Введение к работе
Актуальность проблемы.
Один из подходов к исследованию механизмов регуляции экспрессии генов эукариот основан на анализе данных, полученных при экспериментальном введении в эукариотические клетки генов или других сегментов ДНК (Уотсон Дж. и др. 1986).
В качестве реципиентов в работах подобного плана используют многие виды эукариотических организмов: дрожжи, насекомые, растения, млекопитающие и т.д. Не так давно, немногим более десяти лет назад, в научных исследованиях началось активное использование трансгенных рыб (Maclean N. etal.1985).
К настоящему времени накоплен достаточно большой материал относительно эффективности работы гетерологичных промоторов в клетках трансгенных животных и растений. Описан характер экспрессии гетерологичных промоторов, как в культуре клеток, так и в процессе эмбрионального развития. Однако, в большинстве экспериментов использовали промоторы генов, клонированные из близкородственных организмов; оставался открытым вопрос об эффективности функционирования промоторов генов клонированных из организмов сильно эволюционно отдаленных Таким образом являлось актуальным проведение данного анализа
Кроме того, ранее было показано, что определенные бактериальные последовательности ДНК, часто представленные в плазмидах, которые используются для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут негативно влиять на работу эукариотических промоторов (Townes Т.М. et al. 1986). В рамках данного исследования была предпринята попытка более глубокого изучения влияния бактериальных последовательностей ДНК на промоторы эукариотических генов.
Следует отметить, что исследование механизмов регуляции экспрессии генов, их регуляторных элементов не только расширит наше представление о структуре функциональной активности генов, но и позволит использовать полученные знания в биотехнологии, являющейся на сегодняшний день одной из самых перспективных отраслей промышленности.
Цели и задачи исследования.
1. Создание векторных молекул, которые могут быть использованы
для трансгеноза различных видов организмов и проведения
сравнительного анализа эффективности экспрессии чужеродного
генетического материала под контролем гетерогенных промоторов. С
этой целью представлялось актуальным конструирование нескольких
серий рекомбинантных векторных молекул ДНК, содержащих маркерные
гены Neo и Lac Z под контролем сильных промоторов, клонированных из
ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам.
2. Анализ эффективности экспрессии созданных векторных
конструкций в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis s).
3. Изучение влияние бактериальных последовательностей ДНК, в
частности, БАК-домена лактозного оперона Е. coli (последовательность
ДНК, ответственная за взаимодействие с белком активатором
катаболизма) на функционирование эукариотических промоторов.
Научная новизна и практическая ценность работы.
-
Показано, что экспрессия маркерного гена, находящегося под контролем гетерогенного промотора, зависит от степени эволюционной консервативности структурных частей генов, промоторы которых подвергаются сравнению, а не от степени эволюционной удаленности организмов. Для выявления эволюционного консерватизма регуляторных элементов генов предлагается использовать описываемый в данной работе "функциональный" подход.
-
Показано, что определенные последовательности бактериальной ДНК, часто представленные в плазмидах, используемых для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут значительно изменять характер активности промоторов эукариотических генов. Заметим, что ранее было описано "негативное" влияние определенных последовательностей бактериальной ДНК на работу эукариотических промоторов (Townes Т.М. et аl. 1986) , в данной работе мы впервые описываем "активизирующее" действие бактериальных последовательностей.
-
Впервые показано, что БАК-домен лактозного оперона Е. coli может позитивно влиять на функционирование эукариотического промотора и, возможно, является регуляторным элементом транскрипции
не только прокариотических, но и эукариотических организмов. В составе ряда эукариотических генов, нуклеотидные последовательности которых представлены в EMBL - банке генов, выявлены домены, имеющие высокую (до 100%) степень сходства с БАК - доменом лактозного оперона Е. coli.
Апробация работы. Основные материалы работы доложены на межлабораторном семинаре ИОГен РАН (22 июня 1999 г.). По материалам диссертации представлены и опубликованы тезисы на евроазиатском симпозиуме по биотехнологии (Анкара, Турция, 1995).
Объем и структура диссертации. Публикации.