Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современные представления об особенностях клинического течения истинной полицитемии, факторах, влияющих на прогноз заболевания и результаты лечения .13
1.1 Определение, этиология, распространенность и патогенез истинной полицитемии 13
1.2 Клинические, морфологические и лабораторные проявления истинной полицитемии 17
1.3 Диагностика истинной полицитемии 20
1.4 Лечение истинной полицитемии 24
1.5 Нерешенные проблемы в лечении истинной полицитемии
1.5.1 Роль аллельной нагрузки мутантного гена JAK2V617F в течении истинной полицитемии .28
1.5.2 Роль генетических особенностей системы гемостаза в развитии тромбозов при истинной полицитемии 30
1.5.3 Факторы, влияющие на особенности течения истинной полицитемии и показатели выживаемости 33
1.5.4 Индивидуализация терапии больных истинной полицитемией .38
Глава 2. Методы исследования и характеристика пациентов 42
2.1 Дизайн исследования 42
2.2 Характеристика исследуемой группы пациентов 43
2.3 Методы исследования
2.3.1 Клинические и инструментальные методы 45
2.3.2 Метод качественного определения мутации JAK2V617F 46
2.3.3 Метод количественного определения аллельной нагрузки JAK2V617F 47
2.3.4 Метод исследования аллельных полиморфизмов генов .48
2.4 Статистическая обработка данных з
Глава 3. Результаты исследования 52
3.1 Влияние клинических и молекулярно-генетических характеристик истинной полицитемии на частоту тромботических осложнений, ответ на терапию, развитие постполицитемического миелофиброза и выживаемость больных .52
3.1.1 Факторы, влияющие на развитие постполицитемического миелофиброза 52
3.1.2 Факторы, влияющие на общую выживаемость больных истинной полицитемией .55
3.1.3 Оценка влияния клинических и молекулярно-генетических факторов на результаты терапии 58
3.2 Изучение степени влияния аллельной нагрузки JAK2V617F на течение и исход истинной полицитемии, в том числе на частотуразвития тромботических осложнений 64
3.3 Оценка риска тромбообразования у больных истинной полицитемией с учетом генетических особенностей системы гемостаза 69
3.4 Новые прогностические факторы ответа на лечение, общей выживаемости и вероятности развития постполицитемического миелофиброза на основе клинических и молекулярно-генетических проявлений заболевания 80
Обсуждение 86
Выводы 97
Практические рекомендации .98
Список сокращений и условных обозначений .100
Список литературы
- Диагностика истинной полицитемии
- Роль генетических особенностей системы гемостаза в развитии тромбозов при истинной полицитемии
- Метод количественного определения аллельной нагрузки JAK2V617F
- Оценка влияния клинических и молекулярно-генетических факторов на результаты терапии
Введение к работе
Актуальность исследования
Истинная полицитемия (ИП) - это заболевание из группы Ph-негативных миелопролиферативных новообразований. Вплоть до 2005 г. не было информации о молекулярно-генетических диагностических маркерах ИП и диагноз устанавливался в первую очередь на основании клинико-лабораторной картины заболевания и исключения причин вторичного эритроцитоза, что, зачастую, представляло значительные сложности в связи с широкой распространенностью курения, сердечно-сосудистой патологии и ожирения в популяции.
Открытие патогенетической роли мутации JAK2V617F в 2005 году явилось началом новой эры в изучении миелопролиферативных новообразований, включая ИП. Обнаружение данного молекулярного маркера значительно облегчило постановку диагноза ИП и способствовало развитию направления таргетной терапии в лечении. Результатом исследований явилось включение наличия мутации JAK2V617F в большие диагностические критерии ИП ВОЗ в редакциях 2008 и 2016 гг. [Arber D.A. et al., 2016; Vardiman J.W. et al., 2009].
Клиническое течение ИП в сравнении с другими миелопролиферативными новообразованиями можно охарактеризовать как доброкачественное, однако риск развития осложнений, угрожающих жизни или приводящих к инвалидизации значителен.
Общая выживаемость при ИП при правильном подходе к лечению и профилактике осложнений может составлять около 20 лет, не приводя, таким образом, к значительному ограничению продолжительности жизни. Тем не менее, когда речь идет о молодых больных (с дебютом заболевания в возрасте менее 50 лет), такой показатель общей выживаемости не выглядит многообещающим. Следовательно, выявление прогностических особенностей течения заболевания, влияющих на общую выживаемость и риск развития осложнений при ИП, является жизненно важным.
Основной причиной, приводящей к инвалидизации и снижению продолжительности жизни пациентов с ИП, является склонность к тромбозам и тромбоэмболиям.
Выделяется множество факторов, влияющих на частоту развития тромбозов у больных ИП: преклонный возраст, наличие тромботических эпизодов в анамнезе, лейкоцитоз, курение, гиперхолестеринемия, сахарный диабет.
Особого внимания требуют рецидивы тромбозов, характеризующиеся более высокими рисками ограничений жизнедеятельности и летальных исходов. Для эффективной вторичной профилактики тромбоэмболических осложнений при ИП необходимо выявление значимых факторов прогноза и индивидуализации терапевтической тактики с целью гарантированного снижения риска повторных тромботических событий.
Согласно литературным данным, наличие мутации JAK2V617F является
самостоятельным независимым фактором риска развития тромбозов при
миелопролиферативных новообразованиях [Finazzi G. et al., 2007; Arellano-Rodrigo E. et al., 2006]. Однако в настоящее время остается открытым вопрос относительно вклада в этот риск величины аллельной нагрузки JAK2V617F, её влияния на частоту развития тромбозов, течение и исход ИП.
В последнее десятилетие в вопросах изучения происхождения тромбозов всё больше
внимания уделяется такому состоянию, как наследственная тромбофилия, в том числе, и у
больных ИП. Проводятся различные исследования для оценки значимости маркеров
наследственной тромбофилии в развитии тромбозов у больных ИП, однако однозначные
выводы об их роли ещё не сделаны. Это может быть связано с тем, что внимание
исследователей приковано, главным образом, к двум генетическим аномалиям,
ассоциированным с наследственной тромбофилией – мутациям в генах факторов II (G20210A) и V (FV Leiden). В то же время, при ИП большее значение могут играть наследственные факторы, связанные с изменением активности тромбоцитарного звена гемостаза, вязкости крови, состояния сосудистого эндотелия, фибринолитической активности. В этой связи, возникает необходимость исследования протромбогенных вариантов аллельного полиморфизма генов:
метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), фибриногена (FI), ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), тромбоцитарного рецептора фибриногена (GPIIIA).
Не менее важными осложнениями течения ИП являются исход в постполицитемический миелофиброз и бластная трансформация. До сих пор нет информации о факторах, влияющих на развитие данных осложнений и возможности их прогнозирования. Накопление данных позволяет ставить вопрос о клинических и молекулярно-генетических особенностях ИП в роли таких факторов и прогностических маркеров.
Основными направлениями в терапии ИП являются: антиагрегантная терапия,
афферентные методы (эритроцитаферез, гемоэксфузии) и циторедукция. Возможность
сдерживания прогрессирования заболевания с помощью стандартной терапии
(гидроксикарбамид, препараты -интерферона) в настоящее время не доказана. В лечении ИП в последние годы началась новая эра направленной (таргетной) терапии, которая дает надежду на ответ на лечение и улучшение качества жизни у пациентов, резистентных к стандартной терапии. К сожалению, более высокая эффективность таргетных препаратов – ингибиторов янускиназ сопряжена также и с гораздо более высокой их стоимостью по сравнению с традиционной циторедуктивной терапией. Это определяет необходимость выделения категории больных, в первую очередь, нуждающихся в лечении таргетными препаратами по жизненным показаниям.
Таким образом, для обеспечения своевременной диагностики, правильного выбора терапии, своевременной смены терапии при наличии резистентности, необходима разработка комплексной программы диагностики и индивидуализации терапии ИП, с учетом молекулярно-генетических особенностей и прогностических маркеров течения заболевания.
Степень разработанности темы
Имеется большое количество данных о значимости мутации JAK2V617F в патогенезе ИП. Однако до настоящего времени остается неизученным вопрос относительно влияния уровня аллельной нагрузки мутантного гена JAK2V617F на риск тромбообразования, клиническое течение и исходы заболевания. Также не определена роль аллельной нагрузки при прогнозировании ответа на имеющиеся виды терапии.
В оценке риска тромбообразования остаются нерешенными вопросы о степени влияния наследственной тромбофилии. Большое количество исследований проведено для оценки влияния мутации гена фактора V (Лейденской мутации) и мутации в гене протромбина. При этом значительно меньше данных о значении протромбогенных вариантов генов метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), фибриногена (FI), ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), тромбоцитарного рецептора фибриногена (GPIIIA).
Имеющиеся в настоящее время принципы диагностики и лечения не обеспечивают индивидуального подхода к больным ИП. Детальное изучение клинических и молекулярно-генетических факторов позволит персонализировать тактику ведения пациентов с истинной полицитемией.
Цель исследования
Оценить влияние клинических и молекулярно-генетических факторов на течение заболевания, показатели выживаемости, риск тромботических осложнений и результаты терапии у больных истинной полицитемией.
Задачи исследования
1. Оценить влияние клинических (возраст, симптомы заболевания, уровни эритроцитов, гематокрита, лейкоцитов, тромбоцитов) характеристик истинной полицитемии на частоту тромботических осложнений, развитие постполицитемического миелофиброза и выживаемость больных.
2. Определить клиническое значение уровня аллельной нагрузки JAK2V617F и его
влияние на течение и исходы истинной полицитемии, в том числе на частоту развития
тромботических осложнений.
-
Изучить особенности полиморфизма генов факторов // и V, метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), фибриногена (FI), ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), тромбоцитарного рецептора фибриногена (GPIIIA) у больных ИП в зависимости от наличия в анамнезе эпизодов артериального или/и венозного тромбоза.
-
Разработать алгоритм определения прогноза ответа на лечение, общей выживаемости, рисков тромботических осложнений и вероятности развития постполицитемического миелофиброза на основе клинических и молекулярно-генетических проявлений истинной полицитемии.
Научная новизна исследования
Впервые в медицинской практике выявлены различия в течении заболевания, показателях выживаемости, результатах терапии больных истинной полицитемией в зависимости от клинических и молекулярно-генетических факторов и изучена ассоциативная связь между уровнем аллельной нагрузки мутантного гена JAK2V617F у больных истинной полицитемией и ответом на терапию, развитием тромботических осложнений и исходами заболевания. Получены новые данные о роли аллельного полиморфизма генов фактора V (G1691A, Лейденская мутация), протромбина (FII G20120A), гликопротеина IIIa (Т1565С), -субъединицы фибриногена (G-455A), ингибитора активатора плазминогена РАІ-1 (-675 4G/5G), метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т), а также уровня гомоцистеина в вероятности развития тромбозов у больных истинной полицитемией. Предложены новые факторы риска течения истинной полицитемии: спленомегалия, эритроцитоз, лейкоцитоз, полиморфизм генов фактора V (Лейденская мутация), метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и уровень гомоцистеина, аллельная нагрузка JAK2V617F, определяющие вероятность ответа на лечение, риск тромботических осложнений, общую выживаемость и частоту развития постполицитемического миелофиброза. Разработан усовершенствованный алгоритм определения прогноза ответа на лечение, общей выживаемости, рисков тромботических осложнений и вероятности развития постполицитемического миелофиброза на основе клинических и молекулярно-генетических проявлений истинной полицитемии.
Практическая значимость работы
Выявлены конкретные клинические и молекулярно-генетические факторы, оказывающие влияние на течение истинной полицитемии (развитие осложнений, ответ на проводимую терапию, исход заболевания, выживаемость больных). Определено влияние клинико-гематологических и молекулярно-генетических особенностей в дебюте заболевания на течение истинной полицитемии:
эритроцитоза и спленомегалии на частоту развития постполицитемического миелофиброза;
лейкоцитоза - на общую выживаемость;
спленомегалии и уровня аллельной нагрузки JAK2V617F - на результаты терапии.
Установлено, что аллельный полиморфизм 1691А гена фактора V, 677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и уровень гомоцистеина ассоциированы с высоким риском тромботических осложнений у больных истинной полицитемией.
Определены факторы неблагоприятного прогноза, на основе которых разработан алгоритм, позволяющий выделить в дебюте заболевания группу больных истинной полицитемией высокого риска.
Методология и методы исследования
В работе использованы клинико-лабораторные, морфологические, цитогенетические, молекулярно-генетические и статистические методы исследования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Эритроцитоз и спленомегалия в дебюте заболевания ассоциированы с развитием постполицитемического миелофиброза при истинной полицитемии. У больных истинной полицитемией с лейкоцитозом >11х109/л общая выживаемость ниже, чем у больных с уровнем лейкоцитов <11х109/л в дебюте заболевания.
-
Аллельная нагрузка JAK2V617F более 50% в дебюте заболевания связана с меньшей эффективностью терапии истинной полицитемии.
3. Аллельный вариант 1691A гена фактора V, 677Т гена MTHFR
(метилентетрагидрофолат редуктазы) и гипергомоцистеинемия чаще встречаются у больных
истинной полицитемией с тромботическими осложнениями по сравнению с больными, у
которых течение заболевания не осложнено тромбозами.
4. Больные истинной полицитемией, отличающиеся в дебюте заболевания одним из
следующих признаков: содержание лейкоцитов более 11,0х109/л, эритроцитоз более 7,3х1012/л,
уровень аллельной нагрузки JAK2V617F более 50%, наличие протромботического
полиморфизма генов фактора V (Лейден), метилентетрагидрофолат редуказы,
гипергомоцистеинемией, могут быть отнесены к группе высокого риска по ответу на лечение,
частоте развития тромботических осложнений и постполицитемического миелофиброза, общей
выживаемости.
Степень достоверности, публикации и апробация диссертации
Степень достоверности обусловлена проведением достаточным числом клинических наблюдений (216 пациентов), использованием современных и информативных методов исследования, адекватной статистической обработкой полученных результатов.
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из которых – 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.
Материалы диссертации были представлены на Научном совещании Европейского
общества по борьбе с лейкозами (ELN Frontiers, Берлин, Германия, 2014), 57-ом Ежегодном
Собрании Американского Общества Гематологов (57th American Society of Hematology Annual
Meeting, Орландо, США, 2015), 20-ом Конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации
(20th Congress of European Hematology Association, Вена, Австрия, 2015), Академии по истинной
полицитемии (Москва, 2015), совещании «Общие вопросы гематологии» (Санкт-Петербург,
2015), III Конгрессе Гематологов России (Москва, 2016), Мемориальной научно-практической
конференции памяти профессора К.М. Абдулкадырова «Миелопролиферативные
новообразования» (Санкт-Петербург, 2016), Юбилейной научной конференции «Кафедра факультетской терапии: сохраняя традиции Боткинской школы» (Санкт-Петербург, 2016), 58-ом Ежегодном Собрании Американского Общества Гематологов (58th American Society of Hematology Annual Meeting, Сан Диего, США, 2016).
Личный вклад автора
Автором лично выполнены: анализ источников литературы, планирование
диссертационного исследования, сбор анамнеза, обследование, установление диагноза, назначение терапии и последующий мониторинг лечения пациентов.
Также проведено выполнение трепанобиопсий, участие в проведении и интерпретации результатов молекулярно-генетических исследований.
Диссертантом лично проведены создание базы данных, последующий статистический анализ, обобщение и интерпретация полученных результатов исследования, подготовка к публикации тезисов и статей по теме работы. Диссертант самостоятельно представлял результаты исследования в печатных публикациях, выступлениях на научных конференциях.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, описания методов и характеристики пациентов, результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография содержит 120 источников литературы. Работа включает 24 рисунка и 13 таблиц.
Диагностика истинной полицитемии
Патологическая пролиферативная активность в системе кроветворения является основой клинической картины при ИП.
Наиболее значимыми симптомами являются клинические проявления, характерные для миелопролиферативных новообразований. Одним из таких симптомов является кожный зуд, который наблюдается у значительной части больных и является характерным признаком ИП [52]. Зуд усиливается после купания в теплой воде. Предполагается, что это связано с высвобождением гистамина, серотонина и простагландинов [51, 86, 98]. Кожный зуд при ИП хуже всего поддается коррекции, даже несмотря на лекарственную терапию [91].
Такие симптомы как головная боль, нарушение концентрации внимания, головокружение, слабость являются проявлением нарушений со стороны микроциркуляторного русла.
Расширение подкожных вен и изменения цвета кожи придают больным ИП характерный внешний вид плеторы (полнокровия). Кожа имеет красно-вишнёвый цвет, особенно выраженный на открытых частях тела – на лице, шее, кистях [7].
Не менее значимыми клиническими проявлениями ИП являются повышение артериального давления, эритромелалгии, боли в суставах, нижних конечностях, язвы в двенадцатиперстной кишке и желудке [3].
Важными и значимыми проявлениями ИП являются тромбозы и кровотечения. Тромботические эпизоды – это одно из наиболее тяжелых клинических проявлений ИП, которое обусловливает тяжесть дебюта и течения заболевания.
Наряду с тромбообразованием при ИП у 1,7-20% больных могут наблюдаться кровотечения из дёсен и расширенных вен пищевода. Основой патогенеза кровотечений при ИП являются нарушения структуры и функции тромбоцитов в сочетании с приобретенным вторичным синдромом Виллебранда [25]. От 3,1 до 11% летальных исходов при ИП могут быть связаны с геморрагическим синдромом [1]. Также при ИП отмечается тяжесть в левом подреберье, быстрое насыщение после еды, обусловленное спленомегалией.
Несмотря на кажущуюся благополучность течения, следует отметить, что клинические проявления ИП могут развиваться вне зависимости от гематологических показателей, длительности заболевания и проведения миелосупрессивной терапии [55]. Они могут быть достаточно выражены при постановке диагноза, и не отличаются от таковых при первичном миелофиброзе (ПМФ), что приводит к значимому ухудшению качества жизни больных [33, 75, 87]. Дебют заболевания характеризуется повышением количества эритроцитов и уровня гемоглобина при нормальных уровнях лейкоцитов и тромбоцитов. Повышение количества лейкоцитов за счет нейтрофилов с постепенно нарастающим сдвигом влево, нарастание тромбоцитоза и замедление скорости оседания эритроцитов (СОЭ) происходит в последующем. Появление в периферической крови незрелых клеток гранулоцитарного ряда, эритробластов, и выявление при иммунофенотипировании CD34-положительных клеток свидетельствует о развитии очагов экстрамедуллярного кроветворения. Картина костного мозга в начале болезни отличается изменением соотношения деятельного и жирового костного мозга в сторону расширения всех ростков миелоидного кроветворения, в последующем тотальной трехростковой гиперплазией – панмиелозом. Развитие ретикулинового и коллагенового фиброза костного мозга говорит о переходе заболевания в стадию постполицитемического миелофиброза [2, 3].
При ИП не выявлено специфических цитогенетических маркеров, хромосомные аномалии выявляются у небольшой части больных [14]. При переходе ИП в стадию постполицитемического миелофиброза частота аберраций кариотипа увеличивается, что может быть в том числе связано и с лейкозогенным эффектом длительного воздействия цитостатиков [13].
В настоящее время уже известно о молекулярно-генетических маркерах высокоспецифичных для ИП. Мутация JAK2V617F выявляется у 95% больных ИП [60, 102], значительно реже (4%) присутствуют мутации в 12 экзоне гена JAK2 [82, 89].
Неотъемлемым методом диагностики МПН является гистологическая оценка степени фиброза в костном мозге по стандартной шкале Европейского консенсуса патоморфологов по оценке клеточности и фиброза костного мозга [107]. Важное отличие хронической фазы ИП от постполицитемического миелофиброза и ПМФ это то, что степень фиброза при ИП не может быть более MF-1. Несмотря на достижения молекулярной генетики в диагностике ИП, а также стандартные методы лечения ИП, совокупное бремя заболевания, складывающееся из симптоматики, тромботических осложнений и риска трансформации, приводит к снижению качества и продолжительности жизни больных [97]. Основной перспективой улучшения результатов лечения ИП в настоящее время является таргетная терапия. Однако, с учетом высокой стоимости таргетных препаратов, и вследствие этого малодоступности их в широкой практике, необходимо выделение определенной категории пациентов, которые нуждаются в данном виде терапии в первую очередь и по жизненным показаниям.
В отечественной гематологии традиционно выделяются четыре стадии развития ИП [2, 3], связанные с клиническим течением заболевания. I стадия – начальная, характеризующаяся гиперплазией костного мозга без наличия любых признаков фиброза. При этом в периферической крови наблюдается преимущественно повышение массы циркулирующих эритроцитов (рисунок 1.3). IIА стадия – эритремическая (развернутая) без миелоидной метаплазии селезенки. В периферической крови помимо эритроцитоза наблюдаются значимый нейтрофилёз, иногда со сдвигом лейкоформулы до единичных миелоцитов, базофилия, тромбоцитоз. В костном мозге тотальная гиперплазия всех трех миелоидных ростков с выраженным мегакариоцитозом, возможно наличие начального ретикулинового фиброза. IIБ стадия - эритремическая (развернутая) с миелоидной метаплазией селезенки. В этой стадии в печени и селезенке появляются очаги экстрамедуллярного кроветворения, происходит их прогрессивное увеличение на фоне стабильных показателей периферической крови или даже некоторого снижения количества эритроцитов и тромбоцитов в результате вторичного гиперспленизма. В лейкоцитарной формуле постепенно увеличивается сдвиг влево и нарастает доля незрелых клеток гранулоцитарного ряда. В костном мозге нарастает фиброз до выраженного ретикулинового и очагов коллагенового фиброза.
Роль генетических особенностей системы гемостаза в развитии тромбозов при истинной полицитемии
Первоначально была определена выборка больных ИП. Критериями постановки диагноза рассматривались критерии ВОЗ 2016 года [16]. Выборка состояла из 216 больных, в дальнейшем группы больных составлялись по тем или иным признакам, в зависимости от поставленных задач.
Для решения задач, поставленных в исследовании, были проведены следующие этапы.
Этап 1. В группах больных, разделенных по видам лечения, ответу на проводимую терапию, исходу во вторичный миелофиброз были проанализированы клинические (лейкоцитоз, тромбоцитоз, эритроцитоз, гематокрит, спленомегалия) и молекулярно-генетические (аллельная нагрузка JAK2V617F) параметры. Были построены графики выживаемости и исследовано влияние на выживаемость вышеуказанных параметров.
Этап 2. Выделена группа из 146 больных, у которых в дебюте заболевания была исследована аллельная нагрузка мутантного гена JAK2V617F. В последующем данная группа разделялась на подгруппы в зависимости от ответа на проводимую терапию, исхода в постполицитемический миелофиброз, наличия тромботических событий в течении болезни и вида тромбозов.
Этап 3. Определена выборка больных, обследованных на наличие протромбогенных вариантов генов FV (Лейденская мутация), протромбина, метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), фибриногена (FI), ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), тромбоцитарного рецептора фибриногена (GPIIIA). Проанализирована общая частота наличия генов наследственной тромбофилии и статистическая значимость различий их частот в группах больных ИП с тромбозами в анамнезе (ИПТр+) и без таковых (ИПТр-), а также было проведено сравнение с контрольной группой (КГ). Группа больных с тромбозами была также разделена на 2 группы (с артериальными (ИПТрА) и венозными тромбозами (ИПТрВ), произведено сравнение этих групп с КГ. У 36 больных исследован уровень гомоцистеина. Контрольную группу составили 228 индивидов, соответствующих по полу и возрасту исследуемому контингенту больных, не имевших в анамнезе тромботических эпизодов и проживающих в Северо-Западном регионе России. Среди них – 198 кадровых доноров крови и 30 сотрудников РосНИИГТ.
Этап 4. Обобщение полученных результатов. Были выделены клинические и молекулярно-генетические факторы, влияющие на течение ИП, которые могут быть рассмотрены в качестве неблагоприятных факторов прогноза. Были исследованы пороговые уровни статистически значимых показателей. Разработан алгоритм определения прогноза ответа на лечение, общей выживаемости, рисков тромботических осложнений и вероятности развития постполицитемического миелофиброза на основе клинических и молекулярно-генетических проявлений ИП.
Всего в исследование включено 216 больных. Диагноз ИП был установлен в период с 1980 по 2016 гг. Мужчин 95, женщин 121. Медиана возраста составила 61 год (мин – макс, 25 – 86 лет). Медиана периода наблюдения 5лет (мин – макс, 0,13 – 35 лет). Основными клиническими симптомами в дебюте заболевания были следующие: плетора - 183 (84,7%), головные боли – 105 (48,6%), слабость – 67 (31%), кожный зуд – 46 (21,3%), боли в суставах – 12 (5,6%), эритромелалгии – 8 (3,4%). У 23 (10,6%) больных в дебюте заболевания не отмечалось никаких клинических проявлений. Частота встречаемости клинических симптомов представлена в таблице 2.1.
Показатели клинического исследования периферической крови на момент установления диагноза представлены в таблице 2.2. Таблица 2.1 – Частота встречаемости клинических симптомов в дебюте истинной
При гистологическом исследовании костного мозга в дебюте заболевания первая степень ретикулинового фиброза была выявлена у 1 (0,46%) пациента, вторая степень у 2 (0,93%) больных, у остальных больных признаков фиброза не наблюдалось.
Мутация JAK2V617F выявлена у 215 больных, в 12 экзоне гена JAK2 у 1 (0,46%) больного. Аллельная нагрузка JAK2V617F исследована у 146 больных, среднее значение составило – 58,2% (5,27%– 249,96%).
Общее число пациентов с тромботическими осложнениями составило 51 (24,1%), из них артериальные тромбозы наблюдались у 45 (20,8%) больных, венозные у 11 (5,1%) пациентов. У 14 (6,5%) больных отмечались повторные эпизоды тромбозов. Острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) произошло у 27 пациентов, острый инфаркт миокарда (ОИМ) у 18 больных, сочетание ОНМК и ОИМ наблюдалось в 2 случаях. У 1 пациента имел место тромбоз пальцевых артерий второго пальца кисти, у 1 больной - окклюзия левой подошвенной артерии и у 3 пациентов тромбозы в системе портальной вены.
Больные получали следующие виды терапии: эритроцитаферез (монотерапия) – 21 больной (9,7%), гидроксикарбамид – 174 (80,6%) пациента, препараты интерферона альфа – 3 (1,4%) больных, в 18 (8,3%) случаях использовалась сочетанная терапия (гидроксикарбамид + интерферон альфа).
Ответ на терапию оценивали согласно критериям ELN 2014 [78]. Полный клинико-гематологический (ПГО) ответ был достигнут у 33 (15,3%) больных, частичный клинико-гематологический ответ (ЧГО) у 118 (54,6%) пациентов, в 65 (30,1%) случаях ответа на лечение не было (отсутствие ответа, НО).
Исход в постполицицитемический миелофиброз был констатирован у 23 больных (10,6%). Медиана периода наблюдения до исхода в фиброз составила 12,8 (6,4 – 30,1) лет. У 2 больных наступила бластная трансформация заболевания (в том числе в одном случае бластный криз развился после исхода в миелофиброз).
Метод количественного определения аллельной нагрузки JAK2V617F
Для выявления факторов, влияющих на результаты проводимой терапии, больные были разделены на группы в зависимости от ответа на лечение согласно критериям ELN 2014 [20]: группа 1 – с полным гематологическим ответом, группа 2 – с частичным гематологическим ответом и группа 3 – с отсутствием ответа на проводимую терапию. В этих группах были изучены показатели клинического анализа крови, возраст, наличие спленомегалии.
Больные получали следующие виды терапии: 1 – монотерапия гидроксикарбамидом 174 (80,6%) больных, 2 – монотерапия препаратами -интерферона 3 (1,4%) пациентов, 3 – монотерапия методами удаления избыточной клеточной массы (эритроцитаферез, гемоэксфузии) 21 (9,7%) больной, 4 -сочетанная терапия гидроксикарбамидом и препаратами -интерферона 18 (8,3%) пациентов. Средняя суточная дозировка гидроксикарбамида составила 0,8 г в сутки, -интерферона – 9 млн. МЕ в сутки. Больным, получающим терапию гидроксикарбамидом и препаратами интерферона, при необходимости также проводили процедуры эритроцитафереза (гемоэксфузий), антиагрегантную терапию получали почти все больные (98%).
При оценке результатов терапии согласно рекомендациям ELN (2014) полного клинико-гематологического ответа (ПГО) достигли 33 (15,3%) больных, частичного клинико-гематологического ответа – 119 (54,6%) пациентов, отсутствие ответа (НО) констатировано у 64 (30,1%) больных.
Статистически значимых различий в группах по возрасту, количеству лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, гематокрита в дебюте заболевания получено не было.
Показатель, среднее значение (95% д.и.) Полный ответ (n=33) Частичный ответ (n=119) Нет ответа (n=64) Возраст (лет) 63,6 60,0 57,7 Гемоглобин,г/л 183 (177 - 190) 189 (185 - 193) 185 (181 - 190) Эритроциты, х1012/л 6,91 (6,6 - 7,2) 7,21 (7 - 7,4) 7,3 (7,1 - 7,5) Гематокрит, % 56,9 (54,7 - 59) 58,8 (57,7 - 60) 58,1 (56,7 - 59,5) Лейкоциты, х109/л 12,5 (10,9 -14,1) 11,3 (10,4 - 12,2) 12,5 (11,2 - 13,9) Тромбоциты, х109/л 599 (508 - 692) 503 (459 - 547) 567 (500 - 635) Спленомегалия (кол-во больных в группе, %) 5 (15,2%) 38 (31,9%) 34 (53,1%) Статистически значимые различия в группах были получены по наличию спленомегалии в дебюте заболевания. В группе больных с отсутствием ответа на терапию спленомегалия встречалась достоверно чаще (53,1%) чем в группе с полным гематологическим ответом (15,2%) (р 0,0004). Между группами с полным гематологическим ответом и частичным гематологическим ответом получены статистические тенденции по наличию спленомегалии (р=0,08). В группе больных с частичным гематологическим ответом спленомегалия в дебюте заболевания встречалась чаще (31,9%), чем в группе больных с полным гематологическим ответом (15,2%).
Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие спленомегалии в дебюте заболевания может быть рассмотрено как неблагоприятный прогностический фактор при прогнозировании ответа на проводимую терапию. Частота встречаемости спленомегалии в группах больных в зависимости от ответа на терапию представлена на рисунке 3.6. Рисунок 3.6 – Наличие спленомегалии в дебюте заболевания в группах больных истинной полицитемией в зависимости от ответа на терапию. Обозначения на рисунке: НО – отсутствие ответа, ЧГО – частичный клинико-гематологический ответ, ПГО – полный клинико-гематологический ответ
В качестве примера приводим клиническое наблюдение №1. Больная Т., 1940 г.р., в декабре 2002 г. (в возрасте 62 лет) установлен диагноз истинной полицитемии в соответствии с критериями ВОЗ.
В дебюте заболевания: 1) клинический анализ крови: гемоглобин – 232 г/л, эритроциты – 7,7х109/л, лейкоциты – 7,2х109/л, тромбоциты – 629x109/л; 2) селезенка пальпаторно увеличена на 1 см.; 3) гистологическое исследование трепанобиоптата – трехростковая гиперплазия, признаков миелофиброза нет.
С марта 2003 г. по октябрь 2006 г. терапия антиагрегантами (ацетилсалициловая кислота 100 мг/сут), эритроцитаферез 3 – 7 процедур в год, милеран 2 мг х 2 раза в неделю. На фоне терапии сохранялась потребность в эритроцитаферезе.
С октября 2006 г. больная переведена на терапию гидроксикарбамидом в 500-1000 мг/сутки. Максимально переносимая дозировка – 1000 мг/сутки. При попытке увеличить дозу гидроксикарбамида более чем 1000 мг, через сутки возникала непереносимость, проявляющаяся усилением слабости, появлением высыпаний на лице и шее, стоматитом. На фоне терапии в течении 6 лет (октябрь 2006г. – март 2012г.) уровень гематокрита от 0,41 до 0,71, гемоглобина от 130 до 240 г/л, потребность в эритроцитаферезе 3 – 4 процедуры в год.
При обследовании в марте 2012 г. выявлена мутация JAK2V617F. С марта 2012 г. по сентябрь 2013 г. – отсутствие потребности в эритроцитаферезе, стабильный уровень гемоглобина. При контрольном обследовании в сентябре 2013 г.: - клинический анализ крови: гемоглобин – 109 г/л, эритроциты – 3,6х1012/л, тромбоциты – 462х109/л, лейкоциты – 5.8х109/л, миелобласты – 8%, промиелоциты – 1%, миелоциты – 4%, юные – 7%, палочкоядерные – 2%, сегментоядерные – 50%, базофилы – 4%, лимфоциты – 20%, моноциты – 4%. - спленомегалия (увеличение на 4 см из-под реберной дуги); - появление симптомов опухолевой интоксикации; - гистологическое исследование костного мозга – клеточность костного мозга повышена, жировая ткань практически отсутствует. Выявляется утолщение костных балок, увеличение в лакунах мегакариоцитов, гранулоцитов, обнаруживаются эритроидные клетки. Отмечается усиление стромального рисунка, в части лакун отложения коллагена. При импрегнации серебром – диффузная сеть ретикулиновых волокон с их утолщением. Миелофиброз, МФ-3; аллельная нагрузка JAK2V617F – 82%.
Продолжена терапия гидроксикарбамидом в дозе 1000 мг/сутки. При обследовании в сентябре 2014 г.: - сохранение симптомов опухолевой интоксикации; - клинический анализ крови: гемоглобин – 116 г/л, эритроциты – 3,6х1012/л, тромбоциты – 447х109/л, лейкоциты – 6.5х109/л, миелобласты – 7%; спленомегалия (увеличение на 6 см из-под реберной дуги). С ноября 2014 г. начата таргетная терапия ингибиторами янускиназы руксолитинибом в дозе 20 мг х 2 раза в сутки.
На фоне терапии произошло быстрое исчезновение симптомов опухолевой интоксикации, нормализация уровня гемоглобина, снижение уровня аллельной нагрузки JAK2V617F. Больная получает терапию более двух лет, переносит удовлетворительно без клинически значимых побочных эффектов.
Показатели уровней гемоглобина, лейкоцитов, тромбоцитов и аллельной нагрузки JAK2V617F в динамике на фоне лечения руксолитинибом в течении 2х лет представлены на рисунках 3.7, 3.8, 3.9, 3.10.
Оценка влияния клинических и молекулярно-генетических факторов на результаты терапии
Одной из задач нашей работы было выявление взаимосвязи между присутствием протромботических вариантов аллельных полиморфизмов некоторых генов (мутации в гене FV (Лейденская мутация), протромбина, полиморфизм нуклеотидов генов метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), фибриногена (FI), ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), тромбоцитарного рецептора фибриногена (GPIIIа), уровнем гомоцистеина и тромботическими осложнениями у больных ИП.
По данным исследования M. Tevet et al., в котором участвовали пациенты с ИП, ЭТ и ПМФ, частота гетерозиготного носительства мутации гена FV составила 8,06%, а гетерозиготное носительство мутации гена протромбина - 2,3% [104]. В нашем исследовании она составила 0,86% и 1,72% соответственно. Мы подтвердили значение мутаций в гене FV и протромбина в развитии тромботических осложнений при ИП. Так, нами были получены статистические тенденции (р=0,13), демонстрирующие большую частоту встречаемости мутаций в генах FV и протромбина у больных ИП с тромбозами, по сравнению с группой больных ИП без тромбозов. Кроме того, частота встречаемости мутации гена FV (Лейденской мутации) была выше у больных ИП с венозными тромбозами по сравнению с КГ (р=0,06), группой больных с артериальными тромбозами (р=0,06) и группой больных ИП без тромботических осложнений (р=0,02). Полученные данные подтверждают общеизвестный факт значения Лейденской мутации в развитии венозных тромбозов, и диктуют необходимость обследования больных ИП на наличие данной мутации, не только при наличии венозных тромбозов, но и в отсутствии таковых в дебюте ИП. Своевременная профилактика тромботических осложнений у таких больных поможет значительно уменьшить число венозных тромбозов у больных ИП. Эти данные также подтверждаются описанным в диссертационной работе клиническим случаем, который является классической демонстрацией сочетанного влияния Лейденской мутации и особенностей патогенеза ИП на развитие венозных тромбозов.
Частота встречаемости мутации в гене протромбина имеет немаловажное значение в развитии тромботических осложнений. По данным нашего исследования частота встречаемости данной мутации имела тенденцию к повышению у больных с артериальными тромбозами по сравнению с группой больных без тромбозов (р=0,08). Небольшое количество наблюдений в нашем исследовании не позволило преодолеть порог статистической значимости, однако факт того, что у обоих больных с выявленным носительством гетерозиготной мутации в гене протромбина имели место артериальные тромбозы, свидетельствует о важной роли данной мутации в развитии тромботических осложнений у больных ИП.
В отдельных европейских исследованиях было также показано, что частота встречаемости этих классических маркеров наследственной тромбофилии (Лейденская мутация и мутация в гене протромбина) у пациентов с ИП не превышает таковую в общей популяции, но при этом увеличивает риск тромботических событий [94]. Российские данные о диагностике и частоте встречаемости наследственных факторов риска тромбозов у больных ИП носят описательный характер. Они не показывают значимых отличий от общей популяции, а также не выявляют взаимосвязи между наследственной тромбофилией и тромботическими событиями у больных ИП [6]. Нам же в своем исследовании удалось выявить эту взаимосвязь и показать важность обследования больных на наличие маркеров наследственной тромбофилии.
Доля гомо- и гетерозигот полиморфизмов генов MTHFR (60,3%) и FI (49,1%) в исследуемой нами группе пациентов с ИП превысила таковую в контрольной группе. Сочетание мутаций генов MTHFR и FI может увеличивать риск тромботических осложнений [5]. В нашей группе больных с ИП такое сочетание было выявлено у 32% больных.
То, что были получены статистически значимые различия по частоте встречаемости полиморфизма в гене MTHFR при сравнении общей группы больных ИП с КГ (р=0,03), группы больных ИП с тромбозами и КГ (р=0,03), и преимущественно артериальными тромбозами с КГ (р=0,007) свидетельствует о необходимости исследования данного полиморфизма у больных ИП. Обращает также на себя внимание то, что у 3 из 4 пациентов с сочетанием гомозиготного состояния полиморфизма гена MTHFR и гетерозиготного состояния полиморфизма гена FI имели место артериальные тромбозы. Кроме того, интересным является факт доказательства значимой роли не только гомозиготного состояния протромботического варианта гена MTHFR, но и гетерозиготного варианта. Вероятно, это связано с тем, что влияние на развитие тромбозов осуществляется за счет сочетанного воздействия генетических особенностей системы гемостаза и патогенеза ИП. Носительство полиморфизма гена PAI-1 в исследуемой группе составило 82,8%, что не отличалось от КГ.
Частота встречаемости полиморфизмов в гене GPIIIа в группе больных ИП составила 23,2%, что оказалось значимо ниже, чем в контрольной группе (p=0,04). Данные изменения вероятно требуют дальнейшего исследования для оценки их клинической значимости. Возможно, для полноценной интерпретации данных изменений потребуется исследование показателей системы гемостаза.
Несмотря на то, что отличия в сравнении с контрольной группой по частоте встречаемости получены не по всем исследованным полиморфизмам, любое носительство мутаций, ассоциированных с тромбофилическим статусом, у больных ИП требует пристального внимания. Это объясняется тем, что при данном заболевании риск тромботических осложнений складывается из множества факторов (особенности патогенеза ИП, индивидуальные характеристики пациента, сопутствующая сердечно-сосудистая патология).