Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .14
1.1 Механизмы формирования различных цитогенетических повреждений, регистрируемых с помощью микроядерного теста 14
1.1.1 Механизмы формирования микроядер 14
1.1.2 Механизмы формирования нуклеоплазменных мостов 18
1.1.3 Механизмы формирования протрузий 21
1.2 Оценка уровня цитогенетических нарушений c помощью микроядерного теста в лимфоцитах периферической крови,культивируемой в условиях цитокинетического блока 22
1.2.1 Использование показателей частоты микроядер в лимфоцитах для характеристики генотоксической нагрузки на организм человека 24
1.2.2 Повышенный уровень цитогенетических нарушений, выявляемых с помощью микроядерного теста, как маркер риска развития онкологических заболеваний .27
1.3 Основные механизмы и ключевые ферменты репарации ДНК 28
1.3.1 Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) .30
1.3.2 Эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН) .34
1.3.3 Репарация двойных разрывов (DSBR) .37
1.3.4 Ассоциации полиморфизма генов репарации ДНК с биомаркерами генотоксического эффекта в условиях экспозиции мутагенными факторами .39
1.4 Проблема оценки генотоксического риска в когортах работников угольных шахт .46
1.4.1 Условия труда и факторы риска в угольных шахтах 48
1.4.2. Характеристика хронических легочных профессиональных патологий шахтеров 49
1.4.3 Генотоксические факторы производственной среды угледобывающих предприятий 52
1.4.4 Применение микроядерного теста в лимфоцитах периферической крови для оценки цитогенетических повреждений у работников угольных шахт .54
ГЛАВА 2. Материалы и методы 59
2.1 Материалы исследования .59
2.2 Методы цитогенетического анализа 62
2.3 Методы молекулярно-генетического анализа 66
2.4 Методы статистической обработки результатов исследования 70
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение .73
3.1 Изучение цитогенетических нарушений и показателей пролиферации в лимфоцитах работников угледобывающих предприятий и в контроле... 73
3.1.1 Частота и спектр цитогенетических повреждений... 73
3.1.2 Показатели пролиферативной активности лимфоцитов и частота клеток на стадиях митоза и апоптоза .78
3.1.3 Влияние возраста, стажа работы, статуса и интенсивности курения, профессиональной специализации и наличия хронических заболеваний легких на частоту и спектр цитогенетических нарушений и показатели пролиферативной активности лимфоцитов у шахтеров .81
3.2 Анализ частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов репарации ДНК XRCC1 (rs25487), hOGG1 (rs1052133), ADPRT (rs1136410), XpD (rs13181), XpG (rs17655), XRCC4 (rs1805377, rs6869366, rs2075686), Lig4 (rs1805388), ATM (rs1801673) и NBS1 (rs1805794) 96
3.3 Оценка ассоциации цитогенетических повреждений и показателей пролиферации с полиморфными вариантами генов репарации ДНК 103
3.4 Анализ межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов ферментов репарации ДНК, определяющих формирование повышенного уровня цитогенетических повреждений у шахтеров .118
Заключение 123
Выводы 128
Список литературы .
- Повышенный уровень цитогенетических нарушений, выявляемых с помощью микроядерного теста, как маркер риска развития онкологических заболеваний
- Проблема оценки генотоксического риска в когортах работников угольных шахт
- Методы цитогенетического анализа
- Анализ межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов ферментов репарации ДНК, определяющих формирование повышенного уровня цитогенетических повреждений у шахтеров
Повышенный уровень цитогенетических нарушений, выявляемых с помощью микроядерного теста, как маркер риска развития онкологических заболеваний
Непрерывная экспозиция клеток различными химическими и физическими (главным образом ионизирующей радиацией) мутагенными факторами, а также клеточными метаболитами, приводит к образованию целого ряда радикальных частиц, например, активных форм кислорода. Химические модификации азотистых оснований инициируют одно- и двуцепочечные разрывы молекулы ДНК, образование ковалентной связи между ДНК и белком, а также инициацию так называемых AP-сайтов (апуриновых/апиримидиновых сайтов). Данные типы повреждений в большей степени репарируются именно с помощью механизма эксцизионной репарации оснований (Wood et al., 2001).
Эксцизионная репарация оснований играет ведущую роль в репарации спонтанных повреждений (Wilson et al., 1998). Снижение эффективности репарации по данному механизму приводит к развитию онкологических и нейродегенеративных заболеваний и преждевременному старению (Lindahl, 2000). Данный факт свидетельствует о том, что ферменты эксцизионной репарации оснований могут являться кандидатами на роль факторов индивидуальной чувствительности к воздействию различных генотоксикантов. На первом этапе репарации по данному механизму происходит распознавание участка с дефектными и/или некомплементарными нуклеотидами и последующее удаление поврежденного участка посредством разрушения гликозильной связи между азотистым основанием и остатком пентозы. В результате на цепи ДНК образуется AP-сайт, не содержащий основание. Далее он вырезается и репарируется с участием фосфодиэстераз, ДНК-полимераз и ДНК-лигаз. Помимо этого, во время репарации по данному механизму вырезаются другие производные, образующиеся в результате действия на ДНК химических мутагенов (этонопуриновые производные азотистых оснований, образованные в результате действия винилхлорида; С8-аддукты аминофлуорена). На следующей стадии АР-дезоксирибоза, образовавшаяся в результате удаления модифицированного азотистого основания, вырезается с помощью фермента АР-лиазы, который высвобождает ее 3 -конец, а фермент АР-эндонуклеаза гидролизует ее 5 -концевую фосфодиэфирную связь в АР-сайте, после чего образовавшийся разрыв заполняется с помощью ДНК-полимеразы (Wilson et al., 1998) (рис. 3).
Белок XRCC1 (X-ray-repair cross-complementing group 1) играет важную роль в процессе эксизионной репарации оснований. Он взаимодействует с целым комплексом ферментов репарации, включающим в себя АДФ-рибозилтрансферазу (ADPRT), ДНК-лигазу, ДНК-полимеразу . Сам по себе XRCC1 практически не проявляет ферментной активности, но является субстратом для системы ферментов эксцизионной репарации оснований. Ген XRCC1 расположен на хромосоме 19q13.2. Известны 3 наиболее распространенные аминокислотные замены: самой высокой частотой встречаемости в глобальной популяции характеризуется ген XRCC1 Arg399Gln. В ряде исследованиях описана связь снижения активности фермента XRCC1 и увеличения чувствительности к мутагенам, что выражается в повышении частоты сестринских хроматидных обменов (СХО) и аберраций хроматидного типа (Thompson et al., 1990; Tebbs et al., 1999; Chandirasekar et al., 2011), а также МЯ (Wang et al., 2010; Chandirasekar et al., 2011; Wang et al., 2013; Feng et al., 2014).
Одним из наиболее распространенных повреждений ДНК является образование окисленной формы гуанина (8-гидроксигуанин – oxoG). У человека репарацию данного повреждения осуществляет фермент hOGG1 (8-oxoguanine DNA glycosylase1). На настоящий момент известно 2 типа данного гена, длиной 345 и 424 п.н. (-hOGG1 и -hOGG1), образующихся в результате альтернативного сплайсинга гена hOGG1, который расположен на хромосоме 3p25. Оба белка работают по одному механизму, вырезая ту пару оснований, которая содержит 8-гидроксигуанин. Эти белки главным образом работают в ядре и митохондриях соответственно: ядерный белок -hOGG1 вырезает oxoG и 2 6-диамино-4-гидрокси-5-N-метилформамид-пиримидин с 3 конца AP-сайта. Показано, что активность фермента hOGG1 влияет на частоту МЯ в лимфоцитах (Mateuca et al., 2008; Wang et al., 2010).
Проблема оценки генотоксического риска в когортах работников угольных шахт
заболеваниями, принимающие лекарственные препараты, обладающие подтвержденным мутагенным Обследованные, включенные в экспонированную и контрольную группы имели близкий социально-экономический статус и сходные схемы питания. Лица старше 60 лет, а также лица, на момент участия в обследовании страдающие онкологическими и инфекционными эффектом, проходившие рентгенологические процедуры за 3 месяца до сбора материала, исключались из исследования. Забор образцов крови проводили из локтевой вены с использованием разовых вакуумных пробирок типа вакутейнер. Общий объем крови (10 мл) разделяли на порции: 4 мл цельной крови набиралось в пробирки с Na-гепарином (материал в дальнейшем использовался для проведения цитогенетического анализа); 6 мл цельной крови – в пробирки с K2-ЭДТА (материал использовался для выделения образцов геномной ДНК). Образцы крови в охлажденном состоянии (+40С) транспортировали в лабораторию для проведения анализов. После сбора биологического материала осуществляли его первичную обработку, в которую включали выделение и консервацию образцов геномной ДНК, культивирование лимфоцитов, а также фиксацию и приготовление препаратов для цитогенетического анализа.
Генотоксические эффекты изучали с помощью МЯ теста в ЛПК, культивируемой в условиях цитокинетического блока (Surralles et al., 1992; Fenech, 1993). Данный тест широко используется для оценки факторов окружающей среды (физической, химической и биологической природы) на мутагенную активность и обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методиками, такими как метод учета структурных ХА и оценкой уровня СХО. Принимая во внимание тот факт, что на шахтеров, занятых на подземных угольных шахтах, действует целый комплекс генотоксических агентов, и выделить основной фактор не представляется возможным (White, 2002; Leon-Mejia et al., 2011), МЯ тест является наиболее подходящим тестом для оценки хромосомной нестабильности в данной когорте. Отсутствие необходимости идентификации структурных повреждений хромосом значительно ускоряет процесс анализа препаратов и позволяет получить результаты за более короткий промежуток времени, а также снижает трудоемкость методики и требования к квалификации исследователя (Ильин, 2006; Калаев и др., 2012). Помимо этого, МЯ тест является относительно дешевым, и позволяет проводить оценку цитогенетических повреждений в тканях, характеризующихся низкой митотической активностью. С помощью МЯ теста также можно получить информацию о скорости пролиферации лимфоцитов, а также доли клеток, находящихся на стадии митоза и апоптоза (Fenech, 2007). Показатели частоты нарушений, регистрируемых с помощью МЯ теста в лимфоцитах, характеризуют степень повреждения ДНК за счет действия различных генотоксических агентов, а также эффективность процессов репарации ДНК, устраняющих эти повреждения.
До начала культивирования кровь хранилась в холодильнике при температуре +4С (продолжительность хранения составляла не более 24 часов). Затем 200 мкл крови вносили во флаконы, содержащие 3,8 мл культуральной среды (среда RPMI-1640 + 20% сыворотки крупного рогатого скота + 100 Ед/мл ампицилина). Во флаконы добавляли фитогемагглютенин («ПанЭко», г. Москва) из расчета 30 мкг/флакон и культивировали в течение 44 часов при температуре 37С. Через 44 часа от начала культивирования в каждую культуру добавляли цитохалазин Б («ПанЭко», г. Москва) до конечной концентрации 6 мкг/мл и культивировали еще 24 часа при той же температуре.
По окончании цикла клетки ресуспендировали во флаконах, переливали в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут на скорости 1000 об/мин. Надосадок убирали. Осадок осторожно растрясали, и в пробирку по стенке осторожно приливали 1 мл холодного свежеприготовленного 0,125 М раствора KCl. Осадок мягко ресуспендировали в этом растворе, а затем приливали еще 4 мл этого раствора, закрывали пробирку и несколько раз переворачивали (процедура должна занимать не более 30 секунд). По окончанию процедуры в пробирку осторожно по стенке приливали 1 мл холодного свежеприготовленного фиксатора Карнуа (смесь метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1) и перемешивали.
Суспензию центрифугировали 10 минут на скорости 1000 об/мин., надосадок отсасывали, осадок мягко растрясали пальцем, не переворачивая пробирку, и по стенке приливали 10 мл холодного фиксатора. Пробирки убирали в холодильник (+4С) на 1 час. Далее снова проводили центрифугирование в течение 10 минут на 1000 об/мин. После этого повторяли предыдущую стадию.
Методы цитогенетического анализа
Полученные результаты соотносятся с данными, полученными другими исследователями. Так, G. Leon-Mejia с соавторами (2011) и P. Rohr с соавторами (2013) в своих работах по изучению чувствительности генома работников угольных разрезов получили сходные данные о превышении частоты лимфоцитов с МЯ в экспонируемой группе, однако общая частота данного показателя была несколько ниже, чем в нашем исследовании (Leon-Mejia et al., 2011; Rohr et al., 2013). Это, вероятно, обусловлено тем, что в закрытых пространствах угольных шахт отмечается накопление повышенной (по сравнению с разрезами) концентрации генотоксических агентов, что усиливает экспозицию работников и увеличивает степень повреждения их ДНК. В то же самое время частота клеток с нуклеоплазменными мостами была значительно выше в выборке, изученной исследователями из Бразилии (Rohr et al., 2013) по сравнению с результатами, полученными в нашей работе. Принимая во внимание тот факт, что нуклеоплазменные мосты (маркеры нарушения репарации ДНК или слияния теломер) формируются из дицентрических хромосом и рассматриваются в качестве маркеров радиационного воздействия, можно предположить повышенный радиационный фон в шахтах Бразилии, связанный с различной радиоактивностью углей, добываемых в различных угледобывающих регионах (Сидорова, 2008; Lauer et al., 2015). В работе турецких исследователей также была отмечена тенденция к увеличению уровня клеток с МЯ у рабочих подземных битумных угольных шахт по сравнению с донорами, не занятыми на вредных производствах (управляющие должности). При этом общий уровень клеток с МЯ, выявленный в данной работе, был значительно выше как в экспонированной группе, так и в контроле по сравнению с полученными нами результатами (Donbak et al., 2005). В статье Ulker et al. (2008) были описаны противоположные результаты. В данном исследовании были изучены три группы людей – шахтеры с установленным диагнозом «пневмокониоз», здоровые шахтеры, и группа неэкспонированных доноров. В результате проведенных исследований было установлено, что уровень лимфоцитов с МЯ, а также частоты сестринских хроматидных обменов, достоверно не отличались между здоровыми шахтерами и контрольной группой, в то время как пациенты с диагнозом «пневмокониоз» характеризовались повышенной частотой цитогенетических повреждений. Эти результаты свидетельствуют о том, что воспалительный процесс может оказывать серьезное модифицирующее влияние на степень повреждения генетического аппарата у шахтеров угольных шахт (Ulker et al. 2008). Цитогенетические повреждения шахтеров, регистрируемые на хромосомном уровне с помощью различных тестов, в том числе и с помощью МЯ теста, могут быть индуцированы целым комплексом генотоксических агентов, таких как активные формы кислорода (АФК), ПАУ, ионизирующая радиация, тяжелые металлы и различные неорганические компоненты угольной пыли.
Было предположено, что АФК вовлечены в патогенез легочных заболеваний и канцерогенез у рабочих, экспонированных различными опасными агентами (Schins et al., 1995; Beckman, Ames, 1997; Cooke et al., 2003). Главными клетками-мишенями для вдыхаемых частиц угольной пыли являются макрофаги и эпителиальные клетки. Активация макрофагов вызывает высвобождение большого количества АФК. АФК могут образовываться и по клеточно-независимому механизму, связанному с химическими свойствами компонентов угольной пыли (например, поверхностные радикалы и железо). Эпителиальные клетки и фибробласты, которые являются главным источником внутриклеточного матрикса, также могут продуцировать образование АФК после стимуляции. Другие фагоцитарные клетки (нейтрофилы, моноциты) могут увеличивать локальное образование АФК (Schins, Borm, 1999; Leon-Mejia et al., 2011). Чрезмерная продукция АФК может приводить к возникновению оксидативного стресса, который, в свою очередь, способен инициировать повреждение ДНК, перекисное окисление липидов, модификацию белков, разрушение мембран и повреждение митохондрий (Zhai et al., 2002).
В дополнении к оксидативному стрессу, большое количество таких генотоксических компонентов, как ПАУ (бензофлуорантен, пирен и флуорантен) воздействуют на организм шахтеров в условиях подземных шахт (Sai, 1995). ПАУ индуцируют такие повреждения ДНК, как однонитевые разрывы (Brescia et al., 1999; Rojas et al., 2000; Pavanello et al., 2005) и способствуют образованию электрофильных метаболитов (Singh et al., 2007), которые взаимодействуют с ДНК и формируют аддукты с пуринами, в особенности с гуанином, после метаболической активации ферментного комплекса Р450 (Baird et al., 2005).
Ионизирующая радиация является еще одним генотоксическим фактором, воздействующим на шахтеров и приводящим к возникновению двойных разрывов ДНК (Friedberg, Meira, 2004; Lieber, 2010; Robertson et al., 2013; Jain et al., 2016). Таким образом, обнаруженное нами повышение частоты цитогенетических повреждений в группе шахтеров свидетельствует о выраженном генотоксическом воздействии факторов производственной среды угольных шахт. Особенности этой производственной среды обуславливают комплексность действия кластогенных факторов, что усиливает эффекты экспозиции и приводит к повышению нестабильности генетического аппарата работников данной отрасли.
Одним из преимуществ МЯ теста по сравнению с другими цитогенетическими методиками, используемыми для оценки эффектов воздействия кластогенных факторов на стабильность генетического аппарата людей, является его многофункциональность, т.е. возможность использования не только для оценки мутагенных и кластогенных эффектов, но и для изучения показателей пролиферации клеток. Информация об интенсивности этого процесса может быть полезной для изучения цитостатических эффектов, связанных с воздействием тех или иных физических или химических агентов на организм человека.
Анализ межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов ферментов репарации ДНК, определяющих формирование повышенного уровня цитогенетических повреждений у шахтеров
Полученные результаты (с учетом поправки на множественность сравнения) о влиянии полиморфных вариантов генов эксцизионной репарации оснований hOGG1 977C G (rs1052133) и репарации двойных разрывов ДНК Lig4 26C T (rs1805388) на частоту лимфоцитов с МЯ согласуются с имеющимися литературными данными. Известно, что основными механизмами образования МЯ являются ошибки репарации двойных разрывов ДНК, которые приводят к образованию хроматидных и хромосомных фрагментов, которые, в свою очередь, реализуются в МЯ (Savage, 1988; Mateuca et al., 2006; Fenech, 2007, 2010), а также ошибки эксцизионной репарации оснований, при которых модифицированные азотистые основания, расположенные в непосредственной близости друг к другу на комплементарных нитях ДНК, не репарируются, что приводит к двойным разрывам и образованию МЯ (Fenech, Crott, 2002; Bull, Fenech, 2008).
Помимо этого, известно, что белок hOGG1, кодируемый одноименным геном, играет важнейшую роль в защите клетки от оксидативных повреждений ДНК (Paquet et al., 2015). Учитывая, что одним из генотоксических факторов, действующих на шахтеров, является оксидативный стресс, репарация оксидативных повреждений является одним из ключевых механизмов поддержания стабильности генетического аппарата, и мутации в генах, кодирующих белки, участвующие в репарации повреждений, вызванных АФК, могут приводить к изменению цитогенетического статуса доноров с «рисковыми» аллелями. Известно, что генотип GG характеризуются синтезом фермента со сниженной активностью (Wang et al., 2006), что приводит к уменьшению репаративной активности у лиц с данным аллельным вариантом (Vodicka et al., 2007); и ассоциирован с повышенным риском развития рака (Wikman et al., 2000; Weiss et al., 2005; Li et al., 2008; Michalska et al., 2015; Xie et al., 2016). В то же самое время, гомозиготы по мажорному аллелю CC ассоциированы с синтезом более активного фермента, что приводит к более эффективному вырезанию 8 117 оксогуанина и снижению мутагенной нагрузки на генетический аппарат (Dherin et al., 1999; Paquet et al., 2015). Данная информация согласуется с полученными нами результатами о превышении частоты клеток с МЯ у доноров с генотипом GG, и снижению частоты данного показателя у лиц с генотипом CC.
Ген Lig4 является одним из ключевых генов, кодирующих фермент, который участвует в репарации двойных разрывов ДНК по механизму негомологичного слияния концов (NHEJ). Белок Lig4 является АТФ зависимой ДНК лигазой, которая использует АТФ для аденилирования, и затем переносит АМФ группу на 5 -конец одной из цепи ДНК. При этом гидроксильная группа 3 -конца другой цепи ДНК подвергается нуклеофильной атаке, что высвобождает АМФ и способствует образованию продукта лигирования. Мутация rs1805388 приводит к несинонимичной замене Thr на Ile в N-концевой области белка Lig4, что имеет важное значение для его функциональности (Ji et al., 2013). Было показано, что эта замена снижает интенсивность аденилирования и активность лигирования (в два-три раза) и увеличивает гидрофобный характер этой области белка (O Driscoll et al., 2001; Girard et al., 2004). Изменения структуры белка Lig4, в свою очередь, приводит к нарушению взаимодействия с XRCC4, что снижает эффективность репарации. Обнаружено, что в наибольшей степени снижение эффективности репарации характерно для гомозигот по минорному аллелю (Ji et al., 2013), что проявляется в увеличении частоты ХА в лимфоцитах (Volkov et al., 2013). Также была показана связь данного полиморфизма с иммунодефицитом (Roddam et al., 2002; Ben-Omran et al., 2005), радиационного пневмонита (Yin et al., 2012) и немелкоклеточного рака легкого (Tseng et al., 2009). Гомозиготы по минорному аллелю были ассоциированы с повышенной чувствительностью к развитию глиомы (Zhao et al., 2013). Полученные нами результаты также свидетельствуют о снижении эффективности репарации у индивидов с генотипом TT, что выражается в повышении частоты клеток с МЯ.
Таким образом, в условиях экспозиции генотоксическими факторами угледобывающих предприятий шахтеры с генотипами, ассоциированными со снижением эффективности репарации ДНК, характеризуются повышенным уровнем цитогенетических повреждений. У доноров из контрольной группы, не работающих в шахтах, изменений в цитогенетическом статусе в зависимости от аллельных вариантов генов репарации ДНК не наблюдается.