Введение к работе
Актуальность темы. Миодистрофия Дюшенна (МДД) - наиболее частое Х-сцепленное рецессивное заболевание, которое встречается приблизительно у одного из 2500-4500 новорожденных мальчиков и приводит к летальному исходу, как правило, в возрасте до 20 лет. Это тяжелое прогрессирующее заболевание, не поддающееся коррекции, с высоким повторным риском в семьях. Исследование мутаций в гене дистрофина важно для проведения ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна/Беккера (МДД/МДБ), прежде всего пренатальной. Прямая пренатальная диагностика в семьях с выявленными мутациями позволяет с вероятностью, близкой к 100%>, прогнозировать заболевание или его отсутствие у плода.
Ген дистрофина, мутации в котором приводят к МДД, — самый большой из всех известных генов в геноме человека. Он состоит из 79 экзонов, его размер около 2.5 м.п.н. Крупные делеции составляют около 60-65%) мутаций в гене дистрофина (Koenig et al., 1989, Abbs et al., 1991, Hodgson et al., 1989, Beggs et al., 1990), дупликации - 10% (Hu et al., 1990) и точковые мутации - 25-30%> (Roberts et al., 1991). Делеции и дупликации в гене дистрофина представляют собой уникальную модель для изучения механизма возникновения мутаций этого типа, поскольку накоплено значительное количество материала для исследования из-за большого количества больных и высокой доли этих мутаций.
Целью данной работы являлся анализ крупных делеции и точковых мутаций в гене дистрофина. При этом ставились следующие задачи:
- Провести поиск делеции у больных МДД/МДБ методом
мультиплексной амплификации (МПА), сравнить частоту и спектры делеции
в ряде выборок пациентов с МДД/МДБ.
Провести поиск корреляции клинических симптомов у пациентов с МДД с характером делеции в гене дистрофина.
Провести тонкое картирование делеционных точек разрыва (ДТР) в 7, 45, 46, 49 и 50 интронах гена дистрофина у больных МДД/МДБ.
Разработать систему мультиплексного SSCP для поиска полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина, с помощью которой исследовать образцы ДНК больных МДД/МДБ без выявленных делеции.
Научная новизна и практическая значимость. Обнаружены достоверные различия частот и спектров делеции и ДТР в ряде выборок пациентов с МДД/МДБ. Проведено тонкое картирование ДТР в "горячих" участках делеции, обнаружено, что в 7 интроне ДТР распределены равномерно и не существует их непосредственной связи с повторяющимися элементами генома.
Разработана мультиплексная SSCP-система для поиска
полиморфизмов и точковых мутаций в кэп-сайте и 19 экзонах ген дистрофина. Выявлены и охарактеризованы 1 экзонный и 2 интронны полиморфизма и ранее неизвестная мутация 7012-7015del.
Анализ мутаций в гене дистрофина позволил оптимизировать методі прямой ДНК-диагностики МДД/МДБ в российской вьгоорке больны? Проведен анализ образцов ДНК 357 пациентов. Данные, полученные результате работы, позволяют проводить дифференциальнук пресимптоматическую и прямую пренатальную ДНК-диагностику МДД/МД в семьях с выявленными мутациями.
Положения, выносимые на защит}'.
1. Оптимизирован метод МПА для изучения делеций в ген
дистрофина.
2. Обнаружены достоверные различия в спектрах делеций и ДТР.
3. Разработана мультиплексная система для тонкого картировани
ДТР в 7, 45,46, 50 интронах гена дистрофина, с помощью которой проведен
тонкое картирование 100 ДТР в исследуемых областях гена дистрофина.
4. Разработана эффективная мультиплексная SSCP-система дл
анализа полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина. Обнаружен
9 полиморфизмов и одна не описанная ранее мутация.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены н 4 и 5 конференциях "Геном человека" (Черноголовка, 1994, 1996), 1(: российском съезде медицинских генетиков (Москва, 1994), 28 и 29 съезда Европейского Общества Генетики Человека (Лондон, 1996, Генуя, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введение обзора литературы, описания материалов и методов исследованиі полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списк литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного тексті содержит 9 таблиц и 27 рисунков. Список литературы включает 132 работы.