Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Систематика и таксономическое строение рода Allium L. 7
1.2. Секция Allium 13
1.2.1. Чеснок Allium sativum 14
1.2.1.1. Происхождение, история возделывание и использование
14 Allium sativum
1.2.1.2. Ботаническая характеристика Allium sativum 15
1.2.1.3. Размножение Allium sativum 17
1.3. Геном растений и методы его исследования 18
1.3.1. Молекулярные методы анализа генома растений 19
1.3.1.1. Метод AFLP-анализа 20
1.3.1.2. Метод NBS-профайлинга 21
1.3.1.3. Анализ полиморфизма межгенных спейсеров и интронов ядерного и цитоплазматических геномов для изучения таксономии и филогении растений 21
1.3.2. Молекулярный анализ геномов Allium sativum и родственных видов 24 Allium
Глава 2. Материалы и методы 30
Глава 3. Результаты и обсуждение 39
3.1. Анализ полиморфизма генома чеснока A. sativum методами мультилокусного анализа 49
3.1.1. Анализ внутривидового полиморфизма генома чеснока A. sativum методом AFLP-анализа
3.1.2. Анализ полиморфизма семейства генов резистентности в геноме чеснока A. sativum методом NBS-профайлинга
3.2. Анализ полиморфизма генома лука-порея A. porrum методом AFLP 55
3.3. Анализ полиморфизма генома представителей секции Allium рода Allium методами мульти-и монолокусного анализов
3.3.1. Анализ межвидового полиморфизма у представителей секции Allium методом AFLP
3.3.2. Анализ нуклеотидных последовательностей некодирующих участков генома у образцов секции Allium рода Allium 69 82
3.3.2.1. Анализ вариабельности последовательности ядерного рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2
3.3.2.2. Анализ полиморфизма участков пластидного генома у представителей секции Allium
3.3.2.3. Анализ полиморфизма последовательности b/c интрона митохондриального гена nad1
3.3.2.4. Филогения секции Allium на основе анализа некодирующих участков генома 93
3.4. Секвенирование и анализ полной последовательности пластидного генома Allium sativum
3.5. Идентификация и анализ новых генов у видов рода Allium, ассоциированных с устойчивостью к холодовому стрессу
3.5.1. Идентификация и анализ CSP-генов 93
3.5.1.1. Идентификация и анализ CSP-генов у видов Allium 93
3.5.1.2. Идентификация и анализ CSP-генов у видов рода Brassica 99
3.5.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей CSPs Allium и Brassica
108
3.5.3. Анализ экспрессии генов AsCSP1, AsCSP2 и AsCSP3
вегетативных органах Allium sativum
Заключение 112
Выводы 115
Список сокращений 116
Публикации по теме диссертации 117
Список литературы
- Происхождение, история возделывание и использование
- Молекулярные методы анализа генома растений
- Анализ полиморфизма семейства генов резистентности в геноме чеснока A. sativum методом NBS-профайлинга
- Идентификация и анализ новых генов у видов рода Allium, ассоциированных с устойчивостью к холодовому стрессу
Происхождение, история возделывание и использование
Методы анализа генома, в зависимости от подхода, который используется для изучения полиморфизма ДНК, можно разделить на три группы: 1. основанные на гибридизации ДНК с ДНК-зондами (RFLP (restriction fragment length polymorphisms), VNTR (Variable Number Tandem Repeat)); 2. основанные на ПЦР (SSR (simple sequence repeats), ISSR (inter simple sequence repeats), STS (sequenceagged site), RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism), SSAP (sequence-specific amplification polymorphism) и др.); 3. основанные на секвенировании и ДНК-чипировании (SNP (single nucleotide polymorphism), DArT (diversity array technology), RAD-seq, RNA-seq и др.).
При этом в каждой из групп методы можно разделить на монолокусные и мультилокусные (геномный фингерпринтинг). Монолокусные методы анализа используются для маркирования хромосом и отдельных генов, а также нашли свое применение в селекционном процессе. Селекция с помощью молекулярных маркеров (marker-assisted selection, MAS) существенно ускоряет процесс создания новых сортов, так как обеспечивает направленную передачу сорту-реципиенту фрагментов генома донора, содержащих целевые гены (Ribaut and Hoisington, 1998). Молекулярные маркеры к генам устойчивости и генам количественных и качественных признаков позволяют быстро маркировать сорта, линии и гибриды, несущие эти гены и использовать их в селекции (Collard and Mackill, 2008).
Мультилокусные методы анализа используются чаще всего при определении внутривидовой вариабельности и при популяционном анализе видов. Такие методы как AFLP, NBS-профайлинг, SSAP эффективны для насыщения генетических карт локусами молекулярных маркеров. Также, данные методы используются для паспортизации сортов, обеспечения защиты авторских прав и проверки чистоты сортового материала (Хлесткина, 2011).
Метод AFLP (Amplified fragment length polymorphism) позволяет изучить полиморфизм преимущественно селективно-нейтральной части генома. В основе метода лежит селективная амплификация фрагментов геномной ДНК, предварительно обработанной двумя различными эндонуклеазами рестрикции (Vos et al., 1995). На первом этапе проводится обработка ДНК двумя рестриктазами, в результате чего образуются фрагменты с «липкими» концами. Затем к «липкими» концам лигируются адапторы – олигонуклеотидные последовательности, комплементарные «липким» концам. Далее проводится два раунда ПЦР: при первой ПЦР используются праймеры комплементарные адапторам, в результате чего образуется огромное количество фрагментов, которые невозможно дифференцировать на геле. Поэтому, для второго раунда ПЦР используются праймеры содержащие на 3-конце селективные нуклеотиды, что позволяет амплифицировать ограниченное число фрагментов. Продукты амплификации разделяют на полиакриламидном геле, для визуализации результатов один из праймеров содержит радио- или флуоресцентную метку.
Если ранее метод AFLP был трудоемок, дорог и небезопасен, так как использовалась радиоактивная метка и окрашивание гелей серебром для визуалиции полученных результатов, то сейчас он стал легок и безопасен, так как вместо радиоактивной метки применяется флуорометка (700 и 800 нм) и визуализация данных проводится лазером при определенной длине световой волны.
Метод AFLP имеет высокую разрешающую способность, показано, что амплифицированные ДНК-фрагменты покрывают весь геном (Arif et al., 2010). Из-за высокой воспроизводимости и простоты использования, в настоящее время метод AFLP широко применяется для исследования вариабельности генома как на межвидовом, так и на популяционном и сортовом уровнях, а также для филогенетических исследований и определения уровня гибридности поколений после скрещиваний (Meudt and Clarke, 2007; Simmons et al., 2007; Zhang et al., 2008; McKinnon et al., 2008; Tiwari et al., 2013; Sorkheh et al., 2016). Использование метода AFLP значительно ускоряет поиск новых генотипов, а также контроль интрогрессии чужеродных генов в природные популяции, что является весьма актуальным с позиций современной экологии и защиты разнообразия естественных экосистем (Wiel et al., 1999).
Геном растений содержит несколько семейств генов устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды. Семейство R-генов устойчивости (резистентности) включает гены, кодирующие белки, образуемые растениями в ответ на атаку фитопатогенов. При проникновении патогена в клетку происходит активация защитных рецепторных R-белков, которые узнают специфичные белки и олигосахариды фитопатогена и запускают каскад защитных реакций (Vossen et al., 2013).
В настоящее время большое количество R- генов клонированы и в зависимости от строения выделяют несколько классов R–генов, одним из наиболее представительных в геноме растений является класс NBS-LRR-генов. Этот класс генов кодирует белки, состоящие из нуклеотид-связывающего домена (nucleotide binding site, NBS) и домена, обогащенного лейциновыми повторами (leucine rich repeat, LRR). В NBS-домене выделяют несколько высоко консервативных мотивов (P-петля, киназа 2, GLPL и др.), которые присутствуют в белках прокариот и эукариот (Riedl et al., 2005).
Был показан возможный механизм действия: в отсутствие патогена NBS-LRR-белки инактивированы, а в присутствии элиситора патогена происходит изменение конформации NBS-домена и высвобождению АДФ, что, в свою очередь, приводит к активации или деактивации всего рецептора (Takken et al., 2006).
Как было показано, в том числе при анализе полных геномов растений, NBS-LRR-гены могут образовывать протяженные кластеры. При этом гены, входящие в один кластер, обычно более схожи.
Было опредеделено, что R-гены растений высоко полиморфны и эволюционируют быстрее других функциональных участков генома, что связывают с адаптивной значимостью. При этом у различных семейств растений, как было показано при сравнительном анализе локализации этих последовательностей у представителей родов Poaceae и Solanaceae, отмечается различная скорость изменения и реорганизации последовательностей R-генов (Pan et al., 2000).
Молекулярные методы анализа генома растений
Для проведения AFLP-анализа на основе коллекции ГНУ ВНИИР имени Н.И. Вавилова (г. Санкт-Петербург, Россия) был сформирован набор образцов чеснока A. sativum, по одному образцу из 80 дикорастущих популяций различного географического происхождения: 12 образцов - из Центральной Азии (центр происхождения), 68 - из популяций современного культигенного ареала, в том числе 38 образцов из разных регионов России, от Сахалина до Санкт-Петербурга. В качестве внешней группы были взяты родственные чесноку образцы видов A. porrum (три образца) и A. scorodoprasum (один образец), относящиеся, как и A. sativum, к секции Allium, а также образцы видов из подродов Butomissa, Cepa и Rhizirideum рода Allium (табл.2.1). Таким образом, для AFLP-анализа была составлена ДНК-коллекция из 88 образцов луков.
Подбор рестрикционных эндонуклеаз и праймерных комбинаций проводился на выборке из 7 образцов ДНК, включающей пять образцов чеснока A. sativum и по одному образцу A. porrum и A. nutans. На данной выборке были протестированы следующие сочетания рестриктаз: EcoRI/MseI, EcoRI/PstI, EcoRI/TaqI. При проведении AFLP реакции для каждой из пар эндонуклеаз оценивалось общее число фрагментов в спектрах, число полиморфных фрагментов, а также воспроизводимость получаемых спектров. Наилучшие результаты (общее число фрагментов/число полиморфных фрагментов) дала комбинация ферментов рестрикции EcoRI/MseI, которая и была выбрана для дальнейшего AFLP-анализа.
По результатам тестирования 12 праймерных комбинаций, для дальнейшего AFLP-анализа на всем наборе образцов было отобрано только три пары праймеров, содержавших семь селективных нуклеотидов на 3 -конце: E41-AGG/M52-CCCG, E35-ACA/M35-ACAC и Е32-AАС/М52-CCCG. Данные праймерные пары позволили детектировать оптимальное число фрагментов на полиакриламидном геле и выявить внутривидовой полиморфизм у образцов A. sativum (рис. 3.1).
С помощью отобранных праймерных комбинаций для каждого анализируемого образца были получены полиморфные спектры AFLP-фрагментов. Всего было идентифицировано 307 полиморфных фрагментов, длины амплифицированных фрагментов варьировали в пределах от 80 до 600 п.н. Для анализируемых 80 образцов чеснока A. sativum количество полиморфных фрагментов составило 202 (65,7% от общего числа фрагментов). При этом в AFLP-спектрах чеснока только у образца k113 (Россия, Приморский край) было детектировано два специфичных фрагмента, не встречающихся у других исследуемых образцов. Как правило, при AFLP-анализе внутривидового полиморфизма выявляется гораздо больше образец-специфичных фрагментов (Gril et al., 2008; Дьяченко и др., 2014), но в случае чеснока столь низкое число специфичных фрагментов может быть объяснено, по-видимому, тем, что чеснок размножается преимущественно вегетативным путем.
С помощью программы Past3 были рассчитаны генетические расстояния с использованием коэффициента Жаккара. Среднее значение генетических расстояний между образцами чеснока составило 0,37. Минимальное генетическое расстояние (0,06) было выявлено между образцами A. sativum k44 (о. Сахалин) и k42 (Египет), максимальное генетическое расстояние (0,72) выявлено между образцами k242 (Бенин) и k113 (Приморский край). Значения генетических расстояний между A. sativum и видами, взятыми в качестве внешней группы, варьировало от 0,62 (A. sativum – A. porrum) до 0,94 (A. sativum – A. nutans).
На основе полученных матриц методом Neighbor Joining (TREECON 1.3b) был проведен кластерный анализ (рис.3.2). Базальное положение на дендрограмме занимает образец A.odorum (подрод Butomissa секция Butomissa), образцы видов A. porrum, A. sativum и A. scorodoprasum, относящиеся к секции Allium, сформировали единый кластер с высоким индексом бутстреп-поддержки (ИБ=74). Внутри данного кластера все исследуемые образцы чеснока A. sativum объединились в единый полиморфный подкластер с высоким индексом бутстреп-поддержки (ИБ=95), базальное положение в котором занимает образец k113 из Приморского края. Рисунок 3.2. Дендрограммы генетических различий на основе данных AFLP-анализа (NJ, бутстрепирование проводилось на 1000 репликах, точками обозначены образцы из первичного центра). Внутри данного субкластера выделяется несколько групп образцов, однако почти все они характеризуются низким уровнем бутстреп-поддержки (ИБ 50), за исключением нескольких образцов: k41 и k80 из Приморского края (ИБ=65), k251 из Испании и образец сорта Perla из Аргентины (ИБ=70), k221 из Смоленска и k289 из Владимира (ИБ=72), k46 из Эфиопии и k378 из Алтайского края (ИБ=76), k143 и k167 из Испании (ИБ=88), k258 из Испании и k294 из Венгрии (ИБ=89), k277, k289 из Приморского края, k415 из Алтая, k42 из Египта и k44 с о. Сахалин (ИБ=86).
Образцы из первичного центра происхождения (Казахстан, Киргизия, Туркменистан, Узбекистан) распределились на дендрограмме равномерно (отмечены на рис.3.1 точками). Как видно на дендрограмме, кластерный анализ не выявил зависимости разделения образцов A. sativum на группы от географического происхождения/места произрастания исследуемых образцов: в группах оказались образцы из разных стран. Анализ главных координат, как и кластерный анализ, не выявил разделение образцов чеснока на группы в зависимости от их происхождения. Почти все анализируемые образца A. sativum образовали единую группу, за исключением шести образцов (рис.3.3).
Анализ популяционной структуры (программа STRUCTURE 2.3.4, model-based Bayesian) по результатам AFLP-анализа выявил разделение исследуемых образцов чеснока по набору ДНК фрагментов на восемь групп (К=8; LnLike= –3797,2) (рис.3.4). Для определения количества групп число итераций задавалось от 1 до 15.
Как видно на рис.3.4, у некоторых образцов преобладает преимущественно один набор ДНК-фрагментов (тип генома) (на рисунке это образцы с преобладающим одним цветом), у большинства образцов чеснока совмещено в разных соотношениях по несколько наборов ДНК-фрагментов. Образцы из первичного центра распределились по группам неравномерно. В группах D, E и H нет ни одного образца из первичного центра, что, по-видимому, может быть связано с тем, что в нашу выборку образцов для анализа не попали родственные им генотипы из первичного центра происхождения.
На рисунке 3.4 можно выделить несколько интересных групп. Группа F включает 6 образцов из первичного центра происхождения, 5 образцов из России и 1 образец из Украины, что, вероятно, может быть связано с их общим происхождением, учитывая, что страны первичного центра происхождения чеснока входили ранее в состав СССР.
Тип генома D выявлен всего у двух образцов – k113 (Приморский край, Росси) и k253 (Перу), у нескольких образцов из других групп данный тип генома присутствует в минорных долях. Эти же два образца формируют базальные ветви на дендрограмме (рис.3.2). В группе Н образцы k251 (Испания) и Perla (Аргентина) имеют практически одинаковый тип генома и, как было уже сказано выше, эти образцы формируют на дендрограммах отдельную группу с высокой поддержкой (рис.3.2). Образец k18 (Болгария), который на дендрограаме образует с этими двумя образцами отдельный субкластер, но с низкой поддержкой, также попал в группу H, но как видно на рис.3.3 он имеет четверть фрагментов группы Е.
Анализ полиморфизма семейства генов резистентности в геноме чеснока A. sativum методом NBS-профайлинга
Для сравнительной оценки геномного полиморфизма A. sativum методами AFLP и NBS-профайлинга был исследован внутривидовой полиморфизм у другого культивируемого вида рода Allium – лука-порея Allium porrum, который является перекрестно-опыляемым. Лук-порей A. porrum, как и чеснок, относится к секции Allium и является важной овощной культурой. Представлялось интересным сравнить уровень внутривидового геномного полиморфизма у вегетативно размножаемого вида A. sativum и перекрестно опыляемого вида A. porrum. Для этого нами был проведен анализ линий и сортообразцов лука-порея, так как ранее анализ внутривидового полиморфизма и вариабельности семейства R-генов лука-порея не проводился.
В анализ были взяты 16 линий и сортов лука-порея отечественной селекции (табл. 2.1) из коллекции ВНИИССОК, в качестве внешней группы взяты девять образцов других луков. Для рестрикции геномной ДНК образцов была использована комбинация ферментов рестрикции EcoRI/MseI, для проведения AFLP-анализа были отобраны 4 праймерные пары с семью селективными нуклеотидами: E35-АСА/М35-ACAC, E38-АСТ/М52-CCCG, E38-АСТ/М52-CCCT, Е41-AGG/М52-CCCG. Для NBS-профайлинга были взяты те же четыре праймерные пары, что и для анализа A. sativum.
В результате AFLP-анализа для каждого анализируемого генотипа были получены специфичные ДНК-спектры. Всего было идентифицировано 265 полиморфных AFLP-фрагментов длиной от 80 до 750 п.н., число ДНК-фрагментов на праймерную комбинацию варьировало от 23 до 76. Для образцов A. porrum было детектировано 24 специфичных фрагментов, из них два фрагмента были специфичны для образцов №2280 и №2251. Пять видоспецифичных фрагментов было идентифицировано в ДНК-спектре образца A. nutans (сорт Очарование), четыре фрагмента в ДНК-спектре A. scorodoprasum (сорт Жемчуг), три фрагмента в ДНК-спектре A. sativum и два в ДНК-спектре A. odorum (сорт Априор). По результатам NBS-профайлинга всего было идентифицировано 121 полиморфный фрагмент, из них для образцов A. porrum полиморфными были 72 фрагмента.
Генетические расстояния по результатам AFLP-анализа между исследованными образцами A. porrum варьировал от 0,11 между образцами A. porrum 2264 и сортом Поликросс до 0,32 между образцами A. porrum 2001 и Monstreux d Elbeuf. Между образцами A. porrum и A. scorodoprasum значения генетических расстояний варьировали в пределах 0,28-0,37, а между образцами A. porrum и A. sativum в пределах 0,36-0,45. Наибольшие генетические расстояния были детектированы между образцами A. porrum и представителями секции Cepa (0,43-0,54).
Рассчитанные по результатам NBS-профайлинга генетические расстояния между образцами A. porrum оказались ниже и варьировали от 0,01 (A. porrum 2001 - A. porrum 2541) до 0,20 (A.porrum 2239 - A. porrum 2362). Среднее значение GD составило 0,12.
На дендрограммах, построенных по результатам AFPL-анализа и NBS-профайлинга, все анализируемые образцы A. porrum формируют единый кластер с высоким индексом бутстреп-поддержки, базальное положение к которому занимает образец A. scorodoprasum (рис.3.11). Внутри кластера A. porrum хотя и наблюдается объединение образцов в группы, однако, в большинстве случаев такая кластеризация не имела высоких значений бутстеп-поддержки. Образцы A. porrum, A. sativum и A. scorodoprasum формируют общий кластер видов секции Allium (ИБ=100), базальное положение в котором занимают образцы A. sativum.
Образцы видов секции Cepa на дендрограмме образуют второй кластер (ИБ=99), базальное положение в кластере занимает образец A. fistulosum (1776). Виды A. odorum (секция Butomissa) и A. nutans (секция Rhizirideum) сформировали отдельные ветви на дендрограмме.
Таким образом, методами AFLP и NBS-профайлинга был исследован внутривидовой полиморфизм A. porrum. Внутривидовой геномный полиморфизм A. porrum варьировал от 0,11 до 0,32, что ниже полиморфизма вегетативно размножаемого чеснока A. sativum (GDср=0,37), не смотря на то, что лук-порей является перекрестно опыляемой культурой. Для сравнения, внутривидовой полиморфизм дикорастущих популяций A. ursinum по результатам ISSR-анализа варьировал от 0,27 до 0,42 (Rola et al., 2015).Полиморфизм семейства R-генов у A. porrum оказался значительно ниже вариабельности этого семейства генов у A. sativum (0,01-0,20 против 0,10-0,68). По-видимому, низкий уровень полиморфизма A. porrum как всего генома в целом, так и адаптивно-значимого семейства генов может быть связан с тем, что данный вид не имеет дикорастущих популяций (доноров генетического разнообразия) и известен только в культуре, к тому же он имеет ограниченный, в отличие от чеснока A. sativum, культигенный ареал. 3.3. Анализ полиморфизма генома представителей секции Allium рода Allium методами мульти-и монолокусного анализов
Одной из задач работы был анализ полиморфизма генома представителей секции Allium рода Allium для выявления филогенетических отношений между видами данной секции и уточнения таксономического статуса ряда видов. Секция Allium включает около 120 видов растений (Hanelt, 1996), первичным центром происхождения которых считается Центральная Азия и Средиземноморье (Hanelt et al., 1992).
В секции Allium можно выделить условно две наиболее значимые группы видов. Первая группа включает чеснок A. sativum (2n=16), A. longicuspis (2n=16), A. tuncelianum (2n=16), A. scorodoprasum (2n=16) и некоторые другие виды, которые обладают характерным чесночным ароматом и вкусом, обусловленным содержанием различных сульфоорганических соединений, и которые используются в пищу в местах их дикого произрастания (Fritsch and Keusgen, 2006; Ipek et al., 2008). Вторая группа, так называемая «Allium ampeloprasum complex» (или «leek-group») (Messiaen et al., 1993; Hirschegger et al., 2010), включает лук-порей A. porrum (2n=32) и лук виноградный A. ampeloprasum (2n=16, 24, 32, 40, 48, 56, 64), а также родственные им A. commutatum (2n=16, 32), A. polyanthum (2n=32), A. pyrenaicum (2n=32) и некоторые другие виды. Представлялось интересным оценить уровень межвидового геномного полиморфизма и изучить филогению у представителей данной секции, используя современные методы мульти- и монолокусного анализа.
Идентификация и анализ новых генов у видов рода Allium, ассоциированных с устойчивостью к холодовому стрессу
Для каждого взятого в анализ образца были определены нуклеотидные последовательности ядерных ITS-спейсеров, шести фрагментов пластидного генома и последовательность b/c интрона митохондриального гена nad1. Полученные для каждого образца нуклеотидные последовательности были объединены в единую последовательность. В результате, суммарная длина исследуемых участков варьировала от 7249 п.н. у A. tuncelianum (09-24-0001-20) до 7493 п.н. у A. longicuspis (04-34-0065 20) (табл. 3.1). С помощью программы MEGA 7.0 была подобрана модель и построена дендрограмма (рис.3.23).
Базальное положение на дендрограмме занимает вид A. ursinum (2n=14, подрод Amerallium секция Arctoprasum), который относится к первой эволюционной линии рода Allium, в то время как все остальные исследуемые нами виды относятся к третьей эволюционной линии (Fritsch, 2001).
Все образцы секции Allium формировали единый полиморфный кластер (ИБ=100), базальную ветвь к которому занял A. odorum (секция Butomissa). Внутри данного кластера с высоким индексом бутстреп-поддержки (ИБ=75) выделяется субкластер видов т.н. «Allium ampeloprasum complex»: A. ampeloprasum, A. commutatum, A. polyanthum, A. porrum и A. pyrenaicum. Отдельные видовые субкластеры с высоким индексом бутстреп-поддержки формировали только виды A. atroviolaceum (ИБ=100), A. tuncelianum (ИБ=99) и A. leucanthum (за исключением образца 6810), остальные виды формировали смешанные субкластеры.
Образец A. leucanthum (6810) формировал базальную ветвь к субкластеру образцов A. iranicum и A. pseudoampeloprasum. Исходя из того, что у этих видов перекрывающийся ареал, можно предположить, что образцы A. leucanthum (6810) A. pseudoampeloprasum имеют гибридное происхождение, и, скорее всего, являются результатом скрещивания с A. iranicum. В пользу этого говорит то, что по результатам AFLP-анализа образец A. leucanthum (6810) формирует единый субкластер с остальными образцами данного вида, а A. pseudoampeloprasum формирует отдельную ветвь. По результатам анализа пластидных спейсеров, у A. leucanthum (6810) и A. pseudoampeloprasum были идентифицированы SNPs и короткие индели, характерные для образцов A. iranicum. Рисунок 3.23. Дендрограмма, построенная на основе объединенных по каждому исследуемому образцу нуклеотидных последовательностей некодирующих участков генома (ML, модель K2+G+I). Интересно отметить, что A. iranicum (2n=32), который некоторые исследователи считают предком лука-порея, так как он также формирует утолщенный ложный стебель и используется в пищу в местах произрастания, сформировал обособленный субкластер, достаточно удаленный от остальных видов «Allium ampeloprasum complex» (рис.3.23), что подтверждает ранее проведенные цитологическими исследованиями, показавшие, что A. iranicum является природным аллополиплоидом, и не родственен A. ampeloprasum, A. commutatum, A. porrum (Ghaffari, 2006).
Образцы A. sativum, как и по результатам AFLP-анализа, формировали субкластер с A. longicuspis. По результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей, вид A. longicuspis генетически не отличим от чеснока A. sativum. Проводимые ранее исследования не выявили различий между этими двумя видами, ни по результатам изозимного анализа (Pooler and Simon, 1993), ни по результатам AFLP-анализа (Volk et al., 2004). Полученные данные поддерживают гипотезу о том, что чеснок может быть мутантной формой A. longicuspis, у которой, по-видимому, произошли мутации по ключевому гену или нескольким генам, участвующим в процессах флорогенеза (MADS-гены и др.) и образования семян (Rotem et al., 2007, 2011). Внутри данного субкластера выделяется две группы образцов чеснока. Такое разделение на группы обусловлено полиморфизмом длин изученных фрагментов генома (табл. 3.1), а также наличием ряда SNP и инделей, характерных для этих групп образцов. Первая группа (ИБ=78) включает образцы чеснока 05-29-0001-20 (Австрия), 74 (Киргизия), 94 (Армения), 208 (Ямайка) и 242 (Бенин), а также образец A. longicuspis. Вторая группа (ИБ=77) включает образцы 26 (Монголия), 39 (Приморский край, Россия), 53 (Китай), 111 (Перу), 178 (Туркменистан). Три другие образца (31 (Узбекистан), 96 (Туркменистан) и 255 (Мексика)), сформировали отдельные ветви внутри данного субкластера, так как у этих образцов были детектированы однонуклеотидные замены и короткие индели, которых не было у других исследуемых образцов чеснока. Образцы A. tuncelianum формировали обособленный субкластер, достаточно удаленный от A. sativum, что не подтверждает его предковую роль в образовании A. sativum.
По результатам анализа некодирующих участков генома, образцы видов A. baeticum, A. erubescens, A. rotundum и A. scorodoprasum формируют на дендрограмме смешанный субкластер (ИБ=88) (рис.3.23). Внутри этого субкластера образцы A. scorodoprasum формировали отдельный субкластер (ИБ=71), базальное положение к которому занял образец A. rotundum (2197). Остальные образцы A. rotundum формировали общий субкластер с A. erubescens (ИБ=80), а образец A. baeticum сформировал отдельную ветвь между этими двумя субкластерами (рис.3.23). По результатам AFLP-анализа A. erubescens, A. scorodoprasum и A. rotundum образовали отдельные удаленные субкластеры с высоким индексом бутстреп-поддержки, а A. baeticum формировал базальную ветвь к субкластеру A. rotundum (рис.3.12). Также, стоит отметить, что A. erubescens, A. scorodoprasum и A. rotundum имеют общий ареал (Передняя Азия), и, по-видимому, могут скрещиваться между собой. Морфологически эти виды довольно схожи, что осложняет разграничение этих видов, поэтому ранее некоторые исследователи считали A. rotundum подвидом A. scorodoprasum (Stearn, 1978), а Seregin А. (2004) на основе анализа гербарных коллекций отмечает, что виды A. erubescens и A. rotundum практически не отличаются друг от друга по морфологическим дескрипторам. Проведенные ранее цитологические исследования показали наличие у этих видов полиплоидных форм (2n=24, 32, 48, 64) (Pastor, 1982; Mathew, 1996; Ozhatay and Johnson, 1996, Miryeganeh and Movafeghi, 2011), что, вероятно, может быть связано с образованием аллополиплоидных межвидовых гибридов.
Вид A. baeticum имеет ограниченный ареал (Португалия, Испания, Алжир и Тунис) и ранее не проводились молекулярно-генетические исследования этого вида, поэтому оставалось неясным его положение в секции Allium. По результатам проведенного нами AFLP-анализа и анализа некодирующих участков генома, можно сделать вывод, что данный вид близок к A. rotundum и, весьма вероятно, имеет гибридное происхождение. Также, можно предположить, что A. baeticum является аллополиплоидом, так как этот вид известен только в тетраплоидной форме (2n=32) (Peruzzi et al., 2016).