Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Классификация и филогения в Triticeae 10
1.1.1. Гексаплоидная пшеница (Triticum aestivum L.) 12
1.1.2. Род Thinopyrum и его значения 14
1.1.3. Генетические отношения между пятью основными геномами St, E, A, B и D в Triticeae 20
1.2. Мобильные элементы 21
1.2.1. Типы, структуры и распределения ретротранспозонов в растениях 24
1.2.1.1. LTR ретротранспозоны группы Ty1/copia 25
1.2.1.2. LTR ретротранспозоны группы Ty3/gypsy 27
1.2.1.3. LINE 27
1.2.1.4. SINE
1.2.2. Филогении и транспозиционная деятельность Ty1/copia и Ty3/gypsy подгрупп ретротранспозонов в геномах зерновых 28
1.2.3. Активация ретротранспозонов стрессовыми факторами 30
1.2.4. Ретротранспозоны как мутагены 31
1.2.5. Тандемные повторы в растениях 32
1.3. Центромеры растений 34
1.3.1. Сателлитные повторы 38
1.3.2. Центромерные ретротранспозоны 40
1.3.3. Транскрипция центромерных повторов 41
1.3.4. Структура и организация центромерной ДНК 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Растительный материал 45
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение ДНК из растительного материала 46
2.2.2. ПЦР-анализ 47
2.2.3. ПЦР в реальном времени 47
2.2.4. Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей 49
2.2.5. Биоинформационный анализ 50
2.2.6. Флуоресцентная и геномная гибридизация in situ (FISH, GISH) 2.2.6.1. Приготовление хромосомных препаратов 50
2.2.6.2. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 51
2.2.6.3. Геномная гибридизация in situ (GISH) 51
2.2.7. Кариотипирование 52
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Верификация объектов исследования 53
3.2. Ретротранспозоны 55
3.3. Центромерный Ty3/gypsy ретротранспозон
3.3.1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей клонированных участков центромерных Ty3/gypsy ретротранспозонов 61
3.3.2. Филогенетический анализ 63
3.3.3. FISH локализация RT-CR на митотических хромосомах 65
3.3.4. ПЦР в реальном времени 73
3.4. Тандемные повторы 75
3.4.1. Повтор П720 77
3.4.2 Повтор П170 82
3.4.3. Повтор П332 87
3.4.4. Повтор П631 92
3.4.5. Повтор П523 98
3.4.6. Повтор П431 103
3.4.7. Повтор П496 108
3.5. Апробация выявленных тандемных повторов для идентификации чужеродных замещений в мягкой пшенице 111
3.5.1. Повтор П170 111
3.5.2. Повтор П631 112
Заключение 117
Выводы 120
Список литературы 123
- Генетические отношения между пятью основными геномами St, E, A, B и D в Triticeae
- Выделение ДНК из растительного материала
- Флуоресцентная и геномная гибридизация in situ (FISH, GISH) 2.2.6.1. Приготовление хромосомных препаратов
- FISH локализация RT-CR на митотических хромосомах
Введение к работе
Актуальность. Большую часть растительного генома составляют
повторяющиеся последовательности ДНК (Flavell et al., 1992; Voytas et al., 1992;
Schmidt & Heslop-Harrison, 1998; Charles et al., 2008). Они гетерогенны и
отличаются между собой по копийности, длине, нуклеотидному составу,
характеру локализации в геноме. Повторяющуюся ДНК можно объединить в
отдельные семейства в зависимости от организации, выявляемым доменам и
распределению в геноме. Предположительно, повторяющиеся
последовательности ДНК участвуют в стабилизации и поддержании хромосомной
структуры, в «узнавании» хромосом в процессе клеточного деления и их
правильном расхождении. Видообразование, в том числе алло- и
автополиплоидизация растений, зачастую сопровождается значительными изменениями в повторяющейся ДНК, прежде всего в изменении её копийности.
Дикорастущие виды пырея, такие как Thinopyrum intermedium,
Th. bessarabicum, а также некоторые виды родов Pseudoroegneria и Dasypyrum, являются донорами хозяйственно ценных признаков и используются в отдаленной гибридизации мягкой пшеницы (Цицин, 1978; Larkin et al., 1995; Chen et al., 2003; Yang et al., 2006; Luo et al., 2009). Изучение повторяющихся последовательностей ДНК этих видов c применением современных подходов в области молекулярной цитогенетики позволит получить дополнительные знания по эволюции семейства Злаковых. Наряду с этим на основе повторяющихся последовательностей ДНК возможно создание цитогенетических маркеров, специфичных для данных видов и/или их отдельных хромосом, что может быть использовано для характеристики как коллекций растительного материала, полученного путем отдаленной гибридизации, так и непосредственно в ходе самого селекционного процесса.
В целом же изучение различных семейств повторяющейся ДНК и их структурной организации в хромосоме актуально для пополнения наших знаний о функции и эволюции повторяющейся ДНК у растений.
Цель работы. Цель данной работы – изучить хромосомную организацию повторяющихся последовательностей ДНК в геномах дикорастущих сородичей пшеницы.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие
задачи:
-
Изучить организацию различных ретроэлементов на уровне хромосом у дикорастущих сородичей пшеницы.
-
Методами биоинформатики выявить высококопийные тандемно-организованные последовательности ДНК в геноме мягкой пшеницы.
-
Методами гибридизации in situ провести физическое картирование выявленных повторяющихся последовательностей ДНК на хромосомах Th. intermedium, P. spicata, D. villosum и Th. bessarabicum. Научная новизна. Впервые показана локализация центромерного Ty3/gypsy
ретротранспозона в центромерах всех хромосом Th. bessarabicum, P. spicata, D. villosum и Th. intermedium. Анализ копийности центромерного Ty3/gypsy ретротранспозона по результатам FISH показал, что у аллополиплоида Th. intermedium копийность различна по субгеномам. Установлена локализация на
хромосомах и показана возможность использования в качестве цитогенетических маркеров для FISH анализа хромосом Th. bessarabicum, P. spicata, D. villosum и Th. intermedium тандемных повторов П720, П170, П322, П631, П523, П431 и П496, выявленных в геноме мягкой пшеницы. Впервые показана локализация двух тандемных повторов (П170 и П496) на хромосомах пшеницы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты,
полученные в данной работе, имеют теоретическое значение для
фундаментальных исследований структурной организации и эволюции хромосом злаков. Большое значение имеют данные, полученные с использованием методов молекулярной цитогенетики, о геномах St, Jb, V, Jr, Jvs у разных видов злаковых.
Выявленные тандемные повторы пшеницы могут быть использованы как цитогенетические маркеры для идентификации отдельных субгеномов, а также индивидуальных хромосом дикорастущих сородичей пшеницы, что важно в агробиотехнологиях при создании сортов пшеницы с использованием методов хромосомной инженерии.
Методология и методы диссертационного исследования. Диссертация выполнена с использованием современных, хорошо зарекомендовавших себя методов молекулярной цитогенетики, филогенетики и биоинформатики, на современном оборудовании. Полностью методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту:
-
Центромерные Ty3/gypsy ретротранспозоны локализованы в центромерах всех хромосом видов: Th. bessarabicum, P. spicata, D. villosum и Th. intermedium. У аллополиплоида Th. intermedium копийность цетромерного Ty3/gypsy ретротранспозона различна по субгеномам.
-
Тандемные повторы, выявляемые в геноме мягкой пшеницы с помощью биоинформационного анализа данных NGS, возможно использовать в качестве цитогенетических маркеров для FISH анализа хромосом её дикорастущих сородичей.
-
На хромосомах Th. bessarabicum локализуются пять тандемных повторов (П720, П170, П631, П431 и П496), выявленных в геноме мягкой пшеницы.
-
На хромосомах P. spicata локализуются два тандемных повтора (П720 и П631), выявленных в геноме мягкой пшеницы.
-
На хромосомах D. villosum локализуются два тандемных повтора (П720 и П322), выявленных в геноме мягкой пшеницы.
-
На хромосомах Th. intermedium локализуются семь тандемных повторов (П720, П170, П322, П631, П523, П431 и П496), выявленных в геноме мягкой пшеницы.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы опубликованы в 5 печатных работах, в том числе в 3 статьях в журналах из списка ВАК, из них одна – в рецензируемом международном и две – в российских журналах. Ключевые результаты работы были доложены на международных и российских конференциях: Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic
era (University of Silesia in Katowice Poland, 2014), VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы г. Ростов-на-Дону, 15–20 июня 2014 г. и на ежегодных конференциях молодых ученых и преподавателей РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в диссертационной работе на всех её этапах. Исследование центромерного повтора – совместно с И.В. Кировым под руководством М.Г. Дивашука и Г.И. Карлова, выявление тандемных повторов пшеницы – совместно с лабораторией биоинформатики ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России, остальные разделы диссертации – самостоятельно под руководством М.Г. Дивашука. Автор лично проводил обработку, анализ и интерпретацию всех полученных результатов, а также подготовку и оформление публикаций и рукописи, принимал непосредственное участие в разработке программы исследований, планировании и проведении экспериментов. Результаты диссертационной работы обобщены совместно с научным руководителем М.Г. Дивашуком, текст рукописи подготовлен самостоятельно. Автор принимал непосредственное участие в написании и подготовке к публикации печатных работ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 165 страницах машинописного текста и включают 72 рисунка, 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включая обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 293 источника, из них 289 – на английском языке, а также приложения.
Генетические отношения между пятью основными геномами St, E, A, B и D в Triticeae
Agropyron по Love органичивался менее чем 10 видами, включая типовой вид А. cristatum (2n = 14, PP), геном которого был обозначен как P. Все виды, кроме содержащих P геном, были исключены из рода Agropyron. Геном Pseudoroegneria был обозначен как S. Это небольшой род, состоящий из 11 видов на основе диплоидного вида P. spicata (2n=14, SS). Love отнес Lophopyrum к отдельному роду с геномным обозначением Е, в то время как Dewey поместил его в род Thinopyrum (таб. 1). Love перенес шесть видов из бывшего Agropyron junceum (L.) Beauv. совершено в новый род Thinopyrum (Love, 1982). Новый род характеризовался как несущий геном J и включал также вид Thinopyrum junceum (L.) Love (2n = 42). Dewey включает в род Thinopyrum около 20 видов, в том числе три вида из родов Lophopyrum и Elytrigia (Dewey, 1984). Различие между геномами Thinopyrum (J геном) и Lophopyrum (E геном) является дискуссионной темой на протяжении десятилетий. Согласно Dewey (1984), «J геном Thinopyrum и
E геном Lophopyrum так близки, что два генома и два рода должны быть объединены». Он обозначал оба генома как J. Однако данные сиквенсов хлоропластов, характера спаривания хромосом в мейозе, кариотипических различий и последовательности 5S рРНК обеспечивают четкое доказательство того, что они представляют собой разные роды (Jauhar, 1990; Kellogg et al., 1996). Морфологическое определение рода Agropyron вызвало некоторые неопределенности относительно диплоидных и декаплоидных видов, таких как Thinopyrum elongatum (Син. Agropyron elongatum). Наличие двух морфологически и геномно различных видов с одним и тем же именем стало источником разногласий среди систематиков. На основании наиболее явных различий Dewey (1984) исправил название декаплоидного вида на Th. ponticum, сохранив название Th. elongatum для диплоидных видов.
Многие виды рода Thinopyrum используются в качестве доноров различных генов устойчивости к болезням (Larkin et al., 1995; Chen et al., 2003; Yang et al., 2006; Luo et al., 2009), которые были успешно перенесены в пшеницу, в частности, гены устойчивости к листовой ржавчине (Friebe et al., 1996), вирусной мозаике пшеницы (Sebesta et al., 1972; Martin et al., 1976; Jiang et al., 1993) и солеустойчивости (Dvok, 1985). Среди этих видов Th. elongtatum (EE, 2n = 14), Th. bessarabicum (JJ, 2n = 14), Th. intermedium (JJJsJsSS, 2n = 42), Th. ponticum (JJJJJJJsJsJsJs, 2n = 70) наиболее ценны для отдаленной гибридизации с пшеницей и получения пшенично – пырейных гибридов. Было установлено, что замещение хромосом пшеницы хромосомами 3E и 7E пырея удлиненного Th. elongtatum в геноме мягкой пшеницы увеличивает калий-натриевую селективность тканей (Deal et al., 1999). Так как высокая концентрация ионов натрия, помимо осмотического действия, обладают токсическим эффектом, поскольку вызывает дисбаланс питательных элементов и окислительный стресс, происходит угнетение роста растения на засоленных почвах (Mian et al., 2011). Известно о возрастании толерантности пшеницы к осмотическому стрессу в присутствии короткого плеча хромосомы 1E в генотипе (Zhong & Dvorak, 1995) и снижении толерантности в присутствии длинного плеча чужеродной хромосомы 2-й гомологичной группы (Zhong & Dvorak, 1995; Forster et al., 1988). W.C. Botes и G.F. Marais (2007) продемонстрировали повышенную солеустойчивость линий тритикале, дополненных по хромосомам Th. distchum 3J, 5J и 7J. Факторы, отвечающие за транспорт ионов натрия из клетки, локализованы на хромосоме Th. bessarabicum 5J (Colmer et al., 2006). Среди видов пырея устойчивостью к засолению выделяется также пырей понтийский Th. ponticum (McGuire et al., 1981; Diaz et al., 2009). На его основе были созданы интрогрессивные формы мягкой пшеницы, устойчивые к засолению (Dvok et al., 1985; Wang et al., 2008).
Генетический материал может передаваться от диких сородичей пшеницы к мягкой пшенице либо путем транслокаций, либо гомеологичных рекомбинаций, которые могут возникать индуцированно или спонтанно (Синиговец, 1976; Friebe et al., 1996; Sibikeev et al., 1995). При использовании подхода индуцированной транслокации известные генные локусы, придающие устойчивость к грибковым заболеваниям - Lr19, LR24, Lr29, Sr24, SR25, Sr26, Sr43 и Lr38, SR44 - были перенесены в геном мягкой пшеницы от Th. ponticum и Th. intermedium, соответственно (Friebe et al., 1996; Wang, 2011). Гены устойчивости к листовой ржавчине были переданы в геном мягкой пшеницы из замещенных линий Agro 139, Agis 1 и Agis 503 в результате спонтанных гомеологичных рекомбинаций (Sibikeev et al., 1995). Генетический анализ Multi 6R линии, полученной с использованием линии Agro 139, предполагает, что ген(ы) устойчивости к листовой ржавчине расположены на хромосоме 6Ai#2 Th. intermedium, заместившей 6D хромосому пшеницы (Sibikeev et al., 2005).
Для определения связей между видами Thinopyrum были использованы многие методы, в том числе геномная гибридизация in situ (GISH) с использованием меченой ДНК различных диплоидных видов в качестве пробы. Геномная гибридизация in situ (GISH) с использованием ДНК-пробы St генома диплоидных видов Pseudoroegneria может эффективно использоваться для различения хромосом J, Js и St субгеномов Thinopyrum intermedium (Chen et al., 1998; Tang et al., 2011). Хромосомы St генома имеют сплошной рисунок гибридизации сигнала по всем хромосомам. Хромосомы J генома несут сигнал на теломерах. Хромосомы Js генома несут сигнал St генома вблизи центромеры и на теломерах. Таким образом, виды рода Pseudoroegneria, Th. bessarabicum и Th. elongatum могут считаться гипотетическим донором St, J и E геномов, соответственно.
Специфичная проба St генома не только служит молекулярно цитогенетическим маркером для мониторинга передачи чужеродных агрономических признаков от Thinopyrum (Chen et al., 1998; Chen, 2005), но и способствует непосредственному определению хромосомного состава пшенично пырейных гибридов. Однако S-геномная ДНК не позволяет разделить J и Js геномы на две очевидные группы по 14 хромосом, что соответствует основному числу хромосом у диплоидных видов Triticeae (Chen et al., 1998). Число хромосом Js и J геномов варьирует от 6 до 8 и от 20 до 22, соответственно. Это явно отклоняется от основного числа хромосом (2n = 14) у диплоидных видов Triticeae. Таким образом, точная геномная конституция Th. intermedium является очень сложной и обладает неоднозначными характеристиками, она до сих пор не определена и требует дальнейшего анализа.
Выделение ДНК из растительного материала
Ретротранспозоны, как и другие мобильные элементы являются основным источником генетической изменчивости (Bennetzen, 1996). Общей чертой большинства ретротранспозонов является их активация под действием стрессовых факторов окружающей среды. Наиболее хорошо охарактеризованные растительные LTR-ретротранспозоны (Ty1/copia подгруппа) активируются в процессе изоляции протопластов или культивирования клеток и тканей in vitro и культуры. Тот факт, что некоторые ретротранспозоны могут быть активированы в видах-хозяевах после изоляции протопластов и клеток, приводит к вопросу о том, связана ли их экспрессия с активацией деления клеток или с реакцией на стресс, или и то, и другое. Изоляция протопластов и культура каллусной ткани являются основными индукторами экспрессии генов. В протопластах, полученных из листьев, бывшая метаболическая активность листьев клетки заменена новой программой, которая характеризуется активацией роста и стрессовых генов (Todorovska, 2007).
Перемещение транспозонов, в частности, LTR-ретротранспозонов, может создавать мутации в геномах растений. Первый активный ретротранспозон Tnt1, описанный в растениях, также был выделен после его вставки в ген нитрат-редуктазы табака (Grandbastien et al., 1989). С тех пор было получено много примеров мутантных фенотипов, которые возникают при помощи инсерций ретротранспозонов в кодирующие последовательности (Vignols et al., 1995; Takano et al., 2001). Но вставка ретротранспозонов в некодирующие последовательности также может создавать мутации. Вставки ретротранспозонов в интроны может привести к тканеспецифичному альтернативному сплайсингу, к получению полностью активных или усеченных белков в различных тканях (Marillonnet & Wessler, 1997; Leprince et al., 2001; Varagona et al., 1992). Вставка LTR-ретротранспозонов в некодирующую область, близкую к генам, также может изменять их транскрипцию или терминацию транскрипции из-за присутствия в последовательности LTR транскрипционных промоторов, регуляторов и терминаторов. Эта способность ретротранспозонов генерировать мутаций используется в качестве инструмента для создания мутантных коллекции риса (Hirochika, 2001).
Для ряда элементов был обнаружен полиморфизм по месту вставки между близкородственными видами (Pearce et al., 2000; Kumar & Bennetzen, 1999), или среди различных сортов и популяций (Vicient et al., 1999; Kalendar et al., 2000). В некоторых случаях обнаруживались вирусоподобные частицы (VLP), белки или низкий уровень транскрипции, что предполагает низкий уровень транспозиционной деятельности некоторых элементов (Jaaskelainen et al., 1999; Vicient et al., 2001a, 2001b). Тем не менее, высокий уровень экспрессии связанный с числом копий в геноме, был показано лишь для небольшого числа элементов. Ретротранспозон табака Tnt1 может быть активной нововозникшей вставкой (Melayah et al., 2001), ретротранспозон табака Tto1 активно перемещается в культуре клеток (Hirochika, 1993), и рис Tos17 элемент может также увеличить количество копий в условиях культуры ткани (Hirochika, 1997). Хотя ретротранспозиция, кажется, сыграла важную роль в эволюционной истории многих геномов растений, очень немногие ретротранспозоны растений сохранили свою транспозиционный потенциал в процессе эволюции.
С появлением новых технологий скорость секвенирования геномов возрастает, однако многие геномы еще только предстоит изучить и секвенировать. Даже наиболее секвенированным геномам растений, в том числе Arabidopsis thaliana и рису, недостает 7-8% от их общей геномной информации (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002). Центромера является наименее секвенируемой областью хромосомы. Центромеры почти всех высших эукариот содержат большие участки (до нескольких Mb) из тандемно повторяющихся массивов сателлитной ДНК и ретротранспозонов. Такие длинные массивы представляют собой высоко гомогенные последовательности повторяющихся ДНК и не могут быть легко клонированы, секвенированы и собраны с использованием доступных методов клонирования и секвенирования.
Тандемные повторы являются мотивами последовательности ДНК, содержащими более двух соседних повторяющихся единиц. Они широко распространены у прокариот и эукариот (Tautz & Renz, 1984; Tth et al., 2000; Sharma et al., 2007; Sureshkumar et al., 2009; Christians & Watt, 2009; Orsi et al., 2010; Roorkiwal & Sharma, 2011). Как правило, в зависимости от размера мономера повторы делятся на: микросателлиты (размер: 1-6 или 1-10 пн.), также известные SSR и минисателлиты (размер: 10-60 или 10-100 пн.) (Mayer et al., 2010; Gemayel et al., 2012.). У растений и животных SSRs обнаружены как в мРНК (сДНК/ESTs), так и в геномной ДНК (Tautz & Renz, 1984; Jurka & Pethiyagoda, 1995; Tth et al., 2000; Subramanian et al., 2003; Fujimori et al., 2003; Sharma et al., 2007; Gemayel et al., 2010). Например, посредством изучения SSR с использованием баз данных EST в 11 растений, включающих зеленые водоросли, Victoria et al. (2011) обнаружили, что димерные мотивы чаще встречаются у зеленых водорослей, мхов, папоротников и в то время как тримерные мотивов чаще встречаются у цветковых растений. В пределах митохондриальных геномов, по-видимому, чаще встречаются мононуклеотидные повторы (А/Т) и динуклеотидные повторы (AT), что было показано для 16 видов растений (Kuntal & Sharma, 2011).
Тандемные повторы чрезвычайно изменчивы, и мутируют чаще, чем другие части генома (Gemayel et al., 2010). Основную часть мутаций в тандемных повторах составляют изменения в численности повторяющихся звеньев, а не точечные мутаций (Verstrepen et al., 2005; Gemayel et al., 2010, 2012). У человека, например, изменения в количестве повторов связаны с некоторыми серьезными заболеваниями и дефектами, такими как синдром ломкой Х хромосомой (Verkerk et al., 1991), бульбарная мышечная атрофия (La Spada et al., 1991) и болезнь Хантингтона (Walker, 2007). В растениях известен Bur-0 IIL1 дефект в Arabidopsis thaliana, вызывающий ослаблен фенотип, обусловлен расширением триплетного TTC/ GAА в интроне гена IIL1 (Sureshkumar et al., 2009).
Путем изучения изменения плотности тандемных повторов в нескольких видах растений и животных был сделан вывод об отсутствии существенной взаимосвязи между размером генома и плотностью тандемных повторов в растениях и животных (da Maia et al., 2009; Mayer et al., 2010). Основываясь на данных EST двух видов зеленых водорослей, мхов, двух видов папоротников, деревьев гинкго, двух хвойных растений, 10 двудольных и 5 однодольных, было установлено, что состав SSRs сильно варьирует среди различных видов (von Stackelberg et al., 2006). Недавний сравнительный анализ 282 видов, включая растения и животных, не показал наличия консервативных последовательностей в центромерных тандемных повторах (Melters et al., 2013). Кроме того, тандемные повторы показывают неслучайное распределение во многих геномах и часто расположены в пределах генов и регуляторных регионов (Streelman & Kocher, 2002; Rockman & Wray, 2002; Li et al., 2002; Martin et al., 2005; Legendre et al., 2007; Vinces et al., 2009). Тандемные повторы присутствуют в изобилии в генах, участвующих в регуляции транскрипции и морфогенезе человека (Legendre et al., 2007). 5 -UTR имеют более высокую плотность тандемных повторов среди различных генных регионов растений (Morgante et al., 2002; Fujimori et al., 2003; Zhang et al., 2006). В A. thaliana, например, 5 -UTR имеют высокую плотность тандемных повторов и большое количество мотивов динуклеотида CT/GA и тринуклеотида CTT/GAA (Zhang et al., 2006). В геноме дрожжей Saccharomyces cerevisiae 25% генов содержат тандемные повторы в промоутерах, и вариации в копийности мономера могут вызвать изменения в экспрессии генов и локальном позиционировании нуклеосом (Vinces et al., 2009).
Флуоресцентная и геномная гибридизация in situ (FISH, GISH) 2.2.6.1. Приготовление хромосомных препаратов
Анализ показал, что копийность в геноме Th. bessarabicum и P. spicata в 3 раза больше, чем в геноме в D. villosum. Копийность в геноме гексаплоидного аллополиплоида Th. intermedium в 11 раз больше, чем в геноме в D. villosum. qPCR показал, что D. villosum (связанные с St генома) имел меньшее количество копий RT-CR, чем кандидаты в доноры Jb (Th. bessarabicum) и St (P. spicata) геномов. В то же время FISH на D. villosum с зондом D. villosum показал относительно равномерный по интенсивности сигнал на V хромосомах, в то время как FISH на Th. intermedium показал, что пять Jv хромосомы несут большее количество RT-CR, чем другие хромосомы. qPCR не выявила существенной разницы между Th. bessarabicum и P. spicata в количестве RТ-CR. В целом, сигнал RT-CR на Jr хромосомах был сильнее, чем на St. Если предположить, что D. villosum, Th. bessarabicum, P. spicata являются донорами геномов Th. intermedium (или очень близки к ним), то полиморфизм по интенсивности сигнала в центромерных регионах хромосом Th. intermedium не может быть объяснен разницей в количестве RТ-CR в донорах геномов. Таким образом, результаты анализа qPCR на Th. intermedium и видов с родственными ему геномами ([Jb(JrJvsSt)/3St] V) не могут объяснить наблюдаемую градацию интенсивности сигнала в центромере Th. intermedium, выявленную FISH: (Jv Jr [JsSt]). В то же время следует учесть, что вопрос о том, какой вид имел больший геномный вклад в Th. intermedium, до сих пор остается дискуссионным, в отличие от Т. aestivum, филогения которой гораздо изучена гораздо лучше. Можно предположить, что активация CRW-подобных элементов в Thinopyrum в эволюционном масштабе могла произойти после или в результате полиплоидизации. Изменение CRW-как ретротранспозона может быть важным для дифференциации субгеномов Th. intermedium после полиплоидизации для обеспечения правильной конъюгации хромосом и расхождения их в мейозе. Можно рассмотреть также и альтернативную гипотезу: изменение числа копий CRW- ретротранспозона в видах донорах субгеномов было предпосылкой для сосуществования различных геномов во вновь образованном аллоплоиде и стабильности его потомков.
Тандемные повторы формируют значительную часть генома растений. В основном они концентрируются в центромерных и перицентромерных районах. Исторически тандемные повторы относили к так называемой «мусорной ДНК», но сейчас становится понятно, что их тандемная организация обеспечивает уникальные структурные и функциональные характеристики. Поле тандемного повтора сформировано многократно повторенной ДНК последовательностью (мономер тандемного повтора), уложенной голова-к-хвосту. Центромеры многих эукариот состоят в основном из тандемных повторов. Ими обогащены также перицентромерные районы. По- видимому, такая организация является критически важной для формирования и поддержания гетерохроматина, для правильной сегрегации хромосом. Важное значение получило цитогенетическое маркирование целых хромосом, плеч хромосом и отдельных участков с помощью локализации тандемных повторов in situ. Данные маркеры широко применяются как в фундаментальных, так и прикладных исследованиях. Для выявления новых тандемных повторов у изучаемых нами видов злаков Thinopyrum bessarabicum (Jb), Pseudoroegneria spicata (St), Dasypyrum villosum (V), Thinopyrum intermedium (JrJvsSt) нами были использованы данные полно геномного секвенирования полученные на T. aestivum. Биоинформационный анализ проводился совместно с лабораторией биоинформатики НИИ ФХМ. В целом работу по выявлению новых тандемных повторов для дикорастущих злаков можно разделить на несколько последовательных этапов.
Первым этапом было выявление тандемных высококопийных повторов из существующей базы данных нуклеотидных последовательностей T. aestivum с помощью программы Tandemrepeat finder. Данный этап проводился в лаборатории биоинформатики НИИ ФХМ. В диссертации представлены только результаты данной работы – название повтора, нуклеотидная последовательность, размер мономера, копийность в геноме мягкой пшеницы. Второй этап. BLAST анализ наиболее перспективных (высококопийных) повторов. Третий этап. Подбор праймеров для амплификации на выявленный повтор. Четвертый этап. ПЦР анализ с помощью разработанных праймеров всех исследуемых видов и мягкой пшеницы.
Пятый этап. Проведения флуоресцентной гибридизации in situ с меченными ПЦР продуктами на метафазных пластинках пшеницы и ее дикорастущих сородичах. Дополнительно на метафазных пластинках Thinopyrum intermedium (JrJvsSt) после отмывки препаратов проводилась геномная in situ гибридизация для выявления субгеномной принадлежности хромосом пырея среднего. В результате положительные результаты по локализации на хромосомах дикорастущих злаков были получены для семи тандемно организованных повторов. Ниже приведена их харастеристика и локеализация у исследуемых видов.
FISH локализация RT-CR на митотических хромосомах
На Th. bessarabicum сигналы были диспергированы на всех хромосомах. При этом интенсивность сигнала была выше в прицентромерной области (рис. 45). Распределение сигнала при FISH характерно для гибридизации с пулом ретротранспозонных последовательностей. В связи с этим мы можем выдвинуть две гипотезы. Первая заключается в том, определенная часть нашего повтора гомологична той или иной части ретротранспозона получившего широкое распространение в геноме Th. bessarabicum. Поэтому при получении пробы с пула амплифицированных участков в том числе и метиться участок ретротранспозона, что и дает картину распределение сигнала. Вторая гипотеза, заключается в том, что при копировании и распространение ретротраспозов по геному Th. bessarabicum они захватили определенную часть повтора (часть мономера, целый мономер, или даже несколько, и распространили его по всему телу хромосомы. При этом сохранилась нуклеотидная последовательность тандемного повтора, но утратилась его танденмная организация, которая и позволяет при высокой копийности производить чткую локализацию.
FISH локализация повтора П631 на хромосомах D. villosum. Проба мечена биотином (красный цвет) и контр-окрашивание DAPI (синий цвет) FISH гибридизация повтора П631 на Thinopyrum intermedium (JrJvsSt). В результате FISH гибридизации повтора на Th. intermedium был обнаружен сигнал на 20 хромосомах в прицентромерной области. На многих метафазных пластинках количество хромосом с ярким сигналом колебалось от 12 до 16. Чтобы выяснить, обусловлены ли различия в интенсивности сигнала геномной специфичностью пробы или же различным распределением повтора на хромосомах, мы проводили FISH на метафазных пластинках на Th. intermedium с разными пробами, полученными из ПЦР-продукта ДНК D. villosum и Th. intermedium (рис. 47a и 47b), P. spicata, Th. bessarabicum (рис. 48a и 48b).
Рисунок 47. FISH локализация повтора П631 на хромосомах Th. intermedium. (a) проба - ПЦР-продукта с геномной ДНК D. villosum; (b) проба - ПЦР-продукта с геномной ДНК Th. intermedium. Пробы мечены биотином (красный цвет) и контр-окрашивание DAPI (синий цвет)
В результате всех экспериментов FISH были обнаружены сильные сигналы, которые распределялись в прицентромерной области 12-16 хромосом. На остальных хромосомах сигнал отсутствовал, либо имелись очень слабые сигналы в прицентромерной области. Рисунок 48. FISH локализация повтора П631 на хромосомах Th. intermedium. (a) проба - ПЦР-продукта с геномной ДНК P. spicata; (b) проба - ПЦР-продукта с геномной ДНК Th. bessarabicum. Пробы мечены биотином (красный цвет) и контр-окрашивание DAPI (синий цвет)
Чтобы определить, к каким субгеномам относятся хромосомы со специфичными сигналами, мы проводили mcGISH на той же метафазной пластинке после отмывки (рис. 49a и 49b).
FISH локализация повтора П631 на хромосомах Th. intermedium. (a) проба повтора П631: ПЦР-продукта с геномной ДНК Th. intermedium меченой биотином (красный цвет) и контр-окрашивание DAPI (синий цвет). (b) mcGISH: проба – меченая ДНК D. villosum (V геном, красный цвет) и меченая ДНК P. spicata (St геном, зеленый цвет), блок – мягкая пшеница (ABD геном, синий цвет) На Th. intermedium сигнал обнаруживался на 14 хромосомах Jr генома, четырех хромосомах Jv генома и четырех хромосомах St генома. Наиболее интенсивным сигнал был на 14 хромосомах Jr генома и двух хромосомах Jv генома. Шесть хромосом имели наиболее слабый сигнал: две хромосомы St-генома, две хромосомы генома Jv и две хромосомы генома Js. По результатам FISH и GISH на Th. bessarabicum, P. spicata, D. villosum и Th. intermedium нами была составлена идиограмма локализации повтора П631 на четырех изучаемых нами видах (рис. 50).
Идиограмма повтора П631 на хромосомах дикорастущих сородичей пшеницы. Хроматин генома Jb и Jr – синий цвет, хроматин генома St – зеленый цвет, хроматин V и Jv – серый цвет, хроматин Js – серый цвет с зеленым цветом в центромерной области, сигнал пробы повтора П631– красный (сайт локализации) и розовый (распределенный) цвета
Гибридизация in situ на хромосомах Th. intermedium. (a) FISH локализация повтора П523 на хромосомах Th. intermedium c пробой: ПЦР продукт с геномной ДНК Th. intermedium. Проба мечена биотином (красный цвет) и контр-окрашивание DAPI (синий цвет). (b) GISH: проба – меченая ДНК P. spicata (St геном, зеленый цвет), блок – мягкая пшеница (ABD геном, красный цвет)
Согласно результатам GISH на той же метафазной пластинке, две хромосомы с сигналом в центромерной области относятся к рекомбинантному геному Js. При этом повтор локализовался в хроматине относящимся к St геному (рис. 57).