была определена полная последовательность мтДНК (Negruk, 2013; Chang et al., 2013; Bi et al, 2016). Однако в этих случаях были взяты в анализ отдельные единичные образцы (обычно P. sativum) и полученные последовательности не использовались для характеристики межвидовой и межродовой вариабельности генома бобовых.
Для анализа мтДНК был выбран b/c интрон гена nad1, относящийся к II группе самосплайсирующихся интронов, который считается полиморфным и наиболее часто используется для проведения филогенетических исследований растений (Demesure, Sodzi, Petit, 1995; Bakker et al., 2000; Freudenstein, Chase, 2001).
Для определения полиморфизма последовательности b/c интрона гена nad1 было отобрано 69 образцов трибы Fabeae, включая 32 образца рода Pisum, 12 образцов рода Vavilovia, 13 образцов рода Lathyrus, 11 образцов рода Vicia и один образец рода Lens (табл.3.2). Последовательности были амплифицированы и секвенированы с использованием стандартных праймеров (Demesure et al., 1995). Длина последовательности b/c интрона гена nad1 у образцов P. sativum составила 1503 п.н., за исключением образца P. sativum ssp. elatius (2524), у которого интрон имел размер 1516 п.н., как и у всех анализируемых образцов P. fulvum. Последовательность данного интрона у всех образцов V. formosa имела длину 1515 п.н. (табл. 3.2). У образцов рода Lathyrus размер интрона варьировал от 1499 (L. gmelinii) до 1517 п.н. (L. aphaca), а у видов Vicia – от 1493 (V. hirsuta) до 1519 п.н. (V. unijuga). Протяженность выровненных и используемых для анализа последовательностей b/c интрона гена nad1 составила 1583 п.н. Всего в последовательностях интрона было идентифицировано 66 вариабельных сайтов (4.17%), из них парсимонии-информативными были 14 сайтов.
Также был выявлен ряд инделей. Так было выявлено 20 инсерций, восемь из которых являются тандемными повторами. При этом, как правило, все индели были короткими и не превышали 6 п.н. Некоторые индели были специфичны для отдельных видов, другие присутствовали в последовательностях групп видов. Для вида P. fulvum выявлены три видоспецифичные индели. Интересно отметить, что последовательности интрона двух образцов P. sativum (elatius 2524 и humile) содержали такие же индели (инсерции GGTC, GGGA, AACCT, CCGCC и делеция TGACG), как и образцы P. fulvum, в то время как анализ других участков (хпДНК и ITS-спейсеры) показал, что последовательности этих образцов идентичны остальным образцам P. sativum и отличались от представителей P. fulvum. При этом следует отметить, что второй образец P. sativum ssp.elatius 3115 не имел общих с P. fulvum инделей (рис. 3.32).
В последовательности b/c интрона гена nad1 у представителей Lathyrus и Vicia было выявлено шесть инделей относительно Pisum. Наибольшее число
Фрагмент сиквенса интрона b/c гена nad1 рода Pisum и близких родов бобовых. видоспецифичных замен было детектировано у вида L. gmelinii (5) и L. aphaca (4). Данные проведенного анализа показали, что уровень как межвидового полиморфизма рода Pisum, так и внутривидовой полиморфизм образцов P. fulvum и P. sativum не превышали 0,001. Значения генетических расстояний у представителей трибы Fabeae относительно рода Pisum варьировали в пределах 0,000-0,022.
На основе полученных данных были рассчитаны генетические расстояния и методом ML построена дендрограмма (рис. 3.33). На дендрограмме все анализируемые образцы сформировали единую смешанную группу. Таким образом, данный интрон не может быть использован для исследования филогенетических отношений.