Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Инфекционные осложнения у больных гемобластозами 15
1.2 Лабораторная диагностика бактериемий и сепсиса 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1 Характеристика обследованных контингентов 43
2.2 Отбор материала для исследования 45
2.3 Материалы исследования 45
2.3.1 Используемые штаммы микроорганизмов 45
2.3.2 Расходные материалы 47
2.3.3 Характеристика оборудования 49
2.4 Микробиологические методы исследования 50
2.5 Молекулярно-биологические методы исследования 51
2.5.1 Полимеразная цепная реакция 51
2.5.2 Секвенирование 52
2.6 Статистическая обработка результатов 52
Собственные данные 53
Глава 3. Характеристика инфекций кровотока у онкогематологических больных 53
3.1 Видовой состав бактерий, выявляемых в крови пациентов с гемобластозами 53
3.2 Выявление микромицетов в крови онкогематологических больных 57
3.3. Анализ видового состава возбудителей инфекций кровотока у пациентов с гемобластозами за последние 8 лет (2008-2015 гг.) 59
3.4 Частота выявления вирусов группы герпеса в крови онкогематологических больных c бактериальными и грибковыми осложнениями 61
ГЛАВА 4. Разработка молекулярно-биологических методов выявления бактерий в крови 67
4.1 Выявление бактерий в цельной крови и определение их грампринадлежности методом ПЦР-РВ 67
4.1.1 Подбор праймеров, зондов и режимов амплификации для выявления участка 16S рРНК, общего для всех бактерий 67
4.1.2 Подбор праймеров и зондов для определения грампринадлежности бактерий 70
4.1.3 Сравнение чувствительности и специфичности разработанного метода определения бактерий в биологическом материале с микробиологическим методом культивирования в системе BacT/ALERT 72
4.1.4 Оптимизация методов выделения, очистки и концентрации бактериальной ДНК из цельной крови 75
4.1.5 Инактивация фоновой бактериальной ДНК при постановке ПЦР на выявление участка 16S рРНК и определения грампринадлежности бактерий 82
4.2 Метод родовой и видовой идентификации бактерий в гемокультуре с использованием ПЦР в режиме «реального времени» 87
4.2.1 Определение чувствительности разработанного метода идентификации бактерий в сравнении с общепринятым микробиологическим методом 89
4.2.2 Оптимизация методов выделения ДНК микроорганизмов из гемокультуры 91
4.2.3 Проверка специфичности разработанного метода идентификации бактерий в модельных опытах с искусственной бактериальной контаминацией крови 97
4.2.4 Сравнение результатов амплификации на приборах Rotor-Gene и АНК-32 111
4.2.5 Оптимизация состава реакционной смеси для исключения ложноотрицательных результатов при проведении ПЦР-РВ вразработанном методе 120
4.2.6 Оценка эффективности разработанного молекулярно биологического метода родовой и видовой идентификации бактерий в крови больных 124
4.3 Алгоритм выявления и видовой идентификации бактерий в крови с использованием ПЦР в режиме «реального времени» 130
Заключение 133
Выводы 149
Практические рекомендации 150
Список сокращений 151
Список литературы 154
- Используемые штаммы микроорганизмов
- Анализ видового состава возбудителей инфекций кровотока у пациентов с гемобластозами за последние 8 лет (2008-2015 гг.)
- Подбор праймеров и зондов для определения грампринадлежности бактерий
- Проверка специфичности разработанного метода идентификации бактерий в модельных опытах с искусственной бактериальной контаминацией крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Современное лечение гемобластозов основано на применении цитостатических препаратов, высокодозной химиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Их использование позволило добиться значительных успехов в лечении онкогематологиче-ских больных, однако привело к возникновению ряда побочных эффектов, связанных, в частности, с развитием тяжелых инфекционных осложнений, существенно усугубляющих течение основного заболевания [С.С. Бессмельцев, К.М. Абдулкадыров, 2014, 2016]. Так, показано, что при проведении химиотерапии инфекционные осложнения регистрируются у 40-90% больных [В.А. Войцеховский и др., 2012]. Причем инфекционные осложнения у больных различными формами гемобластозов протекают особенно тяжело, часто с генерализацией процесса, развитием бактериемий и угрозой сепсиса. В связи с этим проблема предупреждения и лечения инфекционных осложнений приобретает особую актуальность.
Сепсис – важная проблема современной медицины, поскольку он является тяжелым осложнением многих заболеваний. Даже в развитых странах велика смертность от сепсиса. Так, в США, по разным оценкам, ежегодно регистрируется от 900 тысяч до 3 миллионов случаев бактериального или грибкового сепсиса, из которых летально заканчиваются 15-30% [D.E. Gaieski et al., 2013], в Германии сепсис является третьей по частоте причиной смерти [C. Engel et al., 2007]. Что касается смертности от сепсиса в России, то, например, в Смоленске по данным аутопсий за 2000-2004 гг. она составила 34,5 на 100 тысяч населения [Д.В. Галкин, 2005]. Следует отметить, что особую опасность сепсис представляет для иммуносу-прессированных пациентов, в частности для больных различными формами гемобластозов [N. Mancini et al., 2008]. В последние годы определены основные тенденции изменения спектра возбудителей. Установлена широкая распространенность устойчивости к антибиотикам госпитальных штаммов микроорганизмов [Н.С. Багирова, 2015]. Это доказывает необходимость постоянного микробиологического мониторинга в стационарах, особенно в отделениях, где проводится лечение иммунокомпрометированных пациентов. Известно, что наряду с бактериями, важная роль в развитии инфекционных осложнений у онкогематологических больных отводится вирусам, в частности вирусам группы герпеса [В.Н. Чеботкевич, К.М. Абдулкадыров, 2002]. Однако роль их в развитии бактериемий и сепсиса недостаточно ясна.
Развитие бактериемий и сепсиса обусловлено тем, что бактерии попадают в кровь из очагов инфекции в легких, с кожи, мягких тканей, кишечника, мочевыводящих путей и других органов. Риск бактериемии существенно возрастает при проведении различных диагностических и лечебных процедур, в частности при использовании центрального венозного ка-
4 тетера. Установлено, что несвоевременное назначение адекватной противомикробной терапии значительно увеличивает риск летального исхода. Например, 48-часовая задержка лечения пациентов с эндокардитом увеличивает риск смерти в течение 14 дней в 5 раз [E.N. Vergis et al., 2001]. Поэтому необходимо своевременное этиотропное лечение, которое требует быстрой идентификации возбудителя и определения его чувствительности к антибиотикам. В то же время общеизвестные микробиологические методы не позволяют идентифицировать микроорганизмы в короткие сроки, поэтому существует насущная потребность в разработке более быстрых методов их выявления в крови.
Перспективным подходом к разработке методов выявления и идентификации патогенов в крови является использование технологий амплификации нуклеиновых кислот, которые также могут применяться для выявления маркеров антибиотикорезистентности. Главным преимуществом этих методов является скорость проведения исследования. Среди этих технологий наиболее широкое применение нашла полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Между тем, одной из основных трудностей при использовании ПЦР для выявления микроорганизмов в крови является малая концентрация возбудителей, а также наличие в ней ингибиторов, препятствующих прохождению реакции. Это диктует необходимость разработки пригодных для практики методов выявления и идентификации бактерий и грибов – возбудителей инфекций кровотока у больных с различными инфекционными осложнениями.
Степень разработанности темы исследования
Развитие инфекционных осложнений у иммуносупрессированных больных усугубляет течение основного заболевания и может стать причиной летального исхода. Поэтому в исследованиях последних лет большое внимание уделяется изучению особенностей спектра возбудителей бактериемий и сепсиса у пациентов, находящихся на лечении, а также определению уровня чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам [Н.В. Мальцева и др., 2014; А.А. Соколов, 2009]. Накоплено значительное количество данных об инфекционных осложнениях и у больных гемобластозами [Г.А. Клясова, 2007; О.В. Полухина, 2014, Т.В. Чуданова, 2003]. Тем не менее, структура возбудителей бактериемий и сепсиса и их чувствительность к антибиотикам в любом стационаре со временем изменяются, что свидетельствует о настоятельной необходимости постоянного мониторинга спектра возбудителей инфекций кровотока и их чувствительности к противомикробным препаратам. Известно, что большую роль в развитии инфекционных осложнений у онкогематологических больных играют не только бактерии и микромицеты, но и вирусы [В.Н. Чеботкевич, К.М. Абдул-кадыров, 2002], при этом особое место среди них занимают вирусы группы герпеса, поскольку они способны формировать латентную инфекцию и при отсутствии своевременной диагностики и терапии могут приводить к тяжелым последствиям. Однако роль вирусов
5 группы герпеса при бактериемиях и сепсисе у онкогематологических больных изучена недостаточно и требует уточнения.
Несмотря на бурное развитие молекулярно-биологических методов и активное внедрение автоматизированных систем фенотипической идентификации бактерий, проблема быстрой и надежной индикации микробов в крови остается в центре внимания исследователей. Это связано с тем, что результаты исследований клинической применимости многих коммерчески доступных в настоящее время тест-систем для быстрой идентификации возбудителей инфекций кровотока часто являются противоречивыми [O. Opota et al., 2015]. Кроме того, большинство тест-систем производятся зарубежными фирмами и являются дорогостоящими. Целесообразной представляется разработка экономически более доступных отечественных методов быстрой этиологической диагностики инфекций кровотока.
Все вышесказанное свидетельствует о необходимости выполнения дополнительных исследований, что позволит в определенной мере восполнить существующие пробелы.
Цель исследования. Разработать и научно обосновать алгоритм ранней диагностики бактериемий и сепсиса с использованием технологий амплификации нуклеиновых кислот, позволяющий с высокой точностью идентифицировать возбудителей инфекций кровотока.
Задачи исследования
-
Провести анализ результатов бактериологического исследования крови онкогемато-логических больных за период 1991-2015 гг. для выявления динамики изменения спектра возбудителей бактериемии и сепсиса в этой группе пациентов.
-
Определить частоту выявления вирусов группы герпеса у онкогематологических больных с различными бактериальными и грибковыми осложнениями и их влияние на течение инфекционного процесса.
-
Разработать молекулярно-биологический метод ускоренного выявления и идентификации возбудителей бактериемий и сепсиса с использованием технологий амплификации нуклеиновых кислот у онкогематологических больных, оценить его чувствительность и специфичность.
-
Предложить этапы ранней диагностики бактериемий и сепсиса у онкогематологиче-ских больных с использованием разработанного молекулярно-биологического метода.
Научная новизна исследования
Проведен анализ бактерий и микромицетов, выявляемых в крови у онкогематологиче-ских больных за длительный период (1991-2015 гг.) и получены новые данные о видовом составе возбудителей и динамике их изменения.
Впервые на основании комплексной оценки результатов микробиологического исследования крови онкогематологических больных установлено повышение удельного веса гра-мотрицательных бактерий (в период 2002-2015 гг.) и микромицетов (в период 2011-2015 гг.).
Впервые установлено, что при бактериемиях у онкогематологических больных достоверно чаще в крови обнаруживаются геномы вирусов группы герпеса, в частности вируса Эпштейна-Барр и цитомегаловируса, что ухудшает течение инфекционного процесса.
Разработан метод на основе применения технологий амплификации нуклеиновых кислот, позволяющий сократить время выявления и идентификации микроорганизмов в ге-мокультуре с 48 часов и более до 5-7 часов, что необходимо для своевременного назначения адекватной антибактериальной терапии
Установлено, что по своей чувствительности и специфичности предложенный молекулярно-биологический метод идентификации бактериальных и грибковых возбудителей инфекций кровотока не уступает общепринятым микробиологическим методам.
Теоретическая и практическая значимость
Единый системный подход к бактериологическому обследованию существенно расширяет представление об этиологии инфекций кровотока у онкогематологических больных и создает теоретическую основу для дальнейших исследований в этой области.
Определен спектр бактериальных возбудителей инфекций кровотока у пациентов с опухолевыми заболеваниями системы крови.
На основании анализа многолетних наблюдений установлены важные для практики особенности изменения спектра возбудителей бактериемий и сепсиса у онкогематологиче-ских больных.
Обоснована важность и необходимость определения вирусов группы герпеса при возникновении бактериальных и грибковых осложнений у онкогематологических больных и установлено их негативное влияние на течение инфекционного процесса.
Установлено, что для этиологической диагностики сепсиса необходимо применение комплекса микробиологических и молекулярно-биологических методов.
Разработан и научно обоснован алгоритм этиологической диагностики бактериемий и сепсиса у онкогематологических больных, включающий выявление генетических маркеров антибиотикорезистентности бактерий, с использованием технологий амплификации нуклеиновых кислот, который существенно сокращает время исследования и позволяет своевременно назначать оптимальную этиотропную терапию.
Методология и методы исследования. Научная методология исследования основывается на системном подходе к изучаемой проблеме и комплексном рассмотрении процессов, лежащих в основе развития инфекционных осложнений у больных онкогематологическими
7 заболеваниями. В работе использованы микробиологические, молекулярно-биологические, клинические, статистические, а также общенаучные методы исследования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
На сновании анализа результатов бактериологического исследования крови при инфекционных осложнениях у онкогематологических больных за период 1991-2015 гг. установлено периодическое изменение спектра выявляемых возбудителей: в 90-е годы XX в. отмечено достоверное увеличение частоты встречаемости грамположительных бактерий (до 90%), а в последние годы – грамотрицательных бактерий, а также мик-ромицетов.
-
При бактериемиях у онкогематологических больных достоверно чаще (p<0,05) выявляются геномы вирусов группы герпеса по сравнению с больными, у которых бактерии в крови выявлены не были, что существенно влияет на тяжесть течения инфекционного процесса.
-
Использование метода родовой и видовой идентификации микромицетов, бактерий и генетических маркеров их антибиотикорезистентности, основанного на применении ПЦР в режиме «реального времени», в совокупности с выявлением геномов вирусов в крови пациентов, позволяет в короткий срок установить этиологию инфекций кровотока, что крайне важно для начала целенаправленной этиотропной терапии.
4. Алгоритм диагностики бактериемий и сепсиса включает в себя 3 этапа:
выявление пациентов с подозрением на инфекции кровотока, с учетом клиниче
ской симптоматики;
забор крови и проведение гемокультивирования в автоматическом бактериологическом анализаторе; идентификацию микроорганизмов и определение генов антибиотикорезистентно-
сти с использованием ПЦР в режиме «реального времени».
Внедрение результатов исследования в практику
Разработан, освоен и внедрен в практику работы лаборатории бактериологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) метод выявления и идентификации возбудителей инфекций кровотока у онкогематологических больных с использованием технологий амплификации нуклеиновых кислот. Апробация разработанного метода производилась в лаборатории бактериологии, клиническом отделении гематологии, химиотерапии и трансплантации костного мозга с блоком интенсивной терапии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России и в гематологическом отделении СПБ ГБУЗ «Городская больница №15» города Санкт-Петербурга.
8 Итоги работы освещались на семинарских занятиях с клиническими ординаторами и аспирантами в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Материалы исследования используются в учебном процессе на циклах усовершенствования врачей в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Санкт-Петербург) и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и инфекционных болезней Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Степень достоверности результатов проведенного исследования подтверждается большим объемом наблюдений, адекватным набором оцениваемых показателей, спланированным дизайном работы, выбором для обработки материалов методов статистического анализа, соответствующего цели и задачам исследования и современному уровню науки.
Результаты, полученные в процессе выполнения работы, были представлены на рос
сийских научно-практических конференциях: Всероссийская научно-практическая конфе
ренция с международным участием "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии",
посвященная 80-летию ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России (Санкт-Петербург, 2012 г.); научно-
практическая конференция, посвященная 184-й годовщине образования Санкт-
Петербургского государственного технологического института (технического университета)
(Санкт-Петербург, 2012 г.); научная конференция, посвященная 185-й годовщине образова
ния Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического
университета) (Санкт-Петербург, 2013 г.); III Всероссийская научно-практическая конферен
ция с международным участием "Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и
службе крови" (Санкт-Петербург, 2014 г.); IV Всероссийская научно-практическая конфе
ренция с международным участием "Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии
и службе крови" (Санкт-Петербург, 2016 г.), IX Всероссийская научно-практическая конфе
ренция с международным участием «Молекулярная диагностика – 2017» (Москва, 2017 г.); и
на международном конгрессе «XXVI Сongrs de la Socit Franaise transfusion sanguine»
(«XXVI Конгресс Французского Общества по переливанию крови», Париж, 2013 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 22 печатные работы, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, и 2 методических рекомендаций.
Личный вклад автора. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы. Автором сформулирована цель и определены задачи исследования, предложены оптимальные пути их решения с использованием оригинальных методик. Диссертантом лично
9 выполнены бактериологические и молекулярно-биологические исследования, проведены анализ и обобщение полученных результатов. Проведена статистическая обработка данных.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 180 страницах текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов исследований, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографии. Список литературы включает 234 источника, из которых 64 на русском языке. Работа содержит 38 рисунков и 29 таблиц.
Используемые штаммы микроорганизмов
Использование современных стратегий лечения больных гемобластозами, таких как высокодозная химиотерапия и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, привело к значительному увеличению частоты полных ремиссий и повышению общей выживаемости онкогематологических больных. Так, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) может быть излечен примерно у половины взрослых больных и в 90% случаев у детей [135]. Однако эффективная цитотоксиче-ская терапия воздействует не только на опухолевые, но и на нормальные гемопоэ-тические клетки. Это значительно увеличивает риск развития лейкопений и гра-нулоцитопений, приводит к нарушениям в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета. У больных гемобластозами развивается глубокая и продолжительная гранулоцитопения, сочетающаяся с нарушением функции нейтрофилов. Это резко увеличивает риск миелосупрессии и развития инфекционных осложнений. В силу этого инфекционные осложнения чаще возникают и тяжелее протекают у онкоге-матологических больных по сравнению с больными солидными опухолями, у которых период гранулоцитопении менее продолжителен [18]. Так, при множественной миеломе (ММ) риск развития любых инфекций значительно выше, чем у пациентов негематологического профиля, при этом риск бактериальных инфекций выше в 7 раз, а вирусных в 10 раз [86]. Органные дисфункции, обусловленные проводимой терапией, и сопутствующая патология у пожилых пациентов также увеличивают риск инфекционных осложнений. Так, у больных с хронической почечной недостаточностью вероятность развития инфекционных осложнений существенно выше, чем у пациентов с сохраненной функцией почек [8, 9, 58]. А инфекционные осложнения при ММ наиболее часто наблюдаются при ее поздней диагностике (р 0,001). Частота инфекций возрастает в связи с развитием лейкопений и гранулоцитопений у больных, получавших различные программы химиотерапии (ХТ), ВДХТ, иммуномодулирующие средства [172, 174]. В соответствии с классификацией ВОЗ (Всемирной Организации Здравоохранения), выделяют 4 степени нейтропении: I степень – количество нейтрофилов 2,0-1,5х109/л, II степень – количество нейтрофилов 1,5-1,0х109 /л, III степень – 1,0-0,5х109/л, и IV степень – менее 0,5х109 /л. Выделяют еще и больных с числом нейтрофилов менее 0,1х109/л. Последняя группа больных является наиболее уязвимой с точки зрения развития быстротекущей грамотрицательной инфекции [9]. Имеется прямая корреляция между степенью и длительностью нейтропении и частотой развития инфекционных осложнений [17]. Так, если количество нейтрофилов 1,0х109/л сохраняется до 7 дней, частота инфекционных осложнений составляет всего 0,6%, 7-14 дней – 4%, а при продолжительности более 14 дней – 38%. Важным фактором риска является быстрота падения количества нейтрофилов. Низкий уровень нейтрофилов до начала курса химиотерапии является фактором риска развития тяжелых нейтропенических осложнений после завершения ХТ [179]. По данным Европейской организации исследований и лечения рака (EORTC, European Organization for Research and Treatment of Cancer) при гранулоцитопении положительный ответ на лечение антибиотиками выявлен у 23% больных, а при отсутствии гранулоцитопении – у 82% [94].
Для характеристики больных с лихорадкой и нейтропенией используется также понятие «фебрильная нейтропения». Рабочей комиссией Американского общества по инфекционным заболеваниям (Infectious Diseases Society of America (IDSA)) фебрильную нейтропению определяют как состояние, характеризующееся уровнем нейтрофилов 1,0х109/л при однократном повышении оральной температуры выше 38,3оС или выше 38,0оС, по меньшей мере, в течение одного часа (оральная температура 38оС соответствует 37,4оС в подмышечной впадине, разница 0,6С [18]) и уровнем нейтрофилов 0,5х109/л или 1,0х109/л с прогнозируемым снижением до 0,5х109/л [134]. Возникающие инфекционные осложнения значительно отягощают течение гемобластозов и увеличивают летальность. При сроках наблюдения за больными 5-10 лет отмечено двукратное увеличение риска развития инфекций [9].
Спектр патогенов, способных вызвать инфекционные осложнения у имму-носупрессированных онкогематологических больных, очень разнообразен – это бактерии, грибы, вирусы [23, 25, 58]. Нередко, особенно в период нейтропении, инфекции носят смешанный характер [61].
В гематологических отделениях сосредоточены больные, которые представляют собой группу риска развития госпитальных инфекций, в том числе и сепсиса. Это связано с тем, что из-за частых повторных госпитализаций в стационарах формируется стабильный внутрибольничный микробиоценоз. Источником инфекции могут быть как больные, так и персонал отделений, а факторами передачи – медицинские инструменты, предметы обихода. Именно условно-патогенные микроорганизмы в большинстве случаев и вызывают сепсис [9].
Наиболее опасными из инфекционных осложнений у онкогематологических больных являются инфекции кровотока, приводящие к развитию сепсиса. За последние десятилетия XX века и начало XXI века спектр возбудителей инфекций кровотока значительно изменился. В 1960-х – 1970-х годах преобладали грамот-рицательные бактерии, вызывавшие тяжелые жизненно опасные инфекции. В период 1980-х – 1990-х годов более часто стали высеваться грамположительные микроорганизмы. Эти тенденции связывают с началом широкого использования ЦВК и более эффективной профилактикой грамотрицательных инфекций [217, 218, 226, 234].
В настоящее время, несмотря на преобладание грамположительных микробов (в основном коагулазонегативных стафилококков (КНС)), наблюдается тенденция к повышению доли грамотрицательных бактерий.
В структуре грамотрицательных микроорганизмов ведущими патогенами остаются Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella spp.
Отмечается постоянство обнаружения P.aeruginosa при бактериемиях и сепсисе у онкогематологических больных [89, 138, 160, 213]. Частота выявления этого возбудителя при бактериемиях существенно не менялась в течение 11 лет наблюдения [195] и составляла от 5 до 18%. В среднем, P.aeruginosa у гематологических пациентов обнаруживается в 10% случаев [165]. В некоторых странах частота их выявления была значительно выше. Например, в Японии P.aeruginosa был выявлен у 20% больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) [230]. В Индии частота выявления этого патогена была еще выше и составляла 30% от всех микробов, вызывавших инфекции кровотока [187].
Анализ видового состава возбудителей инфекций кровотока у пациентов с гемобластозами за последние 8 лет (2008-2015 гг.)
Системы, в основе которых лежит принцип флуоресцентной in situ гибридизации, показали высокую чувствительность и специфичность (90-100%) и хорошую корреляцию с классическим методом (96-99%) [106, 107, 117, 205]. Метод не требует предварительного выделения генетического материала, прост в использовании и относительно недорогой. Однако данные системы не определяют маркеры устойчивости к антибиотикам, недостатком является и ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов (системы PNA FISH и QuickFISH (обе AdvanDx, США) способны идентифицировать по 4 грамположительные и грамотрицатель-ные бактерии, а также грибы рода Candida). Кроме того есть мнение, что оценка полученных результатов субъективна, поскольку идентификация производится не автоматически – микроскопическую визуализацию проводит специально обученный персонал [196].
В России же из молекулярных методов выявления и идентификации микроорганизмов наиболее разработанными являются методы на основе полимеразной цепной реакции. Уже более 20 лет эти методы активно используются для выявления вирусов и труднокультивируемых бактерий, таких как микоплазмы, уреаплазмы, хламидии и другие. Данное направление является очень перспективным и интенсивно разрабатывается в настоящее время для выявления бактерий, вызывающих инфекции кровотока.
Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определенного участка нуклеиновой кислоты. Идентификацию бактерий проводят на фрагментах гена рРНК-оперона [20]. В гене 16S рРНК существует участок, общий для всех бактерий, что позволяет с помощью ПЦР обнаружить присутствие бактерий в крови. Также в гене находятся вариабельные участки, специфичные для определенных родов и видов бактерий. Помимо 16S амплификацию производят также на фрагментах 23S рРНК для бактерий и 18S рРНК для грибов.
В настоящее время чаще всего используют ПЦР в режиме «реального времени», без применения гель-электрофореза. При проведении ПЦР «в реальном времени» производят не просто регистрацию полученного продукта по окончании реакции, а в течение всего времени ПЦР идет наблюдение за накоплением ампли-конов (новых синтезированных цепей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)) и за изменениями, происходящими в ходе каждого цикла. Амплификацию проводят с использованием флуоресцентных красителей, флуоресцентное излучение регистрируется и передается на компьютер. В результате можно получить кривые зависимости флуоресценции от числа циклов, что позволяет при необходимости проводить количественное определение ДНК в пробах [57, 130, 140], что особенно важно для выявления контаминации образца крови пациента малопатогенными микроорганизмами, приводящей к появлению ложноположительных результатов.
Среди ПЦР-методов, использующихся для идентификации микроорганизмов в положительных образцах гемокультуры, чаще всего используют мультиплексную ПЦР (ПЦР, в которой одновременно используется более одной пары праймеров, что приводит к амплификации сразу нескольких ДНК-матриц, а это в свою очередь позволяет единовременно (в одной пробирке, на одной матрице) проверять материал на содержание нескольких видов бактерий).
Есть разные вариации данного метода. Например, есть системы, в которых выделенный из положительной гемокультуры генетический материал гибри-дизуют на матрице, содержащей комплементарные последовательности для различных бактерий, а также для генов устойчивости к антибиотикам. Примером такой системы может служить Verigene (Nanosphere, США), у нее есть две панели для грамположительных и грамотрицательных бактерий; выбор панели производится на основании окрашивания по Граму полученной гемокультуры. Метод показывает хорошие чувствительность и специфичность при работе с монокультурой [206, 227], однако для работы со смешанной культурой требуются доработки. Например, в смешанной культуре система Verigene выделяет обычно только один патоген, а все микроорганизмы выявляются только в 60-76% для панели грампо-ложительных бактерий [197, 206, 227] и в 55-57% случаев для панели грамотрица-тельных бактерий [146, 210].
Существуют системы, проводящие последовательно две ПЦР после экстракции нуклеиновых кислот из положительной гемокультуры. Это, так называемая, «гнездовая» ПЦР, которая проходит с участием двух пар праймеров, внешних и внутренних. Внутренняя пара праймеров способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первой стадии амплификации с внешней парой праймеров. В системах, разработанных для идентификации бактерий в биоматериале (FilmArray (BioFire, США), Prove-it Sepsis (Mobidiag, Финляндия)), вторая стадия амплификации производится в мультиплексном формате. Т.е. после получения в первой стадии основного фрагмента, ДНК наносят на матрицу, на которой проводится вторая ПЦР с родо- и видоспецифичными парами праймеров. Время проведения анализа занимает не более 3 часов (системе FilmAr-ray требуется всего 1 час, однако она может тестировать только один клинический образец за раз, в то время как Prove-it Sepsis может тестировать до 96 образцов за 3 часа). Используемая технология позволяет увеличить чувствительность и специфичность за счет уменьшения побочных продуктов реакции (по данным исследований чувствительность систем составляет 90-99%, а специфичность 98-100% [66, 72, 85, 209]).
Все рассмотренные системы используются только на образцах положительных гемокультур и, соответственно, не решают многих проблем, связанных с ге-мокультивированием, в частности невозможности выявления труднокультивиру-емых или некультивируемых микроорганизмов. Помимо этого, общее время до получения результата клиницистами, хоть и сокращается, но все равно лимитируется временем прорастания гемокультуры и поэтому занимает не меньше суток.
Подбор праймеров и зондов для определения грампринадлежности бактерий
Полученные данные показывают, что грамположительные бактерии по-прежнему являются наиболее частыми патогенами, вызывающими бактериемии и сепсис у больных гемобластозами, однако значительно возросла частота выявления КНС среди грамположительных бактерий (60% на 1991 – 2007 гг. и 80,6% на 2008-2015 гг.), в то время как частота выявления Staphylococcus aureus снизилась более, чем в 2 раза (15,8% до 2008 года и 7,4% после), а Streptococcus spp. вообще не были выявлены ни в одном случае.
В отношении состава грамотрицательных бактерий никаких значительных изменений выявлено не было, за исключением того, что за исследуемый 8-летний период не были обнаружены Klebsiella spp. и Salmonella spp. 3.4 Частота выявления вирусов группы герпеса в крови онкогематоло-гических больных c бактериальными и грибковыми осложнениями
Для уточнения роли вирусов группы герпеса в развитии бактериемий и сепсиса у больных гемобластозами выделены 2 группы пациентов с опухолевыми заболеваниями системы крови с постцитостатической нейтропенией и лихорадкой: в 1-ю группу вошли пациенты, у которых бактерии в крови выявлены не были; 2-ю группу составили больные с подтвержденными бактериальными инфекциями кровотока. В обеих группах было проведено сравнительное исследование частоты выявления вирусов группы герпеса в крови (таблица 3).
На основании полученных данных было установлено, что частота выявления геномов ВЭБ и ЦМВ в крови больных 2-й группы (с бактериемией) достоверно выше по сравнению с больными 1-й группы.
При анализе видового состава бактерий, обнаруживаемых в крови онкоге-матологических больных (таблица 2) было показано, что среди грамположитель-ных микробов наиболее часто высевали КНС. У 39% больных бактериемия, вызванная КНС, развивалась на фоне герпес-вирусных инфекций (ВЭБ, ВГЧ-6, ЦМВ и в 1 случае – ВГЧ-6 и ВЭБ одновременно). У одного пациента наблюдалась энте-рококковая бактериемия на фоне смешанной ЦМВ-ВЭБ-инфекции.
Для изучения частоты клинических проявлений и исходов бактериемий и сепсиса у онкогематологических пациентов, а также выявления роли вирусов группы герпеса в их развитии были исследованы истории болезни 64 больных с различными формами гемобластозов (характеристика больных представлена в таблице 1 в разделе «Материалы и методы»).
Характеристика пациентов с инфекциями кровотока, вызванными грамот-рицательными бактериями представлена в таблице 4. Как видно из таблицы, это были больные острым лейкозом, хроническим миело- и лимфолейкозом, неходж-кинскими лимфомами. У всех этих пациентов была лейкопения и нейтропения IV степени.
Среди грамотрицательных бактерий в кровотоке этих пациентов наиболее часто обнаруживали E.coli (9 случаев), при этом у одного пациента выявлено развитие сепсиса на фоне ВЭБ-инфекции и еще у одного – на фоне ЦМВ-инфекции. Реже выявлялись другие бактерии семейства Enterobacteriaceae, а Pseudomonas aeruginosa был выявлен только в 1 случае на фоне ВЭБ, ВПГ-1,2 и ВГЧ-6. Интересны два эпизода выявления бактерии Moraxella catarrhalis: в одном случае бактерия высевалась вместе с Candida albicans на фоне ЦМВ-инфекции, во втором случае она периодически высевалась из крови в течение 4 месяцев на фоне одновременного обнаружения геномов ЦМВ, ВПГ-1,2, ВГЧ-6 и ВЭБ.
Таким образом, у всех больных наблюдалась картина синдрома системной воспалительной реакции с грамотрицательным сепсисом. В таких случаях важно обнаружение первичного очага инфекции. Первичный очаг был обнаружен у 9 (64%) больных, во всех случаях он локализовался в легких (чаще всего выявлялась пневмония с характерной клинической симптоматикой). Дополнительно в 2 случаях было поражение кожи и мягких тканей (фурункулез и уплотнение с покраснением), в 2 – синусит и в еще 1 – поражение желудочно-кишечного тракта (жидкий стул). Однако в 5 (36%) эпизодах источник инфекции выявить не удалось.
Больным проводилась эмпирическая антибиотикотерапия, однако в ряде случаев она была изменена на основании полученных результатов определения чувствительности к антибиотикам. При выявлении геномов герпес-вирусов лечение дополняли противовирусными препаратами.
У 4 больных с выявленной E.coli наблюдался септический шок (в 1 случае на фоне ВЭБ-инфекции) с полиорганной недостаточностью. Летальность при грамотрицательном сепсисе составила 57% (8 больных). В 4 случаях зарегистрирована устойчивость штаммов E.coli, Enterobacter aerogenes, Moraxella catarrhalis к цефалоспоринам III, IV поколений, фторхинолонам, а в 4 – к карбапенемам.
Характеристика пациентов с инфекциями кровотока, вызванными грампо-ложительными бактериями представлена в таблице 5. Учитывая клинические данные, вероятная роль коагулазонегативного стафилококка в развитии ССВР была установлена у 11 пациентов, у 4 из которых КНС выявлены на фоне различных вирусов группы герпеса. Также у всех больных наблюдалась нейтропения IV степени. Во всех 11 эпизодах был диагностирован сепсис, в 1 случае с развитием септического шока. Первичный очаг инфекции (пневмония, центральный венозный катетер) был выявлен только в 36% (у 4 пациентов). Летальный исход при сепсисе, вызванном КНС, наблюдался в 2 случаях (18%).
Проверка специфичности разработанного метода идентификации бактерий в модельных опытах с искусственной бактериальной контаминацией крови
Поскольку обработка реакционной смеси 8-МОР еще до введения образца дала положительные результаты, было проведено еще несколько серий опытов для подбора концентрации реагента и времени обработки фермента, которые позволяли бы инактивировать фоновую бактериальную ДНК, не снижая эффективности самой Taq-полимеразы. Однако подобрать оптимальный режим очищения фермента от фоновой ДНК не удалось.
На основании полученных данных был сделан вывод о том, что разрабатываемая методика на основе ПЦР-РВ может быть использована для быстрого выявления бактерий в цельной крови пациентов и определения их грампринадлежно-сти. Однако невозможность подобрать режим инактивации фоновой бактериальной ДНК без снижения эффективности фермента Taq-полимеразы может привести к получению ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Ложноположительные результаты могут быть получены при отказе использовать псорален для обработки реакционной смеси вследствие того, что фоновый сигнал от ДНК, содержащейся в ферменте, может быть принят за положительный сигнал образца. Ложноотрицательные результаты могут быть получены при инактивации полимеразы вследствие снижения эффективности фермента.
Эти проблемы можно решить при использовании полимеразы, свободной от бактериальной ДНК, которая представлена на рынке, например, фирмой «Molzym» (Германия). Однако из-за высокой цены она доступна лишь для ограниченного круга лабораторий, а отечественных аналогов такого фермента нет.
Для того чтобы перекрыть фоновый сигнал после амплификации, не используя методов инактивации, нужно получить больше геномных копий бактерий, для чего необходимо увеличить объем клинического образца до 5-10 мл. Это приведет к увеличению объемов расходуемых реагентов. Кроме того, нет уверенности, что центрифугирование такого количество крови также эффективно справится с удалением человеческой ДНК и не приведет к ингибированию ПЦР. Учитывая недостатки и технические трудности выявления бактерий в цельной крови пациентов, было решено разработать молекулярно-биологический метод на основе полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» для выявления бактерий и их видовой идентификации в крови онкогематологических больных после гемокультивирования. Важным преимуществом предварительного гемокультивирования является выявление только жизнеспособных микроорганизмов, имеющих клиническое значение. Кроме того, количество микробных тел в гемокультуре на несколько порядков выше, чем в цельной крови, поэтому чувствительность методики не зависит от чувствительности ПЦР.
По результатам анализа видового состава и частоты выявления бактериальных возбудителей в крови больных гемобластозами за последние 8 лет (2008-2015 гг.) был определен список наиболее часто встречающихся и клинически значимых микроорганизмов (раздел 3.3). До 90% выделенных штаммов составляют Staphy-lococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, бактерии сем. Enterobacteriaceae, среди которых преобладает Escherichia coli. В последние годы участились случаи выявления микромицетов в крови пациентов онкогематологического стационара, в основном это грибы рода Candida. На основании этих данных совместно с ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва) была проведена разработка и апробация наборов, которые планировалось ввести в клиническую практику. Они включали наборы реагентов для обнаружения ДНК бактерий семейства Enterobacteriaceae, основных грамотрицательных микробов: Acinetobacter bau-mannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, и бактерий рода Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, а также грибов рода Candida – C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C.tropicalis. Кроме того были использованы наборы для выявления наиболее часто встречающихся генов приобретенных карбапенемаз. Несмотря на то, что за период 2008-2015 гг. не было выявлено ни одной Klebsiella spp., а уровень выявления Enterococcus spp. был до 88
статочно низким, эти бактерии также были включены в набор, поскольку они являются частыми носителями генов резистентности к антибиотикам и их своевременное выявление влияет не только на выживаемость пациентов, но и на дальнейшее распространение резистентных штаммов бактерий. Кроме того, уровень выявляемости Klebsiella spp. остается достаточно высоким в других стационарах, в том числе и гематологических.
Чувствительность разработанного метода определяется чувствительностью системы автоматического культивирования, выявляющей присутствие бактерий и грибов в крови. В бактериологической лаборатории ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России используется система BacT/ALERT.
Для установления чувствительности этой системы в рамках темы «Сравнительный анализ бактериологических и молекулярно-биологических методов детекции бактериальной контаминации тромбоцитарной взвеси» были проведены эксперименты по искусственной контаминации тромбоцитного концентрата эталонными штаммами изучаемых грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Были проанализированы характеристики роста 80 искусственно контамини-рованных образцов ТК, полученного методом аппаратного тромбоцитафереза. Система BacT/ALERT регистрирует накопление углекислого газа (СО2), служащего индикатором роста бактерий. В качестве примера на графике на рисунке 19а видно, что в образце уже через 0,52 суток (12,5 часов) был зарегистрирован рост микроорганизмов. На рисунке 19б изображена кривая для образца, в котором не было обнаружено роста бактерий. В таблице 15 представлены результаты культивирования образцов ТК, искусственно контаминированных эталонными штаммами Escherichia coli и Staphylococcus aureus.