Содержание к диссертации
Введение
1. Ретротранспозоны дрозофилы и механизмы регуляции их активности (обзор литературы) 10
1.1 Общие представления о мобильных генетических элементах (МГЭ) 10
1.2 Класс ДНК-транспозонов 13
1.3 Класс ретроэлементов 13
1.4 Ретротранспозоны группы gypsy D. melanogaster 17
1.5 Общие представления об РНК-интерфренции 19
1.6 Контроль активности МГЭ в яичниках дрозофилы, обеспечиваемый короткими piРНК 21
1.7 Piwi – ключевой полифункциональный компонент piРНК пути 30
1.8 Взаимосвязь процессов РНК-интерференции и регуляции состояния хроматина в осуществлении контроля МГЭ 34
1.9 Геномные кластеры piРНК 36
1.10 Локус flamenco – основной источник piРНК в соматических клетках яичников 40
2. Материалы и методы 44
2.1 Линии D. melanogaster и условия их культивирования 44
2.2 Сбор тканей для последующего выделения РНК 45
2.3 Выделение геномной ДНК 45
2.4 Выделение тотальной РНК 46
2.5 Синтез кДНК 46
2.6 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 46
2.7 Полимеразная цепная реакция 47
2.8 Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле 48
2.9 Вычитающая гибридизация (ВГ) 49
2.10 Секвенирование ДНК 51
2.11 Биоинформатический анализ 51
3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Исследование экспрессии на уровне транскрипции МГЭ группы gypsy в линиях MS и SS 53
3.2. Структурно-функциональный анализ МГЭ Tirant в линиях, мутантных по локусу flamenco 57
3.2.1. Исследование транскрипции МГЭ Tirant 57
3.2.2. Анализ 5 -нетранслируемой области Tirant 59
3.2.3. Исследование транспозиционной активности Tirant 62
3.2.4. Скрещивание изогенных линий 7Kw1 и 7K(1), анализ экспрессии Tirant у потомства 63
3.3. Гибридологический и молекулярный анализ взаимодействия flamenco и piwi
3.3.1. Скрещивание линий MS и SS с линией piwi3 65
3.3.2. Индивидуальные скрещивания линии SS с piwi3 68
3.3.3. Анализ экспрессии ретротранспозона gypsy в яичниках гибридов первого поколения 70
3.3.4. Экспрессия gypsy в семенниках гибридов первого поколения 74
3.3.5. Анализ экспрессии ретротранспозона Idefix в семенниках гибридов первого поколения 85
Заключение 87
Благодарности 94
Список литературы 95
- Ретротранспозоны группы gypsy D. melanogaster
- Взаимосвязь процессов РНК-интерференции и регуляции состояния хроматина в осуществлении контроля МГЭ
- Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
- Гибридологический и молекулярный анализ взаимодействия flamenco и piwi
Ретротранспозоны группы gypsy D. melanogaster
Мобильные генетические элементы (МГЭ) – это последовательности ДНК, способные менять сво место положения в пределах генома. Это так называемая «подвижная ДНК» [Хесин, 1984]. У большинства изученных организмов данные последовательности составляют значительную часть генома. Множественность в геноме – характерное свойство МГЭ.
Способность МГЭ к транспозиции обеспечивается структурой данных дискретных участков генома. Чаще всего весь необходимый ферментативный аппарат, обеспечивающий транспозицию, закодирован в структуре МГЭ. Выделяют 2 больших класса МГЭ по механизму их перемещения. Оно может осуществляться следующими способами:
1. Путем вырезания последовательности мобильного элемента из одного участка генома с последующим встраиванием в другой сайт. Такой механизм характерен для ДНК-транспозонов. Транспозаза - ключевой фермент, осуществляющий процессы перемещения по механизму вырезания/встраивания.
2. Через РНК-интермедиат. Сначала встроенная в геном копия МГЭ транскрибируется, затем с помощью обратной транскриптазы с образованной РНК считывается кДНК. Завершающим этапом перемещения является интеграция в новый участок генома полученной кДНК-копии элемента. В связи с наличием в процессе перемещения стадии обратной транскрипции такие МГЭ называют рэтроэлементами. При таком способе перемещения, число копий ретроэлементов в геноме может возрастать, поскольку исходная копия не вырезается, а остается в том же самом сайте.
Увеличение числа копий может наблюдаться и у ДНК-транспозонов, однако в этом случае оно происходит за счет таких фундаментальных процессов как репликация и рекомбинация. Еще одно важное свойство, характеризующее мобильные элементы, - это автономность, то есть способность конкретной копии МГЭ перемещаться самостоятельно, независимо от других мобильных элементов. Известно, что отдельные копии как ДНК-транспозонов, так и ретроэлементов, не способны перемещаться самостоятельно, в связи с тем, что имеют в своей структуре мутации, препятствующие транспозиции. Эти МГЭ являются неавтономными. Неавтономные элементы способны перемещаться с помощью автономных копий, используя их функциональный ферментный аппарат. Alu-повторы в геноме человека, инсерции которых в тот или иной ген часто имеют определенные последствия для его функции, можно отнести к неавтономным элементам [Cordaux, Batzer, 2009].
МГЭ – это паразитические последовательности, и, перемещаясь по геному, они существенно влияют на генетический материал хозяина. Существует точка зрения, что сложная регуляция экспрессии генов эукариотических организмов и даже их интрон-экзонная структура возникли как способ защиты от активности МГЭ [Madhani, 2013]. Предполагается, что благодаря этим усложнениям, системы защиты могли отличать генетический материал МГЭ от собственной ДНК/РНК.
Часто транспозиция в область того или иного гена изменяет его структуру и сопровождается конкретным фенотипическим проявлением. Стоит отметить, что именно благодаря фенотипическим последствиям транспозиции Барбарой Мак Клинток было впервые высказано предположение о существовании МГЭ [McClintock, 1953]. Известны примеры открытия новых, ранее неизвестных элементов, в результате анализа причин того или иного фенотипа и в молекулярную эру генетики. Так, например, у дрозофилы молекулярный анализ ревертантов по гену white выявил, что причина реверсии фенотипа – инсерция примерно в 7 тыс. п.н. в районе данного гена. Этой инсерцией оказался элемент ZAM [Leblanc et al., 1997]. В настоящее время современные методы анализа генома позволяют относительно просто идентифицировать новые МГЭ [Kaminker et al., 2002]. В литературе имеется большое количество данных о влиянии МГЭ на функцию конкретных генов. Часто в составе мобильных элементов имеются различные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, инсуляторы, сигналы полиаденилирования, сигналы терминации, сайты сплайсинга и др. Все эти последовательности могут оказать значительное влияние на функцию гена, вблизи или внутрь которого произошла инсерция МГЭ. Предпринимаются попытки систематизировать данные о влиянии МГЭ на хозяйские гены путем создания удобных для пользования онлайн-ресурсов [Rebollo et al., 2012].
Отметим, что часто транспозиция несет отрицательные последствия, особенно когда этот процесс неконтролируемый. В процессе эволюции выработались механизмы, ограничивающие активность МГЭ. Если они будут нарушены, то такие особи будут демонстрировать высокий уровень мутационной изменчивости, обусловленной перемещением МГЭ. Такие линии имеются у дрозофилы [Kim et al., 1994a].
МГЭ играют важную роль в формировании генетической изменчивости, и, следовательно, их можно рассматривать как один из факторов, обеспечивающих эволюционный процесс. Известны примеры молекулярной доместикации – процесса, при котором определенные последовательности МГЭ обретают новые функции в геноме хозяина. Доместикации могут подвергаться отдельные регуляторные элементы или даже целые ОРС. В нашей лаборатории у дрозофилы идентифицирован ген Grp, его продукт имеет гомологию с первой ОРС ретротранспозона gypsy. Предполагается, что данный ген участвует в противовирусном иммунитете [Nefedova et al., 2014]. Ретроэлементы HET-A и TART участвуют в поддержании теломер у дрозофилы [Pardue et al., 2003]. Эта уникальная функция МГЭ известна только у дрозофилы. Есть примеры участия МГЭ в репарационных процессах ДНК у дрожжей [Moore, Haber, 1996]. Учитывая сказанное выше, можно заключить, что МГЭ неотъемлемая составляющая генома. Их не всегда можно рассматривать только как паразитические последовательности.
Взаимосвязь процессов РНК-интерференции и регуляции состояния хроматина в осуществлении контроля МГЭ
Вопрос происхождения кластеров piРНК на данный момент является крайне актуальным. Известно, что новые МГЭ могут быть заимствованы у других популяций и даже у близких видов через горизонтальный перенос [Daniels et al., 1990]. Учитывая это, встает вопрос об адаптации механизмов для контроля вновь приобретенных элементов. Один из способов – направленная транспозиция МГЭ в piРНК кластер, в результате чего данная копия элемента в составе кластера будет служить матрицей для синтеза антисмысловых РНК, соотвествующего элемента. Согласно этой гипотезе, МГЭ в предынтеграционном комплексе узнается белком Hp1d, что, в конечном счете, приводит к сайт-направленной инсерции данного МГЭ [Vermaak et al., 2009].
Хорошим примером, иллюстрирующим пластичность и адаптационные возможности piРНК системы РНКи, является искусственное формирование piРНК кластера de novo [Olovnikov et al., 2013]. Инсерции трансгенов, содержащих фрагмент ДНК I-элемента, вызывали подавление активности данного элемента. Доказано, что данная устойчивость обусловлена продукцией piРНК, имеющих происхождение от встроенного трансгена. Продуцируемые piРНК были комплементарны не только последовательности I-элемента, но и другим фрагментам вектора и даже соседним областям, фланкирующим трансген [Olovnikov et al., 2013]. Одна из таких инсерций произошла вблизи теломерной области, которая может являться кластером piРНК. Это хорошо согласуется с известными данными, когда трансген, встраиваясь в piРНК кластер, сам становиться его частью, и продуцируются новые piРНК, соответствующие трансгену [Muerdter et al., 2012]. Однако в работе Olovnikov et al., 2013, все инсерции трансгена (за исключением теломерной инсерции) были зарегистрованы в эухроматине на значительном удалении от кластеров piРНК. В результате экспериментально показана возможность формирование кластера piРНК из других областей генома, которые ранее не были задействованы в данной роли. Есть примеры, демонстрирующие такие свойства piРНК кластеров как парамутагенность. Показано, что один из трансгенов, который ранее обрел способность продуцировать piРНК, вызывал продукцию piРНК в других аналогичных трансгенах, которые ранее не являлись источниками данных молекул [de Vanssay et al., 2013]. Эти факты, безусловно, помогут установить каким образом те или иные области генома обрели способность продуцировать piРНК. Механизмы этих событий пока еще не вполне ясны.
Экспрессия piРНК кластеров зависит от многих факторов. Так, для мутантов по гену kumo на фоне нарушения организации зоны nuage было обнаружено снижение продукции piРНК кластера 42AB, при этом на кластер flamenco мутация гена kumo влияния не оказывала [Anand, Kai, 2012]. Предполагается, что белок Kumo регулирует транскрипцию кластера 42AB, возможно, через регуляцию состояния хроматина. У мутантов kumo возрастает степень ассоциации с кластером 42AB гетерохроматинового белка HP1a [Anand, Kai, 2012]. Таким образом, один и тот же фактор принимает участие на совершенно разных этапах биогенеза piРНК, сначала способствует транскрипции РНК-предшественника, а затем действует на следующем этапе – его процессинге до коротких РНК.
Еще одним важным условием для транскрипции кластеров является формирование определенных гетерохроматиновых структур в данной области. Предполагается, что формирование специальных гетерхроматиновых структур позволяют РНК полимеразе во время транскрипции игнорировать различного рода сигналы, такие как сигналы терминации, и в результате синтезировать длинный РНК-предшественник [Muerdter et al., 2012]. Интересно, что в вышеописанных исследованиях формирования кластера de novo, область встроенного трансгена – источника piРНК, также была обогащена Н3K9me – маркером гетерохроматина [Olovnikov et al., 2013]. По всей видимости, наличие гетерохроматина является общим свойством, характерным для всех кластеров. Так, мутация в гене, кодирующем белок dSETDB1 (одна из метилаз гистона H3, необходимая для формирования гетерхроматина в районе кластеров) вызывала нарушение продукции piРНК и РНК-предшественника из совершенно разных кластеров - 42AB и flamenco [Rangan et al., 2011]. А мутация в гетерохроматиновом белке HP1d (rhino) приводила к нарушению продукции РНК-предшественника (и впоследствии piРНК) только двуцепочечных кластеров (42AB) в герминальных клетках яичников [Klattenhoff et al., 2009]. На одноцепочечные кластеры (flamenco) это явление не распространяется. HP1d физически ассоциируется с ДНК двуцепочечных кластеров, и, по всей видимости, способствует их нормальному функционированию [Klattenhoff et al., 2009]. Соответственно, мутация в гене rhino приводит к дерепрессии определенного спектра МГЭ. Так же для функционирования двунитевых кластеров необходим белок Cutoff. Считается, что реализация его функции тесно связана с Rhino [Pane et al., 2011]. Большинство кластеров функционируют в герминальных клетках и характеризуются двунаправленной транскрипцией. Таковым является кластер 42AB [Malone et al., 2009]. Единственный крупный кластер, функционирующий в соматических клетках яичников - локус flamenco (20А1-3, Х-хромосома). Его схема представлена на рис. 6. Он характеризуется однонаправленностью транскрипции, то есть это одноцепочечный кластер [Robert et al., 2001; Brennecke et al., 2007]. piРНК, продуцируемые этим кластером, связываются с белком Piwi, но не с другими белками одноименного подсемейства [Brennecke et al., 2007].
Впервые локус flamenco был описан как наследственный фактор, контролирующий перемещения gypsy [Plisson et al., 1994; PrudHomme et al., 1995]. Значительно позже стало ясно, что flamenco есть не что иное как скопление дефектных МГЭ, локализованных на антисмысловой цепи, причем большинство из них принадлежит к ретротранспозонам группы gypsy [Malone et al., 2009]. Помимо flamenco, генетическими методами был описан локус COM (Center Organisant la Mobilization), локализованный в том же районе Х-хромосомы и контролирующий два родственных gypsy ретротранспозона - ZAM и Idefix [Desset et al., 2003]. В настоящее время установлено, что flamenco и COM – это один и тот же локус [Goriaux et al., 2014b].
Также на роль flamenco претендовал другой ген - DIP1. Близость локализации генов flamenco и DIP1 позволила предположить, что DIP1 или сам является геном flamenco, поскольку это единственный белок-кодирующий ген в этом районе районе, либо каким-то иным способом причастен к мутантному фенотипу [Robert et al., 2001; Nefedova et al., 2009]. Эти предположения пока не нашли подтверждения.
Продемонстрирован материнский эффект гена flamenco. Данное свойство обнаружилось с момента описания этого гена. Было показано, что активные транспозиции gypsy происходят у потомков, полученных от гомозиготных мутантных самок, даже в том случае, когда они наследуют нормальный аллель flamenco от отца [Plisson et al., 1994].
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Мы провели функциональный тест на аллелизм, или тест на комплементацию. Его суть заключается в скрещивании линии, мутантной по гену piwi, с линиями SS и MS с последующим анализом экспрессии gypsy у потомства. Использовали линию piwi3, гетерозиготную по рецессивной мутации в гене piwi, полученной путем инсерционного мутагенеза [Lin, Spradling, 1997]. Данный аллель гена piwi полностью нефункционален, поскольку инсерция Р-элемента произошла в первый экзон.
Схема скрещиваний представлена на рис. 17. Балансерная хромосома CyO линии piwi3 маркирована доминантной мутацией Сy (загнутые крылья). Данная мутация летальна в гомозиготном состоянии. В результате скрещивания появляются потомки двух фенотипических классов: с загнутыми (Су) и нормальными (N) крыльями. Исходя из схемы скрещивания, получается, что только особи с нормальными крыльями (N) наследуют от линии piwi3 ту хромосому, в которой аллель данного гена присутствует в нефункциональном мутантном состоянии. Другую хромосому особи N наследуют от линии MS или SS; при этом аллельное состояние гена piwi в этой хромосоме нам неизвестно.
Далее у потомства F1 анализировали уровень транскриптов ретротранспозона gypsy в яичниках и семенниках, поскольку именно в этих тканях функционируют Piwi-зависимые механизмы подавления МГЭ. Результаты анализа будут представлены ниже.
Следует отметить, что определенные мутации в гене piwi в гомозиготе могут приводить к резкому снижению жизнеспособности и стерильности таких особей [Cox et al., 1998]. Белок Piwi необходим для поддержания герминальных стволовых клеток [Cox et al., 2000]. Гомозиготные мухи имеют недоразвитые яичники сильно уменьшенного размера, и, как следствие, такие особи стерильны. Значит, если в линиях MS и SS имеется летальный аллель гена piwi, то при массовом скрещивании MS или SS с линией piwi3 мы получим потомство N, часть которого унаследует оба нефункциональных аллеля piwi (один от MS или SS, другой от линии piwi3). Жизнеспособность таких гибридов может оказаться низкой, вследствие чего они будут исключены из анализа. В такой ситуации результаты теста могут быть интерпретированы неправильно.
Чтобы убедиться, что в наших линиях отсутствует летальная мутация в гене piwi, нами было поставлено 100 индивидуальных скрещиваний самок линии SS с самцами линии piwi3 (рис. 18). Возможны три следующих генотипа линии SS: piwi+/piwi+; piwi+/piwi; piwi/piwi. Очевидно, что из всех трех возможных генотипов плодовитыми будут только гетерозиготные (piwi+/piwi) особи и гомозиготные мухи дикого типа (piwi+/piwi+). Если в индивидуальном скрещивании от линии SS будет участвовать гомозиготная особь дикого типа или гетерозиготная по мутантному аллелю, то будет наблюдаться расщепление фенотипических классов Cy к N, равное 1:1, при условии, что мутация в piwi не летальна; в случае же е летальности, соотношение изменится в пользу Cy, то есть – 2:1 (рис. 18). В результате проведенного анализа было выявлено, что лишь в одном случае из 100 скрещиваний расщепление 2:1 было достоверным, что, безусловно, является случайным событием. Во всех остальных индивидуальных скрещиваниях наблюдалось расщепление 1:1. Результаты по каждому скрещиванию приведены в приложении.
Схема индивидуальных скрещиваний SS c piwi3. Показан один из вариантов скрещивания, когда самки SS гетерозиготны по гену piwi, при этом данная мутация (обозначена звездой) не летальна. В случае же е летальности, потомство piwi /piwi3 будет нежизнеспособным. Таким образом, даже если в наших линиях имеется мутация в гене piwi, то она не является летальной, а значит, потомство N будет относительно однородным, поскольку не наблюдается гибель особей с определенным генотипом. В связи с этим дальнейший анализ не будет искажен вышеизложенными факторами.
При сборе тканей для последующей экстракции РНК было проанализировано не менее 100 гонад и обнаружено, что у всех потомков N яичники имели нормальную морфологию. Это можно считать еще одним подтверждением того, что серьезных нарушений в гене piwi в линиях MS и SS нет.
Тем не менее, это не исключает наличия полиморфных вариантов гена piwi, которые могут не оказывать существенного влияния на жизнеспособность и плодовитость мух, но при этом они не способны обеспечивать регуляцию ретротранспозонов в полной мере. Такие мутантные аллели piwi были созданы генно-инженерными методами, и у особей-носителей данных аллелей действительно наблюдалась дерепрессия МГЭ на фоне нормального развития гонад [Klenov et al., 2011]. В связи с этим, функциональный тест на данном этапе работы все еще являлся актуальным.
Анализ экспрессии ретротранспозона gypsy в яичниках гибридов первого поколения Как уже отмечалось выше, в качестве признака в данном скрещивании анализировался уровень экспрессии gypsy у потомства N, который служил индикатором наличия/отсутствия нарушений в гене piwi у линий SS и MS. При положительном результате теста мы ожидали, что особи N продемонстрируют высокий уровень экспрессии gypsy, причем значительно превышающий экспрессию в тканях родительских линий, поскольку ранее было показано, что мутации в гене piwi в гомозиготном состоянии могут приводить к 150-кратному увеличению экспрессии gypsy в яичниках по сравнению с гетерозиготными особями [Brennecke et al., 2007]. При отрицательном же результате у особей N должен регистрироваться заниженный уровень экспрессии gypsy, либо такой же, как и у родительских линий. В связи с этим для правильной интерпретации результатов теста важно еще раз подчеркнуть, что в линии SS отсутствуют активно экспрессирующиеся копии gypsy, при этом в двух других родительских линиях - MS и piwi3, активные копии gypsy есть, и экспрессируются они на достаточно высоком уровне.
Полученные данные позволяют сделать вывод, что результат теста отрицательный. Мутация в гене piwi, приводящая к нарушению его функции, связанной с контролем ретротранспозиции gypsy, в изогенных линиях MS и SS отсутствует.
Гибридологический и молекулярный анализ взаимодействия flamenco и piwi
Таким образом, мы предполагаем, что активность элементов Tirant и Idefix связана с ослабленным контролем на фоне мутации в локусе flamenco.
Следует подчеркнуть, что природа нестабильности в линиях MS и SS на сегодняшний день точно не установлена. Мутантный локус в данных линиях был картирован в области локализации локуса flamenco. Именно на этом основании линии считаются мутантами по этому локусу. Ранее в нашей лаборатории было показано, что этот локус экспрессируется в линиях MS и SS, то есть РНК-предшественник синтезируется, и теоретически, может обеспечивать биогенез piРНК. Отсюда возникло предположение, что мутантный фенотип линий обусловлен дефектом в другом гене.
Основной задачей анализа гибридов от скрещиваний MS и SS с piwi3, являлась экспериментальная проверка линий MS и SS на наличие мутаций в гене piwi, продукт которого принимает непосредственное участие в регуляции ретротранспозонов. В результате был сделан вывод, что мутации в гене piwi, отрицательно сказывающейся на функции данного гена, в тестируемых линиях нет. Данное заключение основывается на следующих фактах: 1) уровень экспрессии gypsy в яичниках гибридов N не превысил значений экспрессии в родительских линиях; 2) расщепление в потомстве индивидуальных скрещиваний SS и piwi3 на фенотипические классы N и Сy составило 1:1; 3) у всех гибридов яичники имели нормальную морфологию. Следующий факт, на который стоит обратить внимание, это отсутствие в наших экспериментах материнского эффекта генов flamenco и piwi. Наличие материнского эффекта для flamenco было обнаружено с момента его описания. Было показано, что активные транспозиции gypsy происходят у потомков, полученных от гомозиготных мутантных самок, даже в том случае, когда они наследуют нормальный аллель flamenco от отца (Plisson et al., 1994). По аналогии, в наших экспериментах мы могли бы детектировать высокий уровень транскрипции у потомства, полученного от гомозиготных по flamenco самок. В результате оказалось, что у самок N, уровень транскрипции был одинаково низким, независимо от статуса flamenco у самок-родителей (рис 12, 13). Однако следует учитывать, что в наших экспериментах «нормальные» по flamenco самки были мутантными по piwi. Таким образом, самки-родители в прямом и обратном скрещивании имели одинаковый фенотип – повышенный уровень экспрессии gypsy, и материнский эффект нивелировался. С другой стороны установлено, что способность наследоваться по материнской линии для разных piРНК проявляется в различной степени. В частности, для piРНК, комплементарных gypsy, этот эффект выражен в меньшей степени [Malone et al., 2009]. Это же справедливо и для других МГЭ, проявляющих свою активность в соматических тканях. Таким образом, вопрос о том, является ли flamenco локусом с материнским эффектом, нельзя считать до конца решенным. Наши данные свидетельствуют о том, что материнского эффекта в отношении gypsy данный локус не имеет.
Несмотря на отрицательный результат теста на наличие мутации в гене piwi, данный анализ позволил сделать ряд побочных выводов, которые представляют еще больший интерес. Это выводы о наличии как минимум трех независимых факторов наследственности, осуществляющих контроль МГЭ и проявляющих свои свойства в системе скрещиваний, описанной в настоящем разделе. По результатам проведенного анализа это следующие факторы: 1) ген, локализованный на Х-хромосоме. Вывод сделан на основании обнаруженного эффекта Nпр. Nобр в семенниках гибридов. С большей долей вероятности это локус flamenco, так как SS и MS уже ранее были описаны как мутанты именно по данному локусу. Следовательно, здесь мы наблюдаем комплементарное взаимодействие генов flamenco (или другого Х-сцепленного гена) и piwi. А это значит, что механизмы контроля МГЭ, нарушенные в SS и MS, связаны с системой РНК-интерференции и являются Piwi-зависимыми. До сих пор строгих доказательств этому не было, поскольку фенотип flamenco в данных линиях постулировался на основании повышенной транспозиционной активности gypsy, что не позволяет полностью раскрыть природу данных процессов; 2) неустановленный локус, ассоциированный с хромосомой СyO, демонстрирующий взаимодействие с flamenco в семенниках гибридов на фоне высокой копийности gypsy на СyO; 3) механизмы неустановленной природы, специфичные для Idefix, обуславливающие дерепрессию данного элемента в семенниках линии SS.
Таким образом, линии SS и MS можно рассматривать как хорошую модельную систему для изучения фундаментального процесса РНК интерференции, в особенности – вопроса происхождения эндогенных антисмысловых РНК. Следует отметить, что эта проблема изучена недостаточно, поскольку охарактеризованы не все факторы, участвующие в процессинге РНК-предшественника.
Скрещивая MS и SS с линией piwi3 и далее анализируя экспрессию gypsy в семенниках гибридов, можно выявлять фенотип flamenco. Ранее это осуществлялось путем детекции транспозиционных событий, что имеет ряд сложностей и ограничений, осложняющих генетический анализ. Один из таких способов – ovoD-тест, предполагающий анализ инсерций в «горячую точку» транспозиций gypsy in vivo – в ген ovoD [Prud homme et al., 1995]. Однако он трудоемок, и его не всегда можно применять в полном объеме, так как не всегда удается создать необходимые комбинации генов (зависит от дизайна эксперимента и направления скрещивания), кроме того, он позволяет только зарегистрировать транспозицию МГЭ, но не позволяет изучать молекулярные механизмы ее контроля. Вот почему новый подход, базирующийся на анализе экспрессии gypsy в семенниках гибридов, может быть успешно применен для решения вопроса о том, какие же на самом деле механизмы контроля gypsy нарушены в линиях MS и SS.
Следует также отметить, что локус flamenco имеет высокую степень гетерогенности в своей структуре. В разных линиях и природных популяциях могут существовать разные аллели этого гена [Zanni et al., 2013]. Причина фенотипа flamenco в каждом случае может быть разной. Это может быть делеция последовательности какого-либо МГЭ из локуса. Это было показано для линии нестабильной по элементам ZAM и Idefix [Zanni et al., 2013]. Дерепрессии gypsy на фоне такого аллеля flamenco, что вполне логично, не происходит. Другой причиной может быть нарушение транскрипции локуса [Robert et al., 2001]. Не исключено, что разные аллели flamenco могут различаться по тканеспецифичному контролю ретротраспозонов. Чаще обсуждается контроль ретротранспозонов со стороны этого гена в яичниках [Plisson et al., 1994; Mevel-Ninio et al., 2007]. Наши результаты показывают, что активность данного гена необходима и в семенниках. В литературе также имеются сведения об участии РНК-интерференции, в частности гена piwi, в контроле ретротранспозонов в мужских половых тканях [Kalmykova et al., 2005].
В настоящее время РНК-интерференция и процессы, ею регулируемые, интенсивно изучаются. Идентифицируются новые гены, отвечающие за контроль МГЭ с помощью piРНК [Anand, Kai, 2012; Czech et al., 2013; Handler et al., 2013; Muerdter et al., 2013]. Расширяются представления о роли piRNA-пути в регуляции не только активности транспозонов, но и структуры хроматина, фундаментальных процессов, обеспечивающих целостность генома [Mani, Juliano, 2013]. По этой причине наши линии можно эффективно использовать для дальнейших исследований генетических механизмов контроля не только ретротранспозона gypsy, но и других, родственных ему МГЭ.