Введение к работе
Актуальность темы. Многие используемые человеком лекарства приводят к активации генов. Подобная активация либо лежит в основе терапевтического действия препарата, либо приводит к побочным, часто нежелательным эффектам. Таким образом, изучение механизмов активации генов лекарственными препаратами является актуальной задачей. Фенобарбитал (ФБ), широко используемое снотворное и противосудорожное средство, способен активировать транскрипцию десятков генов в организме человека. В частности, в печени человека и животных фенобарбитал активирует несколько генов, кодирующих ферменты цитохромы Р450. Механизм индукции цитохромов Р450 фенобарбиталом активно изучается на протяжении последних тридцати лет. В настоящее время происходит накопление экспериментальных данных о регуляторных элементах генов, вовлеченных в индукцию этого типа.
Ген CYP102 Bacillus megaterium (В.тед.) кодирует цитохром Р450вм-3. Он активируется различными лекарственными препаратами: барбитуратами, кло-фибратами, жирными кислотами. С 1991 года ген CYP102 используется в качестве модельного объекта для изучения молекулярных механизмов активации генов фенобарбиталом.
Целью настоящей работы являлось выявление потенциальных регуляторных элементов гена цитохрома Р450вм-3 (CYP102) В.тед., которые могут участвовать в активации этого гена фенобарбиталом. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
V Выявить районы ДНК в области гена CYP102, специфически взаимодействующие с клеточными белками В.тед. при культивировании бактерий в среде без ФБ и в среде с ФБ.
-
С помощью футпринт-анализа более точно локализовать районы выявленных ДНК-белковых взаимодействий.
-
Охарактеризовать выявленные белки по молекулярной массе.
-
Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей в белок-свяэывающих районах с последовательностями известных регуляторных элементов.
Научная новизна работы. В результате проведенного исследования в области гена CYP102 с помощью футпринт-анализа было выявлено четыре неизвестных ранее района ДНК, которые образуют комплексы с белками только при
культивировании бактерий без ФБ. Это свидетельствует о том, что выявленные районы ДНК являются потенциальными негативными регуляторными элементами гена CYP102. Два выявленных элемента прилегают к старту транскрипции гена CYP102, два расположены в кодирующей области этого гена.
Впервые для генов суперсемзйства Р450 потенциальные регуляторные элементы выявлены в кодирующей области гена. При анализе нуклеотидных последовательностей обнаружено, что локализованные нами потенциальные регуляторные элементы как в области, прилегающей к старту транскрипции, так и в кодирующей области гена CYP102 обладают гомологией с консенсусной последовательностью Барби-бокс (известный регуляторный элемент, найденный до настоящего исследования только в 5'-фланкирующих районах генов, кодирующих ФБ-индуцируемые ферменты).
Впервые продемонстрировано взаимодействие белка с молекулярной массой около 20кДа с двумя двуцепочечными фрагментами ДНК, соответствующими районам в области, прилегающей к старту транскрипции гена CYP102 (выше и ниже старта транскрипции). Впервые для генов цитохромов Р450 выявлен белок, способный специфически взаимодействовать с одноцепочечными районами ДНК в области гена CYP102, прилегающей к старту транскрипции. Показано, что этот белок обладает наибольшим сродством к трем оц участкам ДНК в этой области - к одному участку нетранскрибируемой цепи ДНК и к двум участкам транскрибируемой цепи ДНК. Молекулярная масса этого белка близка к 50 кДа.
Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в работе результаты являются новой информацией о возможных регуляторных элементах гена цитохрома Р450вм-3 и способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно- функциональной организации генов цитохромов Р450, активируемых лекарственными препаратами. Полученные данные о потенциальных регуляторных элементах гена могут быть полезны в практических работах, связанных с оптимизацией экспрзссии гена CYP102 и направленых на создание монооксигеназ с заданными свойствами.
Публикации и апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи. Результаты работы были представлены на семи международных конференциях: "IXth International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation" (1992, Jerusalem), "6th North American ISSX Meeting", (1994, Raleigh, North Carolina), "4th
International ISSX Meeting" (1995, Seattle), "Cytochrome P450 biodiversity", (1995, Woods Hole, Massachusetts), франко-российском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (1995, Новосибирск), "7th North American ISSX Meeting" (1996, San Diego), "Xlth International symposium on Microsomes and Drug Oxidations" (1996, San Francisco).
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 36 рисунков и 6 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов, методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 185 источников.