Введение к работе
- з -
Актуальность проблемы: Молекулярный анализ структурно-функциональной организации генома зукариот и, в первую очередь, человека -одно из йагистральных быстро развивавшихся направлений современной генетики и молекулярной биологии. Решающие успехи последних лет в этой области стали возможными благодаря появлению высокоэффективных и достаточно экономичных биотехнологических приемов и методов,широкое применение которых ознаменовало начало качественна, нового этапа исследований в генетике зукариот, сделало вполне реальным картирование всех генов человека и выяснение первичной нукяеотидкой последовательности его генома. Естественно, что исследования подобного рода весьма актуальны как в плане Программы "Геном человека", так и для решения проблем медицинской генетики, поскольку на их основе разрабатываются наиболее эффективные стратегии ранней диагностики и профилактики наследственных болезней.Именно в такой направлении и была выполнена данная работа.
Нуковисцидоз (MB) -кистозный фиброз подкелудочной іелези,наиболее частое из всех известных на сегодняшний день аутосоыно-рецес-сивных заболеваний, встречается в европейских популяциях с частотой J:20O0 - 1:2500 нбворояденных. В среднем кгядый двадцатый яитель Европы и Северной Америки является гетерозиготным носителем мутантного гена муковисцидоза и ка'вдэя четырехсотая супружеская пара имеет примерно 257. риск ровдения больного ребенкз [European workins group on CF Genetics (EWGCFG), 1990].Только в США в 1990г. зарегистрировано до 13000 больных MB, а число гетерозиготных носителей предполояительно составляет около 13 млн.человек. Считается, что ежегодно в России роядается около 750 больных MB при средней частоте 1:2500 новорожденных в европейской части России (Капранов Н.Н. и др.,1992).
Цель работы. Изучить полиморфизм популяций и провести идентификацию мутаций гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (ТРБМ) в некоторых популяциях, в семьях высокого риска и у больных КВ.
Основные задачи работы.
1.Проанализировать особенности ДНК полиморфизма SB и 8-го инг-ронов гена ТРБМ в некоторых популяциях СНГ, в семьях высокого риска и у. больных МБ.
2,Изучить частоту наиболее распространенных мутаций экзонов 7(R334H.R34?P) и 1K6542X.G551D.6553X) гена ТРБМ у больных МЗ в разных популяциях.
3.Провести анализ информативности семей высокого риска МБ на носительсво некоторых молекулярных маркеров гена ТРБМ и апробиро-' вать этот подход для ДНК-диагностики MB у плода на ранних сроках развития, используя метод анализа полиморфизма внутри гена и метод прямой идентификаций мутаций посредством полимеразной цепной реакций (ПЦР).
Основные положения, выносимые на защиту.
І.Частота гекса- и гепта-такдеиннх тетра'мерных GftTT повторов (ТТП) 6В интрона гена ТРБМ у русских северо-западного региона России и Санкт- Петербурга оказалась сходной с таковой в популяциях Узбекистана.Азербайджана и Грузии; разница частот ТТП аллелей между грузинской и азербайджанской популяциями и между грузинской и узбекской популяциями статистически достоверна; обнаруаен ранее неизвестный окта-копийный повтор (КП) ТТП 6В интрона гена ТРБМ в 2-х семьях татарской национальности.
-
6КП 6В интрона гена ТРБМ находится в полном сцеплении с наиболее распространенной мутацией delF508,обусловленной делецией 3--х нуклеотидов в 10-ом экзоне гена ТРБН.а также обнаруживает неравновесие по сцеплении с другими изученными в данной работе мутациями этого же гена .
-
Обнаружены выраженные меяпопуляционные различия в частотах некоторых аллелей, обусловленных различиями в числе динуклеотид-ных Cfl/ET повторов в 8-ои интроне гена ТРБМ в русской,грузинской и узбекской популяциях.
4.Различия в числе динуклеотидных Cfl/ЄТ повторов в 8-ом интроне гена ТРБМ, обнаруженные в исследованных семьях русской национ-нальности с MB. определяют 7 различных аллелей из 8 характерных-для данного полиморфизма. Их частоты существенно варьируют как в нормальных, так и в мутантних хромосомах; хромосомам с мутацией delF508 гена ТРБМ соответствуют только аллели 2(23КП) и б(1?КП) в данной выборке.
5.Частота мажорных для Западной Европы мутаций G'55iD.S542X и R334H гена ТРБМ у больных MB северо-западного региона России и Санкт Петербурга оказалась сравнительно низкой, а мутации R347P и R553X того не гена в исследованной нами выборке больных MB вообще не обнаружены.
6. Анализ полиморфизма RB интрона гена ТРБМ, обусловленого ТТП в сочетании с детекцией мажорной для русской популяций мутации' delF508 того же гена судественно повышает информативность семей высокого риска по MB. т.е. делает их пригодными для молекулярной
- 5 -диагностики на ранних стадиях внутриутробного развития плода.
Научная новизна. В работе впервые проведен анализ частит тан-декннх тетрамерних ЄАТТ повторов 6В илтрона гена ТРЕМ в 4-х различных популяциях СНГ и выявлены достовернные различия соотношения 6КП и 7КП аллелей этого гена между грузинской и азербайджанской (р<0,05) и «езду грузинской и узбекской (р<0,05) популяциями.
Найден ранее неизвестный окта(8)- копийный повтор 6В интрона гена ТРЕМ у представителей татарской национальности.
Впервые обнаружено,что 6КП 6В интрона гена ТРЕН во всех изученных хромосомах сцеплен не только с мутацией delF508 этого гена,' но и с его другими нутациями.
Впервые проанализирована частота микросателлитных динуклеотид-ннх тандемных повторов С МДТП > СЙ/67 8-го интрона гена ТРЕМ в трех различиях популяциях (русской, узбекской и грузинской). Обнаруяе-тг виравенные межпопуляционные различия в распределении некоторых из аллелей, обусловленных различиями в числе динунлеотидных тандемных повторов (ДТП) СА/БТ в данном интроне этого гена.
Впервые в семьях высокого риска с куковисцидозом показано, что мутация delF508 гена ТРЕМ неслучайно сцеплена с повторами 2 (23КП) и 6(Ї7КП) ДТП Cfl/ЄТ 8-го интрона этого гена .
Впервые установлено, что манорные для популяций Западной Европы и Северной Америки мутации гена ТРБИ G551D. G542X. R334H, R347P и R553X в популяциях России и СНГ встречаются сравнительно редко.
Практическая значимость работы. Обнарузенное неслучайное сцепление 6КП 6В интрона гена ТРБЫ не только с мутацией delF50S, но и с другими мутациями гена, имеет большое практическое значение, так как позволяет широко использовать эти генетические особенности на начальном этапе скринирования при молекулярной диагностике MB.
Совместное использование анализа полиморфизма 6В интрона гена ТРЕМ в сочетании с пряной идентификацией мутации delF508 существенно повышает число информативных семей с высоким риском KB, т.е. делает их пригодными для молекулярной диагностики на ранних сроках беременности.
Апробация работы . Основные положения диссертации были представлены в виде постерннх докладов на 6-й Ежегодной Северо-ймери-канской конференции по муковицидозу (Вашингтон,1992). на XI Международном Конгрессе по муковисцидозу (Дублин.1992), в виде доклада на II1-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыха-
- 8 -ния (Санкт-Петербург. 1992), на заседании Общества Медицинских генетиков (1992).
Публикации. По теме диссертации опубликованн пять работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения. 3 глав, выводов и списка литературы.- Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и содеркит 13 таблиц и 18 рисунков. Список литературы содервит 124 источника ,из них 14 русских авторов и ПО иностранных.