Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки 9
1.2 Применение мезенхимных стромальных клеток 11
1.3 Активирование мезенхимных стромальных клеток. Влияние интерферона гамма 18
1.4 Популяции T-лимфоцитов 20
2. Материалы и методы 26
2.1 Получение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток 26
2.2 Обработка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток интерфероном гамма 28
2.3 Получение мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров 28
2.4 Сокультивирование лимфоцитов и мезенхимных стромальных клеток 29
2.5 Иммунофенотипирование с помощью проточной цитофлуориметрии 30
2.6 Статистическая обработка результатов 38
3. Результаты и обсуждение 39
3.1 Изменение экспрессии антигенов на поверхности мезенхимных стромальных клеток после взаимодействия с лимфоцитами 39
3.2. Изменение субпопуляций лимфоцитов после взаимодействия с мезенхимными стромальными клетками 56
3.3. Влияние обработки интерфероном на иммунофенотип мезенхимных стромальных клеток 72
3.4. Изменение субпопуляций лимфоцитов после взаимодействия с обработанными интерфероном мезенхимными стромальными клетками 77
3.5 Сравнение иммунофенотипа мезенхимных стромальных клеток после взаимодействия с аллогенными и аутологичными лимфоцитами 92
3.6 Различное влияние мезенхимных стромальных клеток на субпопуляции лимфоцитов 96
Заключение 111
Выводы 115
Список сокращений и условных обозначений 116
Список литературы 118
- Применение мезенхимных стромальных клеток
- Иммунофенотипирование с помощью проточной цитофлуориметрии
- Изменение субпопуляций лимфоцитов после взаимодействия с мезенхимными стромальными клетками
- Различное влияние мезенхимных стромальных клеток на субпопуляции лимфоцитов
Применение мезенхимных стромальных клеток
Благодаря свойству МСК дифференцироваться в различные клетки мезодермального ряда, с момента их обнаружения проводятся исследования по применению МСК в регенеративной медицине.
Введение МСК, выделенных из КМ, проводилось во многих клинических исследованиях при различных заболеваниях костной, хрящевой, сердечнососудистой тканей, поражении нервной ткани, также при ожогах, ранах и аутоиммунных заболеваниях [114].
При локальном введении МСК пациентам с повреждениями костной и хрящевой тканей более активно происходило восстановление тканей, а также снижался болевой синдром [23; 71]. При ишемической кардиомиопатии введение МСК в миокард приводило к восстановлению функций сердца и улучшению качества жизни пациентов [66; 70; 178]. Также было показано, что введение МСК при ишемии конечностей индуцировало ангиогенез [167].
Введение МСК пациентам с рассеянным склерозом приводило к улучшению показателей различных систем оценки заболевания [36; 82]. Также введение МСК улучшало состояние пациентов с болезнью Паркинсона [170] и инсультом [147].
Но наибольшее количество работ посвящено применению МСК, основанного на их иммуномодулирующих свойствах, при аутоиммунных заболеваниях и после трансплантации аллогенного КМ для предотвращения и лечения острой реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) [145; 173; 189].
Иммунологические осложнения при трансплантации в первую очередь вызваны клеточно-опосредованным антигенспецифичным иммунным ответом на аллотрансплантат, что приводит к его отторжению. Дендритные клетки – это антиген-представляющие клетки (АПК). Они осуществляют эндоцитоз, процессируют аллоантигены [109] и после созревания мигрируют во вторичные лимфоидные органы (лимфатические узлы или селезенку), где активируют наивные Т-клетки [110]. Активация антиген-специфичных Т-лимфоцитов дендритными клетками инициирует иммунный ответ против трансплантата. Во время стадии сенсибилизации Т-клеточные рецепторы (ТКР) на CD4+ и CD8+ клетках реципиента распознают чужеродные донорские антигены, представленные в молекулах MHC (major histocompatibility complex – главный комплекс гистосовместимости) на зрелых ДК с помощью трёх различных путей: прямого, непрямого или полупрямого пути аллораспознавания. Прямой путь ассоциирован с острыми иммунными осложнениями, а непрямой – с хроническими [57].
Для активации наивных T-клеток кроме презентации аллоантигена, необходимо получение костимуляторного сигнала и взаимодействие с цитокинами. Зрелые ДК экпрессируют костимуляторные молекулы семейства B7 (CD80, CD86) и CD40, взаимодействующие с CD28 и CD40-лигандом (CD154) на Т-клетках соответственно. Активация ТКР без костимуляторных сигналов приводит к состоянию Т-клеточной невосприимчивости, известному как Т-клеточная анергия [148].
При взаимодействии между ДК и Т-лимфоцитами на T-клетках увеличивается экспрессия CD69 - раннего маркера активации и CD25 - рецептора к интерлейкину-2 (ИЛ-2) [110]. После активации Т-лимфоциты пролиферируют и дифференцируются в донор-реактивные эффекторные и Т-клетки памяти. Незрелые ДК, которые не обладают костимуляторными сигналами, неэффективны в отношении Т-клеточного иммунного ответа, несмотря на взаимодействие антиген-MHC.
Во время эффекторной фазы клеточно-опосредованного отторжения трансплантата активированные донор-реактивные эффекторные CD4+ или CD8+ T-клетки инфильтрируют трансплантат, приводя к разрушению тканей.
В случае трансплантации аллогенного КМ наиболее частым осложнением является развитие РТПХ – иммунной реакции, при которой Т-клетки донора атакуют ткани хозяина (кожу, кишечник и др.) [67]. В развитии РТПХ участвуют те же механизмы, что и при отторжении трансплантата.
Системные режимы иммуносупрессивной терапии, направленные на подавление T-клеточного иммунитета, достаточно эффективны, но не обеспечивают антиген-специфичной супрессии иммунного ответа. Использование этих неспецифических препаратов в течение всей жизни приводит к пагубным последствиям, таким как развитие оппортунистических инфекций и токсичности для органов [94].
МСК могут оказывать иммуномодуляторное воздействие на различные клетки: натуральные киллеры (NK-клетки), макрофаги, B-клетки, T-клетки и дендритные клетки, что широко описано в литературе [9; 114; 137; 158]. Воздействие на эти иммунные клетки, участвующие в развитии аллоиммунных реакций, может ингибировать провоспалительный иммунный ответ.
T-клетки играют ключевую роль в развитии аллоиммунных реакций. Воздействие МСК на T-лимфоциты можно разделить на 2 типа: прямое и непрямое. Прямое воздействие МСК на T-клетки также бывает двух типов: за счёт секреции МСК различных растворимых факторов, влияющих на T-клетки, или же непосредственного взаимодействия МСК и лимфоцитов. МСК секретируют иммуносупрессорные цитокины, влияющие на T-лимфоциты: трансформирующий ростовой фактор (ТРФ-) [123], фактор роста гепатоцитов (ФРГ) [13], простогландин E2 (ПГЕ2) [162], растворимые молекулы человеческого лейкоцитарного антигена G5 (HLA-G5) [152], ИЛ-10 [172], гемооксигеназу-1 (ГО-1) [97; 188], также как и индолеамин 2,3-диоксигеназу (ИДО-1) [53]. ТРФ- и ПГЕ2 приводят к снижению возможности T-клеток к ИЛ-2-зависимой активации [22; 34; 73], а ФРГ приводит к угнетению цитотоксических свойств CD8+ Т-лимфоцитов [92]. HLA-G5 влияет на CD4+, CD8+ клетки, воздействуя на цитотоксические свойства CD8+ клеток и переключая иммунологический ответ CD4+ клеток на противовоспалительный [12]. Взаимодействие с ИЛ-10 приводит к снижению продукции ИЛ-2 CD4+ клетками, ингибирования их активации [171]. ГО-1, также как и HLA-G5, воздействует на соотношение T-хэлперов первого и второго типов, изменяя его в противовоспалительном направлении [150]. ИДО-1 оказывает подавляющее воздействие на T-клеточный иммунитет [53; 159].
В модуляции МСК иммунного ответа также участвуют секретируемые матричные металлопротеиназы (ММП), которые ингибируют Т-клеточный иммунный ответ, снижая поверхностную экспрессию ранних Т-клеточных маркеров активации CD25, CD38 и CD69 [20]. Важная роль ММП в иммуносупрессии была показана в работе Ding и соавторов, в которой введение ингибиторов ММП in vivo на модели трансплантации аллогенного КМ подавляло иммуносупрессивные свойства аутологичных МСК по отношению к аллореактивным T-клеткам [43]. Эти ингибиторные факторы, экспрессируемые МСК, являются решающими для ингибирования пролиферации, активации или дифференцировки T-клеток.
Непосредственное межклеточное взаимодействие МСК и T-клеток, приводящее к ингибированию активации T-лимфоцитов, происходит за счёт следующих молекулярных взаимодействий: связывания лиганда рецептора программируемой смерти (programmed death ligand-1, PD-L1) с рецептором программируемой смерти (programmed death-1, PD-1) [9; 183], CD200 с CD200-рецептором (CD200R) [116], FAS-L с FAS-R [5; 8], также в иммуносупрессии участвуют Толл-подобные рецепторы (ТПР) [127] и молекулы B7-H4 [181]. PD-L1 – это молекула, которая играет важную роль в установлении T-клеточной толерантности, ее рецептор (PD-1) экспрессирован на активированных T-клетках. Их взаимодействие приводит к подавлению излишней активации T-клеток [54]. Во многих исследованиях показано, что МСК могут экспрессировать, а также секретировать PD-L1 [9; 38; 183]. МСК также экспрессируют FAS-L (CD178), а все T-клетки, кроме наивных, экспрессируют FAS-R (CD95), что необходимо для осуществления апоптоза [103]. Экспрессия на поверхности МСК ТПР может воздействовать на регуляторные T-клетки [104]. Взаимодействие T-клеток с молекулой B7-H4 приводит к ингибированию их пролиферации и активации [156; 181]. Очевидно, что МСК обладают способностью к прямому ингибированию T-клеточного ответа различными способами, что объясняет эффективность их применения в различных моделях.
Иммунофенотипирование с помощью проточной цитофлуориметрии
Иммунофенотипическое исследование проводилось как для МСК, так и для лимфоцитов. Для иммунофенотипического исследования использовался проточный цитофлуориметр BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США). Для исследования МСК и лимфоцитов использовались различные настройки прибора в связи с отличиями в размере клеток и в уровне их аутофлуоресценции. Контроль качества работы цитометра и регулярную корректировку напряжений фотоумножителей осуществляли с помощью частиц “Cytometer Setup and Tracking beads” (Becton Dickinson, США). Настройку компенсаций между флуоресцентными сигналами различных флуорохромов проводили с помощью частиц “Comp Beads” (Becton Dickinson, США). Анализ полученных данных проводили с помощью программы BD FACS Diva (v6.1, Becton Dickinson, США), FlowJo (v7.6, FlowJo, LLC, США).
Для иммунофенотипирования МСК использовали моноклональные антитела (мАТ), меченные флуорохромными красителями, указанные в Таблице 2.2. Также для каждого из флуорохромов использовали соответствующий изотипический контроль. Все мАТ произведены Becton Dickinson, США, за исключением отмеченных , произведенных компанией BioLegend, США.
Сначала оценивали число клеток в исследуемом образце, далее, исходя из полученного значения, отбирали в пробирку 7-10 103 клеток, доводили объем образца до 100 мкл раствором CellWash (Becton Dickinson, США) и инкубировали с соответствующими мАТ в течение 15 минут в темноте при +4 С. Далее проводили цитометрический анализ. По каждому каналу флуоресценции оценивали среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ). Алгоритм гейтирования является общим для всех экспериментов и представлен на Рисунке 2.1. В первую очередь гейтировали единичные события (диаграмма SSC-W против SSC-H, гейт Single, Рисунок 2.1А), далее на основании высоких параметров прямого и бокового светорассеяния выделяли гомогенную популяцию МСК (диаграмма SSC-A против FSC-A, гейт MSC, Рисунок 2.1Б) – Для выбранной популяции клеток оценивали СИФ по каналам FITC, PE и APC.
При определении доли клеток, экспрессирующих анализируемый антиген, например, CD54, гейт для выделения положительной популяции выставляли на основании изотипического контроля (Рисунок 2.1В) и оставляли неизменным для окрашенных клеток (Рисунок 2.1Г).
В результате серии экспериментов подсчитывали СИФ, и для определения наличия экспрессии того или иного маркера его сравнивали с СИФ в опытах с изотипическими контролями.
При работе с культурами лимфоцитов важно учитывать то, что в процессе культивирования доля жизнеспособных клеток уменьшается, а в анализ должны быть включены только жизнеспособные клетки. Кроме того, при активации с помощью ФГА меняется морфология и размер лимфоцитов, в результате чего увеличиваются параметры прямого, бокового светорассеяния и аутофлуоресценция.
Для определения жизнеспособности лимфоцитов в культуре применялся ядерный краситель 7-аминоактиномицин D (7-AAD), связывающийся с молекулами ДНК в участках, богатыхгуанином и цитозином . Связывание клетки с 7-AAD свидетельствует о нарушении целостности ее мембраны. Поэтому клетки с флуоресцентным сигналом по 7-AAD в анализ не включались. Серия экспериментов с использованием красителя 7-AAD позволила проанализировать по параметрам FSC и SSC только жизнеспособные клетки.
На Рисунке 2.2 представлен анализ жизнеспособности клеток в культуре неактивированных лимфоцитов. На Рисунке 2.2А выделены 7-AAD – положительные события гейт 7-AAD+, на Рисунке 2.2Б можно наблюдать границу между 7-AAD положительными и 7-AAD отрицательными клетками. Таким образом, можно выставить гейт на диаграмме распределения FSC против SSC, позволяющий анализировать только жизнеспособные клетки.
Кроме того были определены параметры FSC и SSC для активированных лимфоцитов. Полученные данные применялись для дальнейшего анализа (Рисунок 2.2В).
Цитометрический анализ маркеров активации лимфоцитов производился с помощью моноклональных антител, указанных в Таблице 2.3.
Анализ маркеров активации производили в трёх пробирках: в первой определяли долю CD25+ и PD-1+ лимфоцитов, во второй – CD38+ и HLA-DR+ клеток, в третьей – CD69+ клеток. Для определения доли клеток, несущих искомый антиген, применяли следующий алгоритм гейтирования:
1) Выделение всех единичных событий в образце (Рисунок 2.3 А, гейт Single cells);
2) Выделение событий, соответствующих мононуклеарам по параметрам прямого и бокового светорассеяния (FSC, SSC, Рисунок 2.3 Б, гейт Mononuclear cells);
3) Выделение CD4- или CD8-положительных событий на графиках бокового светорассеяния против соответствующего канала флуоресценции (APC-Cy7 или PerCP-Cy5.5, в качестве примера рассмотрено гейтирование CD4+ клеток, Рисунок 2.3 В, гейт CD4+ cells) и последующего обратного их гейтирования по параметрам FSC и SSC (Рисунок 2.3 Г, гейт clear CD4+ cells);
4) Определение доли клеток с искомым иммунофенотипом, на основании внутренних контролей в образцах и FMO (fluorochrome minus one) метода:
4.1) Для неактивированных лимфоцитов определение доли CD4+CD25+CD127- регуляторных Т-клеток (гейт Treg, Рисунок 2.3 Д);
4.2) Для неактивированных лимфоцитов определение доли PD-1+ и HLA DR+ клеток как CD4+, так и CD8+ клеток (определение доли CD4+PD-1+ и CD4+HLA-DR+ клеток представлено на рисунке 2.3 Е, Ж);
4.3) Для активированных с помощью ФГА лимфоцитов определяли долю CD25+, PD-1+, CD38+, CD69+ и HLA-DR+ клеток как CD4+, так и CD8+.
Интересующий флуорохром анализировали на графике с боковым светорассеянием. На рисунке 2.3 З-М приведен пример анализа доли маркеров активации на ФГА-активированных лимфоцитах.
В результате цитометрического анализа для культур неактивированных лимфоцитов определяли долю CD25+CD127- CD4+ клеток – регуляторных Т 35 клеток, а также долю CD4+ и CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR и PD-1. Для культур лимфоцитов, активированных с помощью ФГА, определялась доля CD4+ и CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих CD25, CD38, CD69, HLA-DR и PD-1.
Изменение субпопуляций лимфоцитов после взаимодействия с мезенхимными стромальными клетками
Лимфоциты являются гетерогенной популяцией клеток крови. В организме лимфоциты находятся как в наивном состоянии, так и в более дифференцированных состояниях, таких как клетки памяти или эффекторные клетки. Дифференцировка лимфоцитов из наивного состояния происходит под действием аллогенных антигенов, представленных в молекулах комплекса MHC, с которыми лимфоциты взаимодействуют посредством T-клеточного рецептора.
Данная работа включает в себя исследование экспрессии антигенов CD95, CD28, CD197 и CD45RO, которые позволяют разделить T-клетки на различные стадии дифференцировки, включающие NV, SCM, CM, TM, EM и TE клетки [103]. Также определяли долю T-клеток, экспрессирующих маркеры активации T-лимфоцитов: CD25, CD69, CD38, PD-1 и HLA-DR. При анализе субпопуляций неактивированных лимфоцитов анализировали количество регуляторных T-клеток, имеющих иммунофенотип CD4+CD25+CD127-.
Субпопуляционный состав неактивированных лимфоцитов анализировали в динамике через 1, 2, 3 и 4 суток взаимодействия с МСК 13 доноров. В качестве контрольных использовали лимфоциты, культивированные без МСК.
Достоверные изменения были обнаружены для CD4+ наивных и эффекторных клеток памяти. Исследование доли наивных Т-клеток показало, что к четвертым суткам культивирования в контрольной культуре лимфоцитов на 30% снижается количество наивных CD4+ клеток (p = 0,003). Аналогичный, но недостоверный эффект был обнаружен и при анализе доли наивных CD8+ лимфоцитов (p = 0,07). При этом в контрольной культуре лимфоцитов к четвертым суткам увеличивалась пропорция CD4+ EM клеток в 1,8 раз (p = 0,0002) и CD8+ EM клеток в 1,4 раза (p = 0,062). Данные представлены в Таблице 3.3.
МСК, с которыми взаимодействуют лимфоциты, аллогенны по отношению к ним. В процессе инкубации контрольных культур лимфоцитов доля T-клеток, экспрессирующих HLA-DR, не изменяется. Однако при сокультивировании T-клеток с МСК на протяжении четырех суток наблюдается постепенное нарастание доли CD4+HLA-DR+ (с 5,6 ± 0,6% до 15,4 ± 2,1%, p = 0,001) (Рисунок 3.12 А) и CD8+HLA-DR+ (с 8,7 ± 0,9% до 25,7 ± 4,3%, p = 0,002) клеток (Рисунок 3.12 Б).
Расширенная выборка доноров МСК включала в себя 27 доноров (в 28 независимых экспериментах). Лимфоциты, культивированные с этими МСК,были исследованы через сутки и четверо суток сокультивирования с МСК. Было обнаружено, что среднее значение относительного количества CD4+ наивных и эффекторных клеток памяти через четверо суток культивирования с МСК отличается от контрольных образцов. Данные представлены в Таблице 3.4. Доля наивных CD4+ клеток была выше в 1,2 раза после сокультивирования с МСК (p = 0,045). Достоверного снижения количества наивных CD4+ в процессе культивировании лимфоцитов без МСК не было обнаружено (p = 0,057), тогда как доля наивных CD8+ клеток снижалась (p = 0,013), а процент CD4+ и CD8+ EM клеток увеличивался (p 0,026). Для лимфоцитов, сокультивированных с МСК подобных изменения не было выявлено (p 0,059). Также сохранилась отмеченная выше динамика изменения доли клеток, экспрессирующих HLA-DR: при сокультивировании с МСК пропорция HLA-DR+ выросла в 1,6 раза как для CD4+ (p = 0,02), так и для CD8+ клеток (p = 0,01).
Таким образом, установлено влияние МСК на неактивированные лимфоциты: МСК препятствуют переходу лимфоцитов из наивного состояния, тем самым сохраняя количество наивных и эффекторных клеток.
Дифференцировка лимфоцитов при культивировании без МСК может быть объяснена условиями in vitro. Использованная в работе среда RPMI-1640 с добавлением 10% ЭТС может приводить к активации T-клеток и влиять на их свойства из-за содержащихся в сыворотке белков [77].
В данной работе не было обнаружено изменения количества регуляторных T-клеток при взаимодействии лимфоцитов с МСК, что противоречит литературным данными [9; 102; 152; 165]. Отличные от литературных данных результаты могут быть связаны с различными использованными в работах моделями взаимодействия МСК и лимфоцитов. В работе [135] после взаимодействия МСК с неактивированными лимфоцитами наблюдалось значительное увеличение количества CD25+ T-клеток, при этом эти клетки обладали иммунорегуляторными свойствами: они подавляли аллогенный иммунный ответ. Мы не обнаружили значительного увеличения количества этих клеток, несмотря на схожие условия культивирования лимфоцитов.
Взаимодействие с МСК приводит к увеличению доли HLA-DR положительных лимфоцитов, что может свидетельствовать об их активации [185]. До настоящего времени феномен увеличения экспрессии HLA-DR на T-клетках при взаимодействии с МСК не был описан. Однако в работе Rizvanov и соавторов было показано, что культивирование лимфоцитов, экспрессирующих ИЛ-2, с кондиционированной МСК средой приводило к увеличению количества HLA-DR+ T-клеток [140].
Динамика изменения субпопуляций лимфоцитов на протяжении 4 суток была исследована среди ФГА-лимфоцитов, сокультивированных с МСК 12 доноров. В качестве контроля использовались ФГА-лимфоциты, культивированные без МСК (n = 6).
При активации лимфоцитов с помощью ФГА уже через сутки обнаруживается значительное снижение пропорции наивных клеток . К четвертым суткамколичество наивных клеток снизилось в 2 раза для CD4+ клеток и в 2,5 раза для CD8+ клеток (p 0,027) (Таблица 3.5). При сокультивировании ФГА-лимфоцитов с МСК процент наивных клеток был достоверно выше через сутки (р = 0,031) как среди CD4+, так и среди CD8+ клеток, а к 4-м суткам снижался, но оставался достоверно выше, чем для контрольных культур лимфоцитов (р = 0,018).
В неактивированных лимфоцитах при культивировании без и с МСК пропорция стволовых клеток центральной памяти не изменялась. При активации наивные Т-клетки переходили в стадию SCM-клеток: их доля увеличивалась в течение 2-х суток, а затем начинала снижаться (Таблица 3.5). Для СD4+ клеток разницы между контрольными культурами активированных лимфоцитов и ФГА-лимфоцитами, сокультивированными с МСК, не наблюдалось. Доля CD8+ SCM в контрольной культуре выше на 1-2 сутки, чем при сокультивировании ФГА-лимфоцитов с МСК (p 0,05). Из стадии SCM T-клетки переходят в стадию центральных клеток памяти.
Доля клеток центральной памяти в культуре ФГА-лимфоцитов последовательно возрастает на протяжении четырех суток. МСК ингибируют процесс перехода T-клеток из состояния SCM в CM на протяжении трех суток для CD4+ клеток и всего периода сокультивирования для CD8+ клеток.
После стадии CM лимфоциты переходят в стадию транзиторных клеток памяти (transitional memory – TM). Доля ТМ CD4+ клеток очень мала и не изменялась по мере культивирования во всех вариантах эксперимента. В культивируемых ФГА-лимфоцитах происходило постепенное уменьшение их доли CD8+ TM клеток. При сокультивировании с МСК доля ТМ клеток не изменялась (Таблица 3.5).
Различное влияние мезенхимных стромальных клеток на субпопуляции лимфоцитов
При изучении взаимодействия лимфоцитов и МСК было обнаружено, что доля лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR, увеличивается при взаимодействии с МСК, тогда как в контрольной культуре лимфоцитов количество HLA-DR+ как CD4+, так и CD8+ клеток в процессе культивирования не изменяется (Таблица 3.4). Так как увеличение экспрессии HLA-DR было характерно и для CD4+, и для CD8+ клеток, то была оценена связь этих параметров для МСК 13 доноров. 3.6.1 Связь доли CD4+HLA-DR+ и CD8+HLA-DR+ T-клеток после взаимодействия с мезенхимными стромальными клетками
Количество Т-клеток, экспрессирующих HLA-DR+, достигало максимума через четверо суток сокультивирования неактивированных лимфоцитов с МСК. Была обнаружена корреляция между долей CD4+ и CD8+ HLA-DR+ лимфоцитов через 4 суток сокультивирования с МСК (p 0,0001, R2 = 0,94, Рисунок 3.31А).
Также было обнаружено, что при сокультивировании лимфоцитов с некоторыми образцами МСК не происходило изменение количества HLA-DR+ лимфоцитов. В связи с этими наблюдениями МСК доноров были разделены на 2 группы: группа А, при сокультивировании лимфоцитов с МСК которой происходило увеличение доли HLA-DR+ лимфоцитов, по сравнению с контрольными лимфоцитами (n = 8) (выделена красным на Рисунке 3.31Б), и Группа Б, при сокультивировании с МСК которой увеличения не происходило (n = 5) (выделена зеленым на Рисунке 3.31Б). Синим на рисунке 3.31Б выделены результаты определения доли CD4+ и CD8+ HLA-DR+ T-клеток в контрольных экспериментах, в которых лимфоциты культивировали без МСК (n = 6).
В дальнейшем неактивированные лимфоциты, сокультивированные с МСК групп А и Б, будут обозначаться лимфоциты-А и лимфоциты-Б, а ФГА-лимфоциты, сокультивированные с соответствующими МСК – ФГА-лимфоциты-А и ФГА-лимфоциты-Б. Был проведен анализ изменения доли HLA-DR+ CD4+ и CD8+ клеток в культурах лимфоцитов-А и лимфоцитов-Б. Относительное количество CD4+HLA-DR+ клеток не изменялось в контрольной культуре на протяжении всего срока культивирования. В культурах лимфоцитов-А происходило последовательное нарастание пропорции этих клеток от 6,1 ± 1,0% через сутки сокультивирования до 20,4 ± 1,6% через четверо суток культивирования (p 0,002). В группе лимфоцитов-Б также происходило нарастание количества CD4+HLA-DR+ клеток (c 4,8 ± 0,3% до 7,4 ± 0,4%, p = 0,017). Однако среди лимфоцитов-А доля этих клеток была достоверно выше, чем среди контрольных лимфоцитов и лимфоцитов-Б через 3 и 4 суток культивирования (p 0,002). В группе лимфоцитов-Б количество CD4+HLA-DR+ клеток было ниже, чем в контрольных культурах через 3 суток (p = 0,012). (Рисунок 3.32А).
Изменение доли CD4+HLA-DR+ клеток. Б) Изменение доли CD8+HLA-DR+ клеток Доля CD8+HLA-DR+ не изменялась на протяжении всего культивирования в контрольной группе. В группе лимфоцитов-А происходило последовательное увеличение количества CD8+HLA-DR+ клеток (p = 0,0002). В группе лимфоцитов-Б не было обнаружено динамики изменения пропорции этих клеток на всём протяжении культивирования. Количество CD8+HLA-DR+ клеток среди лимфоцитов-А превышало показатели контрольной группы через 3 и 4 суток культивирования (p 0,01). Пропорция CD8+HLA-DR+ клеток среди лимфоцитов-Б была ниже, чем в культурах лимфоцитов-А через двое, трое и четверо суток культивирования (p 0,04) и ниже, чем в контрольных культурах через трое суток инкубации (p = 0,0129) (Рисунок 3.32Б).
Показано, что индивидуальные различия в МСК проявляются на всех сроках культивирования с лимфоцитами, однако наибольшие отличия проявляются на поздних сроках культивирования.
После 4-х суток сокультивирования с МСК всех доноров была обнаружена линейная зависимость между долей CD4+HLA-DR+ клеток (p = 0,0021, R2 = 0,63), в культурах ФГА-лимфоцитов и неактивированных лимфоцитов. Аналогичная зависимость была выявлена и для количества CD8+HLA-DR+ клеток (p = 0,0059, R2 = 0,55) в культурах лимфоцитов, культивированных с МСК (Рисунок 3.33).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что МСК сходным образом влияют как на неактивированные, так и на активированные лимфоциты. В связи с этим был проведен сравнительный анализ различных субпопуляций неактивированных и активированных лимфоцитов после их сокультивирования с МСК из групп А и Б.
Было проведено сравнение субпопуляций неактивированных лимфоцитов при сокультивировании с МСК групп А (лимфоциты-А, n = 8) и Б (лимфоциты-Б, n = 5). Анализировали данные, полученные через одни, 2, 3 и 4 суток сокультивирования лимфоцитов с МСК. В качестве контрольной группы выступали лимфоциты, культивированные без МСК (n = 6).
Отличий между пропорциями CD4+ и CD8+ NV, SCM, CM, TE, а также CD8+ TM и CD4+ EM клеток в культурах лимфоцитов-А и лимфоцитов-Б не было обнаружено на всём протяжении культивирования (Таблица 3.13).
Доля CD4+ TM клеток в культуре лимфоцитов-А была достоверно выше, чем среди лимфоцитов-Б через 3 и 4 суток сокультивирования (p 0,01). Относительное количество CD8+ EM клеток среди лимфоцитов-А было достоверно ниже, чем в культурах лимфоцитов-Б через 2 и 3 суток инкубации (p 0,05) (Таблица 3.13).
В контрольных образцах было достоверно больше наивных CD4+ клеток (p 0,05), а доля CD4+ EM была достоверно ниже (p 0,05), чем в культурах лимфоцитов, сокультивированных с МСК (Таблица 3.13).