Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 Современные представления об этиопатогенезе и факторах риска развития гипертонической болезни и ее осложнений 10
1.2 Медико-биологические и молекулярно-генетические характеристики факторов некроза опухолей и факторов роста 20
1.3 Вклад генов цитокинов в развитие гипертонической болезни и ее осложнений 28
Глава 2 Материалы и методы исследования 37
2.1 Характеристика объектов исследования 37
2.2 Характеристика молекулярно-генетических методов исследования 41
2.3 Генетико-статистические методы исследования 50
Глава 3 Результаты собственных исследований 54
3.1 Клинические характеристики и средовые факторы риска у больных гипертонической болезнью .54
3.2 Исследование вовлеченности генов цитокинов в развитие гипертонической болезни .58
3.3 Особенности ассоциаций молекулярно-генетических маркеров генов цитокинов с развитием гипертонической болезни с учетом коррекции на индекс массы тела и дислипидемию 73
3.4 Влияние средовых факторов на характер ассоциаций молекулярно-генетических маркеров генов цитокинов с развитием гипертонической болезни .80
3.5 Исследование вовлеченности полиморфных маркеров генов цитокинов в формирование показателей артериального давления .89
3.6 Исследование вовлеченности полиморфных маркеров генов цитокинов в развитие ишемического инсульта на фоне гипертонической болезни 96
3.7 Исследование эпистатических взаимодействий генов-кандидатов цитокинов и матриксных металлопротеиназ при формировании предрасположенности к гипертонической болезни и ее осложнений .117
Обсуждение .124
Выводы 143
Практические рекомендации 145
Приложение .146
Список литературы 156
- Медико-биологические и молекулярно-генетические характеристики факторов некроза опухолей и факторов роста
- Исследование вовлеченности генов цитокинов в развитие гипертонической болезни
- Исследование вовлеченности полиморфных маркеров генов цитокинов в формирование показателей артериального давления
- Исследование эпистатических взаимодействий генов-кандидатов цитокинов и матриксных металлопротеиназ при формировании предрасположенности к гипертонической болезни и ее осложнений
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной потери трудоспособности, инвалидизации и смертности населения в России и в мире [Сайгитов Р.Т. и др., 2015; Ерина А.М. и др., 2017; Raina A. еt al., 2016; Cameron A.C. еt al., 2016; Olschewski A. еt al., 2016]. Гипертоническая болезнь (ГБ) является самым распространенным сердечно-сосудистым заболеванием, частота которого в общей популяции людей старше 65 лет превышает 50%, а смертность в результате осложнений ГБ составляет 9,4 млн. случаев в год [Чазова И.Е. и др., 2010; Корчагин В.И. и др., 2016; Park H.J. et al., 2016; Mao S. еt al., 2017; Niiranen T.J. еt al., 2017].
Системное повышение уровня артериального давления является результатом сложных взаимодействий между генетическими факторами, факторами окружающей среды и образом жизни [Murphy G.A. еt al., 2014; Shah S.M. еt al., 2015; Dodoo S.N. еt al., 2017; Ueda K. еt al., 2017]. В патогенез гипертонической болезни вовлечены многочисленные механизмы, в том числе окислительный стресс, эндотелиальная дисфункция, сосудистый тонус, повышение активности симпатической нервной системы, хроническая активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, а также неспецифическое воспаление [Барсуков А.В. и др., 2017; Елфимова Е.М., 2017; Raman K. еt al., 2013; Grassi G. еt al., 2015; Vashi N. еt al., 2016; Luo S. еt al., 2016; Xie X. еt al., 2017; Bachmann S. еt al., 2017].
Степень разработанности темы. В настоящее время ведется активное изучение генетических факторов, вовлеченных в развитие ГБ и ее осложнений [Ruchaya P.J. еt al., 2016; Li Q. et аl., 2017]. Установлена вовлеченность в этиопатогенез заболевания более ста генов-кандидатов, среди которых важное значение имеют гены цитокинов [Насибуллин Т.Р. и др., 2014; Кривошей И.В. и др., 2015; Минушкина Л.О. и др., 2017; Zhanzhan L. et al., 2013; Xu J. et al., 2015; Li Q. et аl., 2017; Yang H. et аl., 2017].
Цитокины – это обширная группа пептидов, отвечающих за регуляцию воспаления, ангиогенеза, неспецифических защитных реакций организма, а также участвующих в процессах роста, дифференцировки клеток и регенерации тканей [Адаменко Г. П. и др., 2014; Kim H.J. et. al., 2012; Ouyang S. et. al., 2015; Kumar P. et. al., 2016; Ping Z. et. al., 2017]. Эти медико-биологические эффекты цитокинов имеют важное значение в этиопатогенезе ГБ и ее осложнений. Ряд исследований подтверждают вовлеченность полиморфных локусов генов цитокинов в развитие гипертонической болезни и ее осложнений [Cheung B.M. et al., 2011; Ndiaye N.C. et al., 2013; Zuo S. et al., 2015; Xu J. et al., 2015; Kalayi Nia S. et al., 2016; Fang Z. et аl., 2017], тогда как в других работах ассоциаций данных молекулярно-генетических маркеров с формированием ГБ не выявлено [Duran J. et al., 2015; Osadnik T. et al., 2016]. В России исследования, посвященные анализу вовлеченности генов цитокинов в возникновение предрасположенности к сердечно-сосудистой патологии единичны и не в полной мере учитывают вклад средовых факторов риска развития ГБ [Тимашева Я.Р., 2012; Насибуллин Т.Р. и др., 2014; Кривошей И.В. и др., 2015; Шамонина Т.Н. и др., 2015; Гараева Л.А. и др.,
2017]. Это обуславливает необходимость дальнейших исследований в области молекулярно-генетических основ формирования гипертонической болезни и вклада в развитие данного заболевания полиморфных локусов генов цитокинов.
Цель исследования - изучить роль молекулярно-генетических маркеров цитокинов в развитии гипертонической болезни и ее осложнений у населения Центрального Черноземья России.
Задачи исследования:
-
Проанализировать вовлеченность полиморфных локусов rsl800629 TNFa, rs909253 Lta, rs767455 TNFR1, rsl061624 TNFR2, rs833061 VEGF, rs6214 IGF-1, rsl800469 TGFfi-1, rs2981582 FGFR-2 и их ген-генных взаимодействий в формирование гипертонической болезни у русских жителей Центрального Черноземья России.
-
Установить генно-средовые взаимодействия полиморфных локусов цитокинов со средовыми факторами риска развития гипертонической болезни и определить их значение при формировании предрасположенности к ГБ.
-
Изучить особенности вовлеченности полиморфных локусов генов цитокинов в возникновение гипертонической болезни с учетом полового диморфизма.
-
Оценить вклад молекулярно-генетических маркеров цитокинов в формирование показателей артериального давления.
-
Проанализировать вовлеченность полиморфных локусов цитокинов, их межгенных и генно-средовых взаимодействий в развитие ишемического инсульта на фоне гипертонической болезни.
Научная новизна. Впервые с учетом коррекции на средовые факторы риска выявлена вовлеченность полиморфных локусов генов цитокинов в формирование гипертонической болезни у русских жителей Центрального Черноземья РФ. Впервые проанализированы межгенные взаимодействия полиморфных локусов генов цитокинов и установлена их связь с развитием предрасположенности к гипертонической болезни. Выявлены особенности вовлеченности анализируемых генов-кандидатов в формирование ГБ у представителей разного пола. Продемонстрирована связь полиморфных локусов генов цитокинов с формированием уровня артериального давления. Показан важный модифицирующий эффект курения и злоупотребления алкоголем на характер ассоциаций молекулярно-генетических маркеров цитокинов с восприимчивостью к ГБ и ее осложнениям. Выявлены полиморфные локусы цитокинов, их ген-генные и генно-средовые взаимодействия, ассоциированные с развитием ишемического инсульта на фоне гипертонической болезни. Получено два патента РФ на изобретения.
Практическая значимость работы. Данные, полученные в настоящем исследовании, вносят вклад в формирование представлений о молекулярно-генетических детерминантах гипертонической болезни. Выявленные Зх- и 4х-локусные модели ген-генных и генно-средовых взаимодействий полиморфных локусов цитокинов, ассоциированные с развитием ГБ и ее осложнений, могут быть использованы при формировании среди населения
групп повышенного риска возникновения гипертонической болезни, а также групп повышенного риска развития ишемического инсульта среди пациентов с ГБ. Результаты исследования используются в практической деятельности сотрудников неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, а также в учебном процессе в ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».
Методология и методы исследования. Методология исследования
заключалась в изучении ассоциаций полиморфных локусов генов цитокинов
(rsl800629 TNFa, rs909253 Lta, rs767455 TNFR1, rsl061624 TNFR2,
rs833061 VEGF, rs6214 IGF-1, rsl800469 TGFfi-1, rs2981582 FGFR-2), их ген-
генных и генно-средовых взаимодействий с развитием гипертонической
болезни и ее осложнений. Исследование проведено на репрезентативных
выборках больных гипертонической болезнью (п=939) и контрольной группы
(п=466). В работе использованы современные методы исследования:
клинические, клинико-лабораторные, клинико-инструментальные,
молекулярно-генетические, генетико-статистические.
Положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфные локусы rsl800629 TNFa, rs909253 Lta, rs767455
TNFR1, rsl061624 TNFR2, rs833061 VEGFA, rs6214 IGF-1, rsl800469 TGFfi-1,
rs2981582 FGFR-2 вовлечены в формирование гипертонической болезни у
русских жителей Центрального Черноземья РФ.
2. С развитием ГБ ассоциированы межгенные взаимодействия
цитокинов, основу которых составляют rsl800629 TNFa и rs909253 Lta. При
этом важное модифицирующее влияние на характер ассоциаций генов-
кандидатов с возникновением ГБ оказывает курение.
-
Вовлеченность молекулярно-генетических маркеров цитокинов в развитие ГБ характеризуется пол-специфичностью.
-
Полиморфные локусы цитокинов, их межгенные и генно-средовые взаимодействия со злоупотреблением алкоголем ассоциированы с развитием ишемического инсульта на фоне ГБ.
Степень достоверности и апробация материалов исследования.
Достоверность полученных результатов работы обосновывается большим объемом исследуемой выборки (1405 человек, среди которых 939 больных гипертонической болезнью и 466 здоровых индивидуумов), общепринятыми в кардиологии и неврологии методами верификации диагноза, использованием современных молекулярно-генетических и генетико-эпидемиологических методов анализа.
Основные результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на: VIII, X Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2013, 2015); X научной конференции НИИ Медицинской генетики СО РАМН «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014); VII съезде Российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015); VI Международном биомедицинском конгрессе «SHBC-2015: Advancing Healthcare Into The
Future: Innovate, Improve, Integrate» (Сингапур, 2015); XVIII Международной медико-биологической конференции молодых исследователей, посвященной двадцатилетию медицинского факультета СПбГУ «Фундаментальная наука и клиническая медицина: человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2015); XX международной медико-биологической научной конференции молодых исследователей "Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2017), VIII Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2017).
Личный вклад автора. Соискателем лично сформированы анализируемые выборки больных и контроля, проведены анкетирование, сбор и анализ анамнестических данных. Автором самостоятельно произведено генотипирование полиморфных маркеров цитокинов, выполнена обработка результатов методами генетико-эпидемиологического анализа, обобщены полученные данные. Диссертантом подготовлены основные публикации по теме исследования, проведена апробация результатов, написана и оформлена рукопись.
Публикации. По итогам диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ, из них 2- в журналах из базы Scopus. Полученo 2 патентa на изобретение.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Диссертационная работа изложена на 210 страницах машинописного текста и содержат 43 таблицы и 22 рисунка. Библиографический список включает 429 источников, в том числе, 326 зарубежных.
Медико-биологические и молекулярно-генетические характеристики факторов некроза опухолей и факторов роста
Цитокины – это низкомолекулярные (не более 30 кДа) белки, выступающие в роли эндогенных медиаторов и отвечающие за все виды межклеточных и межсистемных взаимодействий в организме [Kim H.J. et. al., 2012; Ouyang S. et. al., 2015; Ping Z. et. al., 2017]. Цитокины участвуют в процессах роста, дифференцировки, выживаемости и апоптоза клеток, а также регулируют иммунный ответ, воспаление, цитотоксическую активность [Markoula S. et. al., 2011; Cui G. et. al., 2012; Kumar P. et. al., 2016]. Эти биологически-активные молекулы осуществляют аутокринную, паракринную и эндокринную регуляцию путем взаимодействия с высокоспецифичными рецепторами на мембране клеток-мишеней [Адаменко Г. П. и др., 2014; Ferguson L.R. et. al., 2009]. Синтез цитокинов осуществляется лимфоцитами, макрофагами, гранулоцитами, ретикулярными фибробластами, а также гладкомышечными и эндотелиальными клетками [Сологуб Т. В. и др., 2014; Ouyang S. et. al., 2016]. Среди цитокинов важное значение имеют факторы некроза опухолей TNF, Lt, TNFR1, TNFR2 и факторы роста TGF-1, VEGFА, FGFR2, IGF1.
Фактор некроза опухоли альфа (TNF) – провоспалительный цитокин с молекулярной массой 17 кДа, в состав которого входят 157 аминокислотных остатков [Xu F. et. al., 2014; Jagadeesh, B., 2016]. TNF синтезируется в моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, адипоцитах, эндотелии, гладкомышечных и дендритных клетках [Kamkin A. et. al., 2012; Mishra A. et. al., 2013]. Концентрация цитокина в плазме крови в норме не превышает 5 пг/мл, однако при воспалении уровень TNF в течении 1-3 часов возрастает до 300 пг/мл и выше [Paquet J., 2014]. Индукторами TNF являются вирусы, бактерии и продукты их метаболизма, липополисахариды, а также цитокины IL1, IL2, INF, INF, GM-CSF [Jagadeesh, B., 2016; Ouyang S. et. al., 2016]. Фактор некроза опухоли альфа играет важную роль в развитии воспалительного ответа благодаря способности модулировать продукцию других цитокинов, в том числе IL1, IL6, IL8, факторов роста и их рецепторов [Ащеулова Т.В. и др., 2016; Offermanns S., 2016]. Также данный цитокин отвечает за пролиферацию и дифференцировку клеток, апоптоз и регуляцию оксидантного стресса [Beschin A. et. al., 2013]. Установлено, что TNF выступает в качестве вазоактивного медиатора – ингибирует синтез NO эндотелиоцитами, вызывает вазоконстрикцию сосудов и повышение артериального давления [Gооdwin B.L. et. al., 2007; Wang H. et. al., 2016]. Данный цитокин активирует ядерный фактор транскрипции бета (NF-кВ) и митоген-активируемую киназу JNK, что ведет к активации соответствующих сигнальных путей и генерализации воспалительного процесса [Bokhari F.A. et. al., 2014; Alameemi H.A., 2017].
Ген, кодирующий TNF, расположен на коротком плече шестой хромосомы, в области главного комплекса гистосовместимости HLA (6р21.1-6р21.3) [Rong J. et. al., 2010]. В промоторном участке гена TNF установлены восемь однонуклеотидных полиморфизмов – rs1800629, rs1800750, rs361525, rs673, rs1799724, rs1800630, rs1799964 [Пушкарева A.Э. и др., 2012; Gu L. еt аl., 2016]. Данные SNP изменяют аффинность промоторов для факторов транскрипции, что увеличивает или снижает транскрипционную активность и экспрессию соответствующего гена [Cui G. et. al., 2012]. Наибольший интерес представляют полиморфизмы rs1800629 TNF и rs361525 TNF, которые представляют собой замену гуанина на аденин (в положении -308 и -238, соответственно). Установлено, что носительство полиморфного варианта А по локусу rs1800629 TNF ассоциировано с увеличением экспрессии гена TNF в 3 раза, по сравнению с носителями аллеля G rs1800629 TNF [Laddha N.C. et al., 2012]. Для локуса rs361525 TNF, напротив, установлено снижение экспрессионной активности при наличии в генотипе аллельного варианта A в результате снижения скорости образования матричной РНК [Beschin A. et. al., 2013; Kumar P. et al, 2016]. В ряде работ показано, что полиморфизм rs 1800629 TNFa вовлечен в формирование таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт, лейкемия, сахарный диабет, колоректальный рак, ревматоидный артрит и др. [Manginas A. et al, 2008; Hernndez-Daz Y. et al, 2016; Kaidonis G. et al, 2016; Kumar P. et al, 2016; Li Z. et al, 2017; Ovsepyan V.A. et al, 2017; Park H.J. et al, 2017; Domnguez-Prez R.A. et al, 2017].
Лимфотоксин альфа (Lta, TNF) - плейотропный цитокин, гомологичный по структуре и функциям фактору некроза опухоли альфа. За синтез Ltcc в организме отвечают В- и Т-лимфоциты, эпителиальные клетки, эндотелиоциты, фибробласты [Vashi N. et al, 2016]. Данный цитокин участвует в процессах сосудистого воспаления, поддержания Т-клеточного гомеостаза, рецептор-зависимого апоптоза, а также отвечает за иммуномодуляцию, пролиферацию и дифференцировку клеток [Затейщиков Д.А. и др., 2013; Yamadaa Y., 2015]. Лимфотоксин альфа существует в мембранно-связанной и растворимой формах, и, как и TNFa, способен к активации сигнальных путей через ядерный фактор транскрипции бета (NF-кВ) [Etemadi N. et al, 2013].
Цитогенетическое расположение гена, кодирующего Lt - 6р21.1-6р21.3. Наиболее изученными полиморфизмами гена лимфотоксина альфа являются rs909253 Lta и rs 1041981 Lta. Установлено, что замена аллеля А на G по локусу rs909253 Lta приводит к повышению экспрессии соответствующего гена, а замена полиморфного варианта С на А полиморфизма rs 1041981 Lta, напротив, ассоциирована со снижением транскрипционной активности Lta [Auer J. et al, 2003; Knight et al, 2007]. Исследования показали, что полиморфизм rs909253 Lta ассоциирован с развитием гипертонической болезни, инсульта, гломерулонефрита, холецистита, лимфолейкоза, сахарного диабета II типа, генитального эндометриоза, рака молочной железы, миомы матки, преэклампсии [Некипелова Е.В., 2007; Алтухова О.Б., 2010; Дмин С.С., 2010; Конева О.А., 2011; Луговая О.В. 2012; Тикунова Т.С., 2012; Белоусова О.Н., 2013; Yu X. et al., 2014; Pissetti C.W. et al., 2015; de Sousa Parreira J. et al., 2015; Jia B. et al., 2017].
Эффекты цитокинов TNF и Lt осуществляются благодаря их взаимодействию со специфическими рецепторами на плазматических мембранах клеток-мишеней – TNFR1 и TNFR2 [Мисюрин В.А., 2015; Васильев Ф. 2015; Chen Z. et al., 2013].
Рецептор фактора некроза опухолей первого типа (TNFR1) – трансмембранный белок с молекулярной массой 55 кДа, опосредующий все процессы, запускаемые TNF, в том числе регуляция воспалительного ответа, апоптоза, клеточной пролиферации и дифференцировки [Olmos G. et. al., 2014; Carlsson A.S. et al., 2016]. TNFR1 синтезируется макрофагами, нейтрофилами, В- и Т-лимфоцитами, эндотелиоцитами, гладкомышечными клетками сосудов и присутствует в тканях как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме [Hunt R. et al., 2009; Бодиенкова Г.М. и др., 2015].
Ген, кодирующий TNFR1, расположен на коротком плече 12 хромосомы (12p13.31), и имеет несколько полиморфизмов, из которых наибольший интерес представляет синонимичный SNP rs767455 TNFR1 [Wheeler M.A. et al., 2014]. Данный локус, согласно литературным данным, вовлечен в развитие многих патологических состояний, в том числе, гипертонической болезни, ишемического инсульта, церебральной аневризмы, гиперпластических процессов эндометрия, миомы матки, эндометриоза, лимфолейкоза, сахарного диабета II типа, ревматодного артрита [Алтухова О.Б., 2010; Конева О.А., 2011; Тикунова Т.С., 2012; Белоусова О.Н., 2013; Демакова Н.А., 2014; Кривошей И.В., 2014; Насибуллин Т.Р. и др., 2014; Li F. et al., 2014; Aoki T.et. al., 2014; Madsen Р.М. et al., 2015; Bek S. et al., 2016].
Рецептор фактора некроза опухолей второго типа (TNFR2) – белок с молекулярной массой 75-80 кДа, являющийся членом суперсемейства TNF-рецепторов [Verwoerd A. et al., 2016]. Совместно с TNFR1 этот белок образует гетерокомплекс, взаимодействующий с анти-апоптотическими белками C-IAP1 и С-IAP2, и, таким образом, выступает в качестве антагониста TNFa [Raman K. et al., 2013]. TNFR2 продуцируется большинством клеток, среди которых лимфоциты, макрофаги, эндотелиальные клетки, нейтрофилы, тучные клетки, кардиомиоциты [Madsen Р.М. et al., 2015]. Рецептор TNF второго типа опосредует процессы клеточной пролиферации, миграции и адаптации клеток, а также регулирует углеводный и липидный обмен [Fischer R.A et al., 2011; Varbo A. et al., 2013]. Исследования на нокаутированных мышах подтверждают роль этого белка в защите нейронов от апоптоза и активации антиоксидантных путей [Kostis W.J. et al., 2013; DeBerge M.P. et al., 2015].
Исследование вовлеченности генов цитокинов в развитие гипертонической болезни
В рамках данного раздела работы изучен вклад полиморфизмов генов-кандидатов в развитие гипертонической болезни. Распределение генотипов полиморфных локусов rs 1800629 TNFa, rs909253 Lta, rs767455 TNFR1, rsl061624 TNFR2, rs833061 VEGF, rs6214 IGF-1, rsl800469 TGFp-1, rs2981582 FGFR-2 в изучаемых выборках соответствует теоретически ожидаемому (р 0,05) при равновесии Харди-Вайнберга (таблица 7). В группе пациентов с ГБ наблюдалось варьирование наблюдаемой гетерозиготности от Ho=0,23 rs 1800629 TNFa до Ho=0,52 rs767455 TNFR1. В группе индивидуумов без сердечно-сосудистой патологии наблюдаемая гетерозиготно сть изменялась в диапазоне от Но=0,24 rs 1800629 TNFa до Но=0,51 rs767455 TNFRL Так как количество изучаемых генотипов по каждому локусу равнялось трем, при анализе ассоциаций полиморфизмов генов цитокинов с формированием ГБ вводилась поправка на три группы сравнения (поправка Бонферрони, равная 3), после чего статистически значимым считали р 0,017.
Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей в исследуемых выборках не выявил достоверных отличий между больными с ГБ и контрольной группой (р 0,017) (таблицы 7 и 8).
В таблице 9 представлено распределение полиморфных локусов генов-кандидатов отдельно у мужчин и у женщин. Установлено, что среди мужчин частота аллеля А по локусу rs1061624 ТNFR2 достоверно выше в группе контроля по сравнению с группой больных с ГБ (50,59% и 42,86%, соответственно, p=0,004). Данный молекулярно-генетический маркер оказывает протективное влияние на развитие заболевания (OR=0,73, 95% СI 0,59-0,90). Среди женщин значимых различий в частотах аллелей по изучаемым локусам между пациентками с ГБ и индивидуумами без гипертонии выявлено не было (р 0,017).
Проведен логистический регрессионный анализ вовлеченности полиморфизмов генов цитокинов в развитие ГБ. Выявление ассоциаций проводили при помощи программного обеспечения РLINK в трех генетических моделях – доминантной, рецессивной, аддитивной. Для снижения вероятности возникновения ошибок первого рода проводили адаптивный пермутационный тест и вводили поправку Бонферрони. С помощью пермутационного теста корректировали количество изучаемых локусов (8 SNР), введением поправки Бонферрони – число генетических моделей (3 модели – доминантная, рецессивная, аддитивная), после чего статистически значимым считали рperm0,017. Результаты логистического регрессионного анализа представлены в таблице 10. Установлены значимые ассоциации полиморфного маркера rs1061624 ТNFR2 с развитием ГБ во всех анализируемых моделях – доминантной (р=0,010, рperm=0,016, мощность 69,27%), рецессивной (р=0,001, рperm=0,001, мощность 86,34%) и аддитивной (р=0,001, рperm=0,001, мощность 93,30%). Данный полиморфизм оказывает протективное влияние и ассоциирован с низким риском развития гипертонической болезни (OR=0,64-0,76).
Результаты логистического регрессионного анализа вовлеченности полиморфизмов генов цитокинов в формирование предрасположенности к гипертонической болезни отдельно у мужчин и женщин представлены в таблице 11. Показано, что полиморфный маркер rs1 061624 TNFR2 ассоциирован с развитием ГБ у мужчин в рецессивной (рperm=0,013, мощность 57,21%) и аддитивной (рpeim=0,004, мощность 83,08%) генетических моделях и оказывает протективное влияние на формирование заболевания (OR=0,66-0,73).
Примечательно, что для данного полиморфизма установлены ассоциации с ГБ и в общей выборке. Не выявлено значимых ассоциаций SNР генов цитокинов с развитием ГБ у женщин (рperm 0,017), что отражает пол-специфические особенности вовлеченности анализируемых полиморфизмов в формирование данного заболевания.
Из восьми изучаемых в рамках данного исследования полиморфизмов три локализованы в 6 хромосоме (rs 1800629 TNFa, rs909253 Lta, rs833061 VEGFA), в связи с чем был проведен анализ неравновесия по сцеплению между данными SNР с использованием программного обеспечения Hаplоviеw. Для выделения гаплотических блоков использовали алгоритм «Cоnfidеnсе intervals» (Gаbriel S.В. et аl, 2002) при заданном пороге коэффициента сцепления D 0,8. Анализ проведен в общей выборке больных ГБ, в группе контроля, а также среди мужчин и женщин, результаты представлены на рисунке 10.
Наибольшее сцепление установлено между SNР rs 1800629 TNFa и rs909253 Lta (D=0,81) в группе больных гипертонической болезнью. Однако гаплоблоков ни в одной из анализируемых групп выявлено не было. Изучены межгенные взаимодействия полиморфизмов генов цитокинов при развитии ГБ. Анализ 2х-локусных моделей эпистатического взаимодействия проводился с использованием программного обеспечения PLINK. Коррекцию на число анализируемых локусов (п=8) проводили введением поправки Бонферрони, после чего статистически значимым считали р 0,0062. Выявлена 2х-локусная модель, включающая полиморфизмы rs909253 Lta и rs 1800629 TNFa, ассоциированная с высоким риском развития ГБ (OR=5,52, р=3,94е-015, мощность poweradd=98,84%, powerdom=85,01%, powerrec=8,ll%). В рамках данной модели предиктором риска развития ГБ является сочетание генотипов AA/GG (OR=2,23, 95% СІ 1,75-2,81, х2=45,63, р=0,0005). При стратифицированном по полу анализе установлено, что данная 2х-локусная модель ген-генных взаимодействий (rs909253 Ltaxrs 1800629 TNFa) ассоциирована с высоким риском развития гипертонической болезни как у мужчин (OR=3,16, р=5,092е-0063, мощность poweradd=99,50%, powerdom=91,12%, powerrec= 9,13%), так и у женщин (OR=16,04, р=8,181е-012, мощность poweradd=99,99%, powerdom=99,99%, powerrec=28,74%). Комбинация генотипов AA/GG является значимым предиктором высокого риска развития ГБ и у мужчин (OR=l,98, 95% СІ 1,50-2,61, х2=24,92, р=0,0005), и у женщин (OR=l,57, 95% СІ 1,15-2,17, х2=8,12, р=0,005).
Анализ Зх- и 4х-локусных моделей межгенных взаимодействий проводился методом GMDR с использованием соответствующего программного обеспечения, валидация полученных результатов осуществлялась при помощи пермутационного теста - выполнялось 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивало ppeim 0,001. Выявлено восемь 4х-локусных моделей, ассоциированных с развитием гипертонической болезни (таблица 12). Межгенные взаимодействия полиморфизмов генов цитокинов в рамках выявленных моделей повышают риск развития ГБ (OR=4,19-4,55). Для всех установленных моделей воспроизводимость составляла 100%; точность предсказания моделей варьировала в диапазоне 63,22-65,27%, уровень значимости р=0,001. Диаграмма модели взаимодействий rsl800629 TNFa Ts909253 Ltaxrs6214 IGF1 xrs833061 VEGFA, демонстрирующей наибольшую точность предсказания (Test Bal.Acc =65,27%, p=0,001), представлена на рисунке 11.
Исследование вовлеченности полиморфных маркеров генов цитокинов в формирование показателей артериального давления
Настоящий раздел посвящен изучению ассоциаций полиморфизмов локусов rs 1800629 TNFa, rs909253 Lta, rs767455 TNFR1, rs 1061624 TNFR2, rs833061 VEGF, rs6214 IGF-1, rsl800469 TGF0-1, rs2981582 FGFR-2 с уровнем артериального давления. Анализ проводился в общей выборке, объемом 1405 человек, включающей больных с ГБ и индивидуумов без сердечно-сосудистых заболеваний, с поправкой на кофакторы. Вовлеченность локусов генов-кандидатов в развитие гипертонической болезни проводили в двух моделях: модель I включала в качестве ковариант положительный статус ГБ, половую принадлежность, возраст, индекс массы тела, уровни холестерина, ТГ, ЛПВП, ЛПНП и наличие вредных привычек (злоупотребление алкоголем и курение). Модель II наряду с перечисленными характеристиками включала такие средовые факторы риска ГБ, как низкий уровень физической нагрузки, частые стрессовые ситуации, редкое употребление свежей растительной пищи (овощей, фруктов), высокий уровень употребления жирной пищи, «солевой аппетит».
Для всех изученных локусов генов цитокинов наблюдаемое распределение генотипов находится в соответствии с теоретически ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (таблица 26). Наблюдаемая гетерозиготность изменяется от 0,23 для rs 1800629 TNFa до 0,52 для rs767455 TNFR1.
Проведен линейный регрессионный анализ вовлеченности полиморфизмов генов цитокинов в формирование уровней систолического и диастолического артериального давления. Так как распределения показателей САД и ДАД не соответствовало нормальному (р 0,001 по критерию Шапиро-Уилка), перед включением показателей АД в анализ проводилась их логарифмическая трансформация. Ассоциации изучаемых SNР с развитием ГБ выявляли с помощью метода линейной регрессии в трех генетических моделях - доминантной, рецессивной, аддитивной. Проводили адаптивный пермутационный тест и определяли рperm для минимизации ошибок первого рода, а также вводили поправку Бонферрони (равную трем, в соответствии с количеством анализируемых моделей). После проведения адаптивного пермутационного теста и введения поправки Бонферрони значимыми считали различия, при которых рре О П.
Установлено, что полиморфизм rs909253 Lta вовлечен в формирование показателей диастолического АД (таблица 27) в доминантной модели (р=0,010, ppeim=0,012 в модели I; р=0,007, ppeim=0,008 в модели II), а также в аддитивной модели с учетом всех ковариантов (р=0,008, ppeim=0,014 в модели II). Данный SNP ассоциирован с высокими показателями ДАД (р=0,03-0,04). Выявлены значимые ассоциации молекулярно-генетического маркера rs2981582 FGFR-2 с показателями диастолического артериального давления в рецессивной модели (р=0,010, pperm=0,011 в модели I; р=0,006, рреГт=0,006 в модели II). Полиморфизм rs2981582 FGFR-2 определяет повышенные значения диастолического АД (Р=0,05 и р=0,06). Ассоциаций полиморфизмов генов цитокинов с показателями систолического артериального давления выявлено не было (рРепп 0,017). Изучены связи анализируемых генов-кандидатов с показателями АД отдельно у мужчин и у женщин (таблицы 28, 29). Полиморфизм rs833061 VEGFA вовлечен в формирование показателей диастолического давления в доминантной (Р=-0,05, р=0,014-0,015) и аддитивной (Р=-0,05, р=0,011) моделях у мужчин, однако при введении соответствующих поправок различия не достигали уровня статистической значимости (ppeim 0,017). У женщин с высокими показателями диастолического артериального давления ассоциирован полиморфизм rs2981582 FGFR-2 в рецессивной (Р=0,08, р=0,009, pperm=0,010 в модели I; Р=0,10, р=0,002, ppeim=0,004 в модели II) и аддитивной (Р=0,04, р=0,008, pperm=0,009 в модели II) моделях. Таким образом, установлены пол-специфические особенности вовлеченности полиморфизмов генов цитокинов в формирование показателей АД: у мужчин значимых ассоциаций не установлено, а у женщин с уровнем АД ассоциирован полиморфизм rs2981582 FGFR-2.
Проанализированы ген-генные взаимодействия изучаемых локусов при формировании уровней систолического и диастолического артериального давления. Анализ проводился с поправкой на коварианты в двух моделях (модель I и модель II).
Эпистатические взаимодействия в 2х-локусных моделях изучались в программе PLINK, за статистически значимый уровень после введения поправки Бонферрони, равной 8 (в соответствии с числом изученных полиморфизмов), принимали р 0,0062. Установлено, что в формирование показателей диастолического АД вовлечена 2х-локусная модель, включающая полиморфизмы rs909253 Lta и rs 1800629 TNFa. Эпистатические взаимодействия данных SNP ассоциированы с высокими значениями ДАД в общей выборке (модель I - р=0,08, р=9,287е-005; модель II - р=0,08, р=5,236е-005). Двухлокусная модель rs909253 Ltaxrs 1800629 TNFa также вовлечена в формирование уровней диастолического артериального давления у мужчин (модель I - Р=0,09, р=0,0004; модель II - Р=0,10, р=0,00025).
Эпистатические взаимодействия данных молекулярно-генетических маркеров определяют высокие показатели ДАД (Р 0). У женщин выявлена 2х-локусная модель, включающая SNP rs 1800629 TNFa и rs 1800469 TGF0-1, которые, взаимодействуя, повышают уровень диастолического артериального давления (модель I - Р=0,09, р=0,0039). Сочетание генетических вариантов данных локусов ассоциировано с высокими показателями ДАД в модели I, однако, при введении поправки на характер питания и подверженность стрессам (модель II) различия не достигают уровня статистической значимости (р 0,0063).
Таким образом, в ходе исследования вовлеченности полиморфных маркеров генов цитокинов в формирование показателей артериального давления установлено, что:
1. Полиморфизм rs909253 Lta ассоциирован с высокими показателями диастолического АД в доминантной модели и в аддитивной моделях (Р=0,03-0,04, ррет=0,008-0,014). Локус rs2981582 FGFR-2 определяет высокие значения показателей диастолического артериального давления в рецессивной модели (Р=0,05-0,06, ррет=0,006-0,011) в общей выборке, а также в рецессивной и аддитивной моделях у женщин (Р=0,04-0,08, pperm=0,004-0,010).
2. Двухлокусная модель, включающая полиморфизмы rs909253 Lta и rs 1800629 TNFa, вовлечена в формирование показателей диастолического АД в общей выборке (Р=0,08, р=5,236е-005-9,287е-005), а также у мужчин (Р=0,09-0,10, р=0,00025-0,0004).
Исследование эпистатических взаимодействий генов-кандидатов цитокинов и матриксных металлопротеиназ при формировании предрасположенности к гипертонической болезни и ее осложнений
Настоящий раздел посвящен изучению межгенных взаимодействий 16 локусов 15 генов-кандидатов при формировании гипертонической болезни. Материалы по распределению генетических полиморфизмов ММР были получены ранее Москаленко М.И. [Москаленко М.И., 2017] по этим же группам больных и контроля. Проанализированы эпистатические взаимодействия следующих SNP: rsl80062977VFa, rs909253 Lta, rs767455 TNFR1, rsl061624 TNFR2, rs833061 VEGF, rs6214 IGF-1, rsl800469 TGFfi-1, rs2981582 FGFR-2, rsl 1568818 MMP-7, rsl320632 MMP-8, rsl 1225395 MMP-8, rsl799750 MMP-1, rs3025058 MMP-3, rs652438 MMP-12, rs243865 MMP-2, rsl7577 MMP-9, с поправкой на кофакторы. Анализ проводился методом логистической регрессии в программе РLINК, для коррекции количества изучаемых полиморфизмов вводилась поправка Бонферрони, равная 16, при этом статистически значимым считали р0,0031.
Установлена 2х-локусная модель взаимодействий, включающая локусы rs2981582 FGFR-2 и rsl320632 ММР-8, демонстрирующая значимые ассоциации с развитием гипертонической болезни как с учетом корректировки на показатели индекса массы тела и дислипидемию (OR=2,73, р=0,0009, модель I), так и при введении поправок на ИМТ, дислипидемию и такие средовые факторы риска, как курение, предпочтение к жирной пище, редкое употребление овощей и фруктов, низкая физическая активность (OR=2,70, р=0,0011, модель II). В рамках выявленной модели значимым предиктором развития ГБ является сочетание генотипов СТ/АА (больные ГБ -40,47%, контроль - 37,12%, OR=1,15, 95% СІ 0,91-1,46, 2=1,32, р=0,04).
Анализ 3х- и 4х-локусных моделей межгенных взаимодействий проводился методом GМDR, валидация полученных результатов осуществлялась при помощи пермутационного теста - выполнялось 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивало рpeim 0,001. Выявлены три 3х-локусные модели, ассоциированные с развитием гипертонической болезни (рисунок 19, таблица 41). Межгенные взаимодействия полиморфизмов генов цитокинов и матриксных металлопротеиназ в рамках выявленных моделей повышают риск развития ГБ (OR=3,51-3,66 в модели I и OR=3,37-3,60 в модели II). Для всех установленных моделей воспроизводимость составляла 100%; точность предсказания моделей варьировала в диапазоне 61,74-63,93% в модели I и 61,85-63,83% в модели II (р=0,001-0,011).
Основу всех установленных моделей составляют полиморфизмы rsl800629 TNFa и rs909253 Lta. В рамках выявленных моделей значимыми предикторами развития гипертонической болезни являются комбинации генотипов АА/GG/АА (больные ГБ - 44,52%, контроль - 27,90%, OR=2,07, 95% СІ 1,61-2,65, 2=35,46, р=0,001), ТТ/GG/АА (больные ГБ - 44,52%, контроль - 19,27%, OR=1 1,16, 95% СІ 1,34-2,68, =14,25, р=0,001), СТ/GG/АА (больные ГБ - 26,51%, контроль - 13,73%, OR=2,27, 95% СІ 1,66-3,10, =28,66, р=0,001). Данные сочетания повышают риск развития ГБ у их носителей (OR l).
При анализе вовлеченности полиморфизмов генов-кандидатов в формирование гипертонической болезни отдельно у мужчин и женщин, не установлено значимых ассоциаций 2х-, 3х- и 4х-локусных моделей межгенных взаимодействий с развитием данного заболевания.
Проведено исследование эпистатических взаимодействий генов-кандидатов цитокинов и матриксных металлопротеиназ при формировании такого осложнения ГБ, как ишемический инсульт. Установлены две 3х-локусные модели ген-генных взаимодействий, ассоциированные с возникновением инсульта как при корректировке на уровни триглицеридов и липопротеидов высокой плотности (модель I), так и с учетом поправки на концентрации триглицеридов, ЛПВП и средовые факторы риска (модель II) (таблица 42, рисунок 20).
Эпистатические взаимодействия молекулярно-генетических маркеров цитокинов и матриксных металлопротеиназ в рамках выявленных моделей повышают риск возникновения инсульта (OR=2,18-2,26 в модели I и OR=2,14-2,18 в модели II). Для всех установленных моделей воспроизводимость составляла 100%; точность предсказания моделей варьировала в диапазоне 58,10-58,14% в модели I и 61,85-63,83% в модели II (р=0,001-0,011). Основу моделей межгенных взаимодействий составляют полиморфизмы rs767455 TNFR1 и rs1061624 TNFR2. В рамках выявленных моделей значимыми предикторами развития инсульта являются сочетания генотипов АА/АG/АG (больные ГБ – 7,77%, контроль – 32,19%, OR=0,18, 95% СI 0,13-0,24, 2=37,21, р=0,001), АА/GG/АА (больные ГБ – 4,68%, контроль – 21,03%, OR=0,19, 95% СI 0,13-0,27, 2=89,78, р=0,001). Эти комбинации оказывают протективный эффект на развитие ишемического инсульта у их носителей (OR 1).
Таким образом, по итогам анализа эпистатических взаимодействий полиморфизмов генов цитокинов и матриксных металлопротеиназ при формировании предрасположенности к ГБ установлено, что с высоким риском развития данного заболевания ассоциированы 2х-локусная модель rs2981582 FGFR-2rs\320632 ММР-8 (OR=2,70, р=0,0011) и 3х-локусные модели rsl320632 MMPSrs 1800629 TNFars909253 Lta, rsl 1568818 MMP-7 rsl800629 TNFars909253 Lta, rsl 1225395 MMP-8rs1800629 TNFars909253 Lta (OR=3,37-3,60, p=0,001-0,011).
Модели межгенных взаимодействий rsl320632 MMP-8XYS767455 TNFR1 xrsl061624 TNFR2 и rs243865 MMP-2 XYS7 67 455 TNFRlxrs 1061624 TNFR2 ассоциированы с развитием ишемического инсульта на фоне ГБ (OR=2,14-2,18,p=0,011).