Прогностическая значимость наследственных и приобретенных факторов риска венозного тромбоэмболизма у пациентов молодого возраста Чечулова Анна Васильевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы .12

1.1. Патогенез венозного тромбоза и понятие «тромбофилия», приобретенные факторы риска ВТЭ .12

1.2. Роль наследственных тромбофилий в развитии повторных эпизодов ВТЭ и тяжелого посттромбофлебитического синдрома .26

1.3. Клинико-инструментальная диагностика ТГВ и ТЭЛА, новые маркеры венозного тромбоэмболизма 27

1.4. Патогенез и факторы риска посттромбофлебитического синдрома 31

1.5. Влияние антикоагулянтной терапии на течение и исход венозного тромбоэмболизма 32

ГЛАВА 2. Материалы и методы .35

2.1. Объект и материал исследования 35

2.2. Методы исследования 38

ГЛАВА 3. Основные наследственные и приобретенные факторы риска венозного тромбоэмболизма у пациентов молодого возраста .42

3.1. Влияние аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, на риск ВТЭ у пациентов молодого возраст 42

3.2. Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, у мужчин и женщин с ВТЭ 46

3.3. Закономерности распределения ДНК-полиморфизмов при различных клинических вариантах ВТЭ 50

3.4. Распределение генотипов исследуемых генов у больных с различной анатомической локализацией тромбоза глубоких вен 54

3.5. Основные приобретенные факторы риска ВТЭ 57

ГЛАВА 4. Ассоциация аллельных вариантов исследуемых генов с тяжестью исхода заболевания (рецидив, тяжелый ПТФС) 61

4.1. Распределение генотипов изучаемых генов в зависимости от степени тяжести ХВН у больных с ВТЭ 61

4.2. Особенности распределения генотипов изучаемых генов у больных с рецидивирующим течением ВТЭ 63

4.3. Ассоциация аллельного полиморфизма исследуемых генов с различными типами и степенью реканализации тромбоза .66

ГЛАВА 5. Маркеры тяжести острого втэ и предикторы тяжелого посттромбофлебитического синдрома. отдаленные результаты лечения пациентов молодого возраста с ВТЭ в зависимости от соблюдения комплаентности терапии 75

5.1. Определение маркеров тяжести ВТЭ в острый период 75

5.2. Выявление предикторов тяжелого посттромбофлебитического синдрома 78

5.3. Оценка типа реканализации перенесенного ТГВ в отдаленном периоде .81

5.4. Оценка отдаленных результатов лечения пациентов молодого возраста с ВТЭ .83

5.5. Оптимизация тактики ведения пациентов с острым ВТЭ 87

Обсуждение результатов 93

Выводы

Практические рекомендации 108 приложения .110

Список литературы

• Роль наследственных тромбофилий в развитии повторных эпизодов ВТЭ и тяжелого посттромбофлебитического синдрома
• Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, у мужчин и женщин с ВТЭ
• Особенности распределения генотипов изучаемых генов у больных с рецидивирующим течением ВТЭ
• Оценка типа реканализации перенесенного ТГВ в отдаленном периоде

Введение к работе

Актуальность темы

Тромбоз глубоких вен (ТГВ) и тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), объединяемые термином «венозный тромбоэмболизм» (ВТЭ), остаются серьезной проблемой здравоохранения в странах Европы и США. Ежегодная заболеваемость ВТЭ составляет, в среднем, 1 на 1000 жителей в год (Wong P. et al., 2012). ТЭЛА занимает третье место в структуре общей смертности и второе – как причина внезапной смерти (Blohlvek J. et al., 2013). Тяжелый посттромбофлебитический синдром (ПТФС) в 20-40% случаев развивается уже через 2 года после перенесенного ТГВ (ACCP, 2012). Причины возникновения ВТЭ многообразны, и в настоящее время главенствует теория «мультифакторного механизма» тромбообразования, при котором взаимодействие наследственных и приобретенных факторов приводит к нарушению равновесия между прокоагулянтной и антикоагулянтной системами гемостаза (Dahlback B., 2008; Martinelli I. et al., 2014). Особую проблему представляют «идиопатические», т.е. неспровоцированные какими-либо внешними факторами, венозные тромбозы в молодом возрасте (до 45 лет, по ВОЗ), в основе которых лежат наследственные тромбофилии ().

Понятие «наследственная тромбофилия» впервые упоминалось еще в 1965 году, когда О. Egeberg описал дефицит антитромбина как причину семейных венозных тромбозов (Egeberg О., 1965). С тех пор количество выявленных дефектов факторов системы гемостаза, причастных к риску развития венозного тромбоза, неуклонно увеличивалось (Gu L. et al., 2014; Medina P. et al., 2014). Тем не менее, при всем их многообразии, сегодня общепринятыми наследственными тромбофилическими состояниями считаются лишь дефицит естественных антикоагулянтов (антитромбина III, протеинов C и S) и мутации в генах факторов V (FV Leiden) и II (FII G20210A) (EGAPP, 2011). Однако это положение противоречит результатам анализа данных семейного анамнеза у пациентов с идиопатическим ВТЭ (Heit J.A., 2007). Известно также, что указанные генетические дефекты отсутствуют более чем в половине случаев ВТЭ, что косвенно указывает на причастность других наследственных факторов риска к генезу заболевания (Wichers I.M. et al., 2009). Важной особенностью ВТЭ является гетерогенность его клинических проявлений (ТГВ и/или ТЭЛА), прогнозировать тяжесть которых в остром и отдаленном периодах сейчас довольно сложно. Клиническое значение даже известных маркеров наследственной тромбофилии, а также ряда приобретенных факторов риска остается под вопросом. Влияние на клиническую картину и исход ВТЭ полиморфизма других генов гемостаза также мало изучено.

Степень разработанности темы

Поиску аллельных вариантов генов, ассоциированных с риском ВТЭ, посвящено много работ отечественных и зарубежных авторов (Баркаган З.С., 2005, Сироткина О.В., 2010, Момот А.П., 2011, Heit J.A., 2007, Dennis J., 2012, Hirmerova

J., 2014). Однако молекулярно-генетическим обоснованиям идиопатического венозного тромбоза, особенно у лиц молодого возраста, в литературе уделено недостаточно внимания. Довольно редко авторы касаются проблемы выявления ассоциативных связей “генотип-фенотип” по клиническому течению (изолированный ТГВ, ТГВ+ТЭЛА) и исходу (рецидив ВТЭ, ПТФС) заболевания. Принимая во внимание высокую частоту распространенности венозных тромбозов в популяции, особый интерес представляет изучение причинно-следственных связей возникновения заболевания и определение маркеров тяжелого течения в отдаленном периоде, а также зависимости исхода от проводимой терапии среди пациентов молодого возраста – наиболее активной и трудоспособной части общества.

Цель исследования

Определить значение наследственных и приобретенных факторов риска ВТЭ для прогнозирования особенностей клинического течения и исхода заболевания у пациентов молодого возраста.

Задачи исследования

1. На основании изучения особенностей аллельного полиморфизма ряда генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, установить наиболее распространенные наследственные факторы риска ВТЭ у пациентов молодого возраста.

2. Оценить частоту встречаемости наследственных и приобретенных факторов риска в общей группе больных с ранним дебютом ВТЭ, а также в зависимости от пола пациентов.

3. Изучить особенности аллельного полиморфизма ряда генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, в подгруппах с различными клиническими проявлениями острого венозного тромбоза.

4. Оценить влияние наследственных и приобретенных факторов риска на исход заболевания (рецидив, степень ПТФС, тип реканализации ТГВ). Определить маркеры тяжести острого ВТЭ и предикторы ПТФС.

5. Оценить отдаленные результаты лечения пациентов молодого возраста с ВТЭ в зависимости от комплаентности терапии.

Научная новизна

Впервые установлен характер распределения аллелей и генотипов генов А-субъединицы фактора XIII (FXIII-А) и -субъединицы фибриногена (FI-A) в группе больных с ВТЭ молодого возраста (до 45 лет, по ВОЗ) и в группе здоровых лиц, представляющих популяцию Северо-Западного региона России. Показано, что самостоятельными наследственными факторами риска ВТЭ у пациентов молодого возраста, помимо общепризнанных мутаций FII 20210G/A (OR=6,3; р=0,0005) и FV 1691G/A (OR=3,8; р=0,0004), являются генотип FI-А 312Ala/Ala (OR=2,4; p=0,02), а также вариант EPCR 219Gly (OR=1,6; р=0,04). У женщин наследственным фактором риска ВТЭ является также генотип FXIII-А 34Leu/Leu (OR=2,5; р=0,023).

Выявлены особенности аллельного полиморфизма изучаемых генов в группах с различными клиническими проявлениями острого ВТЭ (“изолированный ТГВ”, “ТГВ+ТЭЛА”, “изолированная ТЭЛА”). Острые тромбозы глубоких вен с эмболическими эпизодами были характерны для лиц с генотипами FII 20210G/A или/и FXIII-А 34Leu/Leu, тогда как Лейденская мутация (FV 1691G/A), генотипы FXIII-А 34Val/Leu и FI-В -455A/A, а также вариант EPCR 219Gly, в основном, обнаруживались при “изолированном ТГВ”. Впервые показано, что проксимальная локализация ТГВ и развитие ПТФС тяжелой степени ассоциированы с носительством мутаций FII 20210G/A, FV Leiden, а также генотипа FXIII 34Leu/Leu.

Показано, что наличие белка в моче свидетельствует о тяжелом течении острого ВТЭ (проксимальный ТГВ, ТГВ+ТЭЛА). Определены наиболее значимые предикторы тяжелого ПТФС – ожирение, короткие курсы антикоагулянтной терапии, отсутствие компрессионного трикотажа, ипсилатеральный рецидив ТГВ, варикозная болезнь в анамнезе.

Установлено, что независимо от наличия наследственных или приобретенных факторов риска основным условием благоприятного исхода заболевания является максимально раннее начало антикоагулянтной терапии с обеспечением достаточного уровня гипокоагуляции в первые месяцы терапии (при применении варфарина значение МНО в пределах 2,0–3,0).

Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного исследования дополняют и конкретизируют имеющиеся данные по этиопатогенезу ВТЭ и особенностям его клинического течения у пациентов молодого возраста (до 45 лет).

Расширен и обоснован спектр генетических вариантов, выявление которых способствует верификации тромбофилического статуса у молодых пациентов с ВТЭ. Определены дополнительные приобретенные факторы риска ВТЭ, а также генотипы, ассоциированные с развитием тяжелой степени ПТФС. Выявление таких тромбофилических маркеров позволит клиницисту оптимизировать индивидуальный подход к пациенту с определением необходимой длительности антикоагулянтной и компрессионной терапии, что позволит снизить вероятность развития тяжелой степени ПТФС у больных молодого возраста с ВТЭ.

Установлено, что максимально раннее начало терапии с обеспечением достаточного уровня гипокоагуляции (при применении варфарина МНО в пределах 2,0–3,0) именно в первые месяцы лечения является основным условием благоприятного исхода эпизода ВТЭ независимо от наличия наследственных или/и приобретенных факторов риска. Соблюдение данного требования будет способствовать профилактике возникновения рецидива тромбоза и тяжелого ПТФС.

Данные о распределении генотипов изученных генов в здоровой популяции Северо-Западного региона России могут быть использованы в качестве контроля при проведении аналогичных ассоциативных исследований.

Методология и методы исследования

В работе использованы общенаучные (ретроспективный и проспективный анализы данных, сравнительно-сопоставительный синтез) и частные научные методы (клинические, инструментальные, лабораторные, статистические).

Проспективный анализ включал определение частоты встречаемости генотипов ключевых генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, у пациентов с ВТЭ и в группе контроля, а также выявление особенностей их распределения в различных клинических подгруппах больных. В остром периоде заболевания данные, полученные с помощью клинических, инструментальных и лабораторных методов, сопоставлялись с тяжестью первичного эпизода ВТЭ.

Ретроспективный анализ проводился на основе телефонного анкетирования и при личном визите в клинику. Период наблюдения составил до 10 лет с момента дебюта заболевания. Результаты лечения оценивались по характеру течения заболевания (наличие рецидива и тяжелого ПТФС) в зависимости от длительности и качества соблюдаемой терапии.

Для выявления маркеров и предикторов тяжелого исхода ВТЭ была проведена комплексная оценка взаимосвязи полиморфизма изучаемых генов, приобретенных факторов риска и клинико-лабораторных показателей в остром и отдаленном периодах.

Основные положения, выносимые на защиту

6. Наряду с известными детерминантами наследственной тромбофилии – мутациями FII 20210G/A и FV 1691G/A, самостоятельными генетическими факторами риска ВТЭ у пациентов молодого возраста, проживающих в Северо-Западном регионе России, являются варианты FI-А 312 Ala/Ala и EPCR 219Gly, а у женщин также FXIII-А 34 Leu/Leu.

7. Приобретённые факторы риска не обнаруживались в 45,7% случаев ВТЭ у пациентов молодого возраста. Выявление протромботических вариантов генов FII (20210A), FV (1691A), FI-А (312 Ala/Ala), EPCR (219Gly) и FXIII-А (34Leu/Leu) позволяет охарактеризовать причину повышенной индивидуальной склонности к тромбозу у 40,8% больных, в том числе, в 41,8% случаев идиопатического ВТЭ.

8. Аллельный полиморфизм генов FII (20210A), FV (1691A), EPCR (219Gly) и FXIII-А (34Leu/Leu) оказывает влияние на характер клинических проявлений острого ВТЭ, степень реканализации и тяжесть ПТФС.

9. Наиболее значимыми предикторами тяжелого ПТФС у пациентов молодого возраста являются короткие курсы антикоагулянтной терапии (до трех месяцев), ожирение, ипсилатеральное рецидивирование ТГВ и варикозная болезнь в анамнезе.

10. Максимально раннее достижение терапевтического уровня гипокоагуляции снижает риск развития рецидива ВТЭ и тяжелого ПТФС независимо от наличия у пациента наследственных или/и приобретенных факторов риска.

Степень достоверности и апробация результатов диссертации

Достоверность и обоснованность результатов исследования подтверждаются данными, полученными в ходе проспективного и ретроспективного анализа 304 пациентов с ВТЭ в возрасте до 45 лет с применением современных молекулярно-генетических, лабораторных, инструментальных и статистических методов исследования. Основные положения диссертации и полученные результаты были доложены и обсуждены на XVI Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2010 г.), V Санкт-Петербургском Венозном Форуме (2012 г.), 23 (XXVII) Международной конференции “Актуальные вопросы сосудистой хирургии” (Санкт-Петербург, 2012), XVIII конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Стокгольм, 2013 г.), VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2014» (Москва, 2014 г.), XIX конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Милан, 2014 г.), XXV конгрессе Международного общества по тромбозу и гемостазу (Торонто, 2015 г.), Всероссийских конференциях с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011, 2013, 2015 гг.).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в работу клинического отделения хирургической гематологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России и отделения сосудистой хирургии ГБУ СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе, а также используются при обучении интернов и ординаторов в этих учреждениях.

Публикации результатов исследований

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 3 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Роль наследственных тромбофилий в развитии повторных эпизодов ВТЭ и тяжелого посттромбофлебитического синдрома

Несмотря на значительный прогресс в современной медицине, венозные тромбозы остаются актуальной проблемой здравоохранения и характеризуются высоким уровнем заболеваемости, смертности и материальных затрат на их лечение [3]. Еще в 1846 году Virchow R.K. предположил наличие связи между тромбозом глубоких вен нижних конечностей (ТГВ) и тромбоэмболией легочной артерии (ТЭЛА) [169]. Но только в последние десятилетия эти два понятия стали рассматривать в концепции единого причинно-следственного процесса, объединив термином «венозный тромбоэмболизм» (ВТЭ). Общая заболеваемость ВТЭ, по данным Wong P. et al., остается высокой и составляет 1:1000 населения в год [177]. В Российской Федерации показатели заболеваемости ВТЭ, инвалидизации и смертности от тромботических эпизодов, к сожалению, остаются одними из самых высоких в Европе [11].

В поисках патогенетических механизмов ВТЭ в литературе представлено несколько теорий тромбогенеза, в том числе теории воспаления и наследственной предрасположенности. В настоящее время общепринятой является концепция многофакторного патогенеза ВТЭ, предполагающая как наличие внешних или приобретенных факторов риска заболевания (операция, травма, эстрогены, беременность, онкология, иммобилизация и проч.), так и влияние индивидуальных особенностей пациента [44; 172]. В 1856 году Virchow R.K. описал три основных патологических процесса, лежащих в основе тромбогенеза: 1) повреждение эндотелия (эндотелиальная дисфункция); 2) снижение скорости кровотока (венозный стаз); 3) повышенная свертываемость крови (гиперсвертываемость или тромбофилия) [170]. Аутопсии и флебографии стали прямым доказательством того, что тромбоз чаще всего начинает формироваться на клапанах глубоких вен [102]. Прекращение при этом оттока активированных факторов свертывания и притока их ингибиторов провоцируют гипоксию и увеличение гематокрита, что способствует формированию потенциально гиперкоагуляционной микросреды. Однако венозный стаз сам по себе не является достаточным объяснением повышенной склонности к формированию тромбоза в синусах глубоких вен. Например, длительный стаз и резкое замедление кровотока во время сна в норме не приводит к тромбозу. Следовательно, существуют другие факторы, которые в совокупности с замедлением кровотока могут спровоцировать развитие тромботического эпизода [26].

Предположения о возможной роли наследственного фактора в развитии венозного тромбоза возникли еще в середине XX века, когда были описаны случаи обнаружения семейной кластеризации данной патологии [51]. В связи с этим в литературе появился термин «наследственная тромбофилия» (англ. – inherited thrombophilia), изначально использовавшийся в отношении только таких «семейных» случаев ВТЭ. С 1965 года, когда Egeberg О. впервые описал дефицит антитромбина как причину семейной тромбофилии, количество дефектов факторов свертывания, причастных к риску развития венозного тромбоза, значительно увеличилось [51]. Сегодня принято считать, что именно гиперкоагуляционный статус индивида, развивающийся вследствие дисбаланса про- и антитромботических факторов системы гемостаза, лежит в основе подавляющего большинства случаев ВТЭ. [10; 105]. А таким классическим приобретенным факторам риска ВТЭ, как операция, травма, эстрогены, беременность, онкология, иммобилизация и т.д. сегодня, как правило, отводится роль лишь провоцирующего воздействия, способствующего реализации тромбофилического статуса индивида. Роли компонентов плазменного звена гемостаза в патогенезе ВТЭ уделяется особое внимание, поэтому изучение полиморфизма этих генов нам представляется весьма интересным и перспективным. Основным патогенетическим механизмом большинства тромбофилических состояний является избыточный синтез тромбина и нарушение взаимоотношения между (про)тромбином, другими факторами свёртывания, тромбоцитами и элементами сосудистого эндотелия [2; 7; 14]. Мутации в генах, кодирующие различные компоненты системы гемостаза, способствуют изменениям в реологических свойствах крови и приводят к тромбофилии (гиперсвертываемости). В зависимости от участка гена (кодирующего или некодирующего), в котором происходит мутация, меняются соответственно качественные или количественные характеристики того или иного компонента системы гемостаза. Роль полиморфизма исследуемых генов, кодирующих компоненты системы гемостаза, в патогенезе ВТЭ отражена в приложении 1.

Тромбоз - это многофакторное явление, связанное как с ген-генным взаимодействием, так и взаимодействием генотипа с внешней средой, поэтому единой классификации ВТЭ сегодня не существует, а разделение его на «идиопатический» и «спровоцированный» в значительной степени является условным [1; 70; 133].

В настоящее время к «классическим» формам наследственной тромбофилии (НТ) относят лишь дефицит естественных антикоагулянтов (антитромбина III, протеинов C и S), а также мутации в генах факторов V (G1691A, Лейденская мутация) и II (G20210A) (НТ) [54]. Мнение же о причастности к развитию ВТЭ множества других качественных или количественных дефектов различных факторов гемостаза пока остается спорным. Сегодня рядом исследователей разработан перечень клинических ситуаций, косвенно указывающих на возможное наличие генетического фактора риска, предполагающий, таким образом, дальнейшую лабораторную диагностику НТ [19; 54] (Таблица 1).

Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, у мужчин и женщин с ВТЭ

Из общей группы обследованных больных у 250 (82,2 %) человек на базе лаборатории биохимии ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России» (руководитель – д.б.н. С.И. Капустин) было выполнено молекулярно-генетическое типирование полиморфизма 9 генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза: - и -субъединицы FI, FII, FV, FXII, А-субъединицы FXIII, PAI-1, TPA, EPСR. При установлении особенностей генетического профиля группы пациентов с ВТЭ контрольную группу (КГ) составили здоровые люди (191), соответствующие по полу и возрасту исследуемому контингенту больных и не имеющие на момент обследования и в анамнезе тромботических эпизодов. Для оценки возможного влияния генетических факторов на характер клинического течения ВТЭ и отдаленные результаты лечения был проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов изученных генов в различных группах пациентов: в зависимости от пола, клинических проявлений острого ВТЭ (изолированный ТГВ; изолированная ТЭЛА; ТГВ, осложненный ТЭЛА), наличия рецидива заболевания и степени тяжести ХВН, типа реканализации по данным УЗДС нижних конечностей в отдаленном периоде.

Объективное обследование пациентов начиналось с опроса жалоб, семейного и личного анамнеза по ВТЭ, осмотра с оценкой клинической вероятности заболевания. Приобретенные факторы риска выявлялись с помощью анкетирования: телефонного – при ретроспективном анализе, и письменного – при проспективном. На основе анализа данных крупных популяционных исследований по типу «случай-контроль», посвященных проблеме ВТЭ, нами была разработана анкета-опросник для учета наиболее распространенных приобретенных факторов риска ВТЭ [63; 143]. Данный опросник предлагался пациентам, затем по ответам проводился дальнейший анализ (см. Прилож. 2).

Оценка тяжести состояния в отдаленном периоде была основана на жалобах пациента в ходе телефонного опроса и объективных данных при личном визите в клинику. Ориентируясь на клиническую шкалу CEAP0-6, пациентам присваивался один из семи классов, соответствующих: C0 – без видимых признаков заболевания, C1 – телеангиэктазии, ретикулярный варикоз, C2 – варикозное расширение вен, C3 – отек нижней конечности без кожных изменений, C4 – пигментация, венозная экзема или липодерматосклероз, C5 – изменения кожи, зажившие язвы и C6 – изменения кожи с активной язвой [165]. Также мы учитывали документально подтвержденные данные о перенесенном рецидиве ТГВ или/и ТЭЛА. Особое внимание уделялось информации о соблюдении пациентом комплаентности терапии: длительность приема ОАК, уровень поддерживаемой гипокоагуляции (МНО), ношение эластического компрессионного трикотажа.

Для диагностики острого эпизода ТГВ использовалось компрессионное дуплексное ангиосканирование, выполненное на аппарате Siemens (Acuson 128XP/10; Mountain View, CA, USA). Основными УЗИ-критериями подтверждения ТГВ являлись визуализация тромба в просвете вены, несжимаемость вены при прямой ее компрессии линейным датчиком и цветовое картирование венозных сегментов, недоступных к компрессии. Тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) была подтверждена СКТ-пульмографией, которая выполнялась на томографе Light Speed 16 (GE) с в/в введением контраста по стандартной методике, или ангиопульмонографией (Integris V 3000, Philips, Eindhoven, Нидерланды). Критерием в данном случае являлось обнаружение тромбоэмболов с внутрипросветным заполнением легочных артерий (центральных, сегментарных и субсегментарных).

В отдаленном периоде степень реканализации ТГВ оценивалась по максимальному просвету венозного сегмента с помощью билатерального компрессионного ультразвукового дуплексного сканирования вен нижних конечностей.

Также учитывался тип реканализации: полная, неполная (маргинальный и кавернозный), окклюзия. УЗИ-критерии венозной обструкции: отсутствие компрессии, дефекта наполнения в ЦДК и видимого просвета из-за тромба без признаков венозного кровотока. УЗИ-критерии неполной реканализации: вена частично компрессируется, виден просвет тромба, есть признаки спонтанного внутрипросветного кровотока. Маргинальный тип – утолщение стенки вены с уменьшением диаметра просвета; кавернозный – формирование фиброзных «каналов» внутри тромба в виде сот, кровоток в ЦДК смешанный [127]. Полная реканализация: полная компрессия вены, просвет прокрашен цветом в ЦДК, утолщенные стенки вены из-за фиброза не несут анатомических препятствий кровотоку. Патологический рефлюкс в общей бедренной, бедренной и подколенной венах определялся, как 0,5 секунды [94]. Рецидив тромбоза устанавливался на основании сравнения с предыдущими данными УЗДС нижних конечностей, при увеличении диаметра вены, отсутствии компрессии, наличии тромботических масс в просвете вены, утолщении и деформации венозной стенки.

Лабораторные методы диагностики Лабораторное обследование включало общий анализ крови (гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты с лейкоцитарной формулой, СОЭ), биохимический анализ крови (общий белок, альбумины, глюкоза, общий и прямой билирубин, АЛТ, АСТ, ЩФ), коагулограмму (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое и тромбиновое время, концентрация фибриногена, международное нормализованное отношение), общий анализ мочи. При проведении молекулярно-генетического типирования в качестве материала исследования использовали образцы геномной ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови. Идентификацию полиморфизма 9 генов, ассоциированных с активностью плазменного звена гемостаза, осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Аллельные варианты, обусловленные точечными нуклеотидными заменами, определялись с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта – метод ПЦР-ПДРФ (Таблица 4).

Особенности распределения генотипов изучаемых генов у больных с рецидивирующим течением ВТЭ

Выявление протромботических вариантов генов FII 20210G/A и FV 1691G/A, FI-А 312 Ala/Ala, EPCR 219Gly и FXIII-А 34Leu/Leu позволяет охарактеризовать причину повышенной индивидуальной склонности к тромбозу у 40,8 % (n=102) больных (41,2 % мужчин и 58,8 % женщин), в том числе, в 41,8 % случаев идиопатического ВТЭ (n=51).

Носительство полиморфизма различных генов характеризуется гетерогенным клиническим течением заболевания. Так, мы выявили, что, несмотря на сохраняющийся значительный риск развития ТГВ для таких генетических вариантов, как FV Leiden (1691 G/A), EPCR 219 Gly/Gly и FI –455 AA, характерен протективный эффект в отношении риска развития ТЭЛА. Для носителей генотипов FII 20210GA и FXIII Leu34Leu, напротив, свойственно тяжелое течение ВТЭ с явлениями тромбоэмболии. Проксимальная локализация ТГВ свойственна гетерозиготным носителям вариантов FII G202010A (OR=3,5; p=0,017) и FV 1691G/A (OR=1,7; p=0,096), дистальная – гомозиготам по EPCR 219Gly/Gly и FV 1691A/A.

В дополнение, высокий показатель отсутствия внешнего фактора риска ВТЭ (45,7 %) у молодых пациентов дает нам основание предполагать возможно более сильное влияние на развитие заболевания в этой группе наследственной предрасположенности. Наиболее распространенными приобретенными факторами риска были варикозная болезнь (24,3 %), семейный анамнез по ВТЭ (20,1 %), операция (17,4 %), у женщин – прием эстрогенов (20,7 %), беременность (18,9 %).

В отдаленном периоде в сроке до 10 лет нам удалось оценить тяжесть ПТФС у 39,5% случаев (n=120) из общей группы пациентов (n=304). В 55,8 % случаев (n=67) было проведено генетическое исследование на полиморфизм исследуемых генов. Среди этих пациентов 76,1 % перенесли изолированный ТГВ (n=51), 23,9 % - ТГВ, осложненный ТЭЛА (n=16). У 15 больных (22,4 %) заболевание осложнилось тяжелой степенью ХВН (CEAP4-6). При сравнении групп пациентов с легкой и тяжелой степенью ХВН были выявлены значимые различия в распределении генотипов изучаемых генов (Таблица 10). Таблица 10

Распределение генотипов компонентов плазменного звена гемостаза у пациентов с различной степенью тяжести ХВН

Так, риск тяжелой степени ХВН увеличивался более чем в 4 раза при гетерозиготном носительстве мутации 20210G/A в гене протромбина (33,3 % против 7,7 %, OR=4,3; 95 % СI: 1,3–14,1; p=0,01). Доля гетерозигот по FV Leiden в группе тяжелого ПТФС (ХВН по CEAP4-6) также превышала таковую среди пациентов с легкой степенью тяжести ПТФС в 2,5 раза (33,3 % против 13,5 % соответственно, OR=2,6; 95 % СI: 0,9–7,1; p=0,057). Интересна также выявленная нами ассоциация гомозиготного генотипа FXIII 34Leu/Leu с тяжелой степенью ХВН. У носителей этого генотипа наблюдалось 6-кратное увеличение риска развития тяжелого ПТФС (ХВН по CEAP4-6) (13,3 % против 1,9 %, OR=6,9; 95 % СI: 0,70–67,5; p=0,057), что отмечается впервые. Для других генов выраженных различий между группами мы не обнаружили.

Для выявления возможных генетических факторов риска развития повторных эпизодов ВТЭ был проведен анализ особенностей распределения генотипов изучаемых генов в группе пациентов с рецидивирующим течением заболевания. Из общей группы больных, прошедших генетическое типирование полиморфизма 9 изучаемых генов (n=250), в отдаленном периоде был выявлен рецидив ВТЭ в 42 % случаях (n=105). Группу сравнения составили 145 пациента без рецидива ВТЭ. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 11 (Таблица 11.). Таблица 11

По результатам полученных данных, несмотря на высокий процент рецидивов в группе, только носительство нормального генотипа тканевого активатора плазминогена, эндогенного фибринолитика, TPA Del/Del способствовало значимому протективному эффекту от риска рецидива заболевания (ОR=0,4; 95 % CI: 0,2–0,9; p=0,017), что патогенетически оправданно.

В остальных случаях мы не выявили значимых различий в распределении исследуемых генотипов между сравниваемыми группами. Так, частота встречаемости гетерозигот по гену FII (20210 GA) была несколько ниже в группе с рецидивирующим течением ВТЭ (9,5 % против 11,7 % у больных без рецидива). Гетерозиготное носительство FV Leiden практически одинаково часто встречалось среди пациентов с рецидивом заболевания и без такового (15,2 % против 14,6 % соответственно), а гомозиготный вариант данного гена (1691 AA) был выявлен в 2 % случаев в группе без рецидива ВТЭ (n=2). Интересно отметить незначительный протективный эффект против рецидива ВТЭ гетерозиготного варианта FXIII 34 Val/Leu (36,2 % против 46,6 %, OR=0,7; 95 % CI: 0,4–1,2, p=0,19). Напротив, гомозиготный генотип по данному гену (34Leu/Leu) встречался почти в 1,5 раза чаще среди пациентов с рецидивом заболевания (11,4 % против 7,8 %, OR=1,3; 95 % CI: 0,5–3,4, p=0,8). Также в группе с рецидивом ВТЭ было отмечено двукратное увеличение доли гомозигот по варианту EPCR 219Gly (3,8 % против 1,9 %, OR=1,3; 95 % CI: 0,3–10,1, p=0,68). Полученные различия были статистически незначимы, вероятно, из-за небольшой численности исследуемых групп.

Достаточно перспективным представляется изучение ассоциативных связей полиморфизма генов, причастный к риску ВТЭ, со степенью и типом реканализации тромбоза глубоких вен.

Контрольное ультразвуковое исследование через год после перенесенного острого ТГВ удалось провести 49 пациентам, прошедшим генотипирование (19,6 %). Из них изолированный ТГВ (проксимальный/дистальный: 29/7) был выявлен у 36 пациентов (73,5 %), а ТГВ, осложненный ТЭЛА у 13 пациентов (26,5 %). Тромбоэмболические осложнения наблюдались только при проксимальной локализации ТГВ. Почти у половины обследованных пациентов с острым проксимальным ТГВ (иТГВ/ТГВ+ТЭЛА) реканализация протекала по маргинальному типу (n=20; 47,6 %), у 35,7 % (n=15) – по кавернозному типу, окклюзия была диагностирована у 14,3 % (n=6). Дистальный ТГВ спустя год после дебюта заболевания у всех пациентов был полностью реканализован (n=7). Сравнительный анализ распространенности генотипов в зависимости от типа и степени реканализации представлен в таблице 12 (Таблица 12).

Оценка типа реканализации перенесенного ТГВ в отдаленном периоде

Наряду с особенностями в распределении генотипов FXIII мы выявили достоверные различия между полами в частоте встречаемости гетерозигот по гену EPCR с преобладанием данного варианта в 1,5 раза у мужчин с ВТЭ (OR=1,4; 95 % CI: 1,0–3,3; р=0,042). Для остальных генов не было обнаружено статистически значимых различий ни с контрольной группой, ни между больными разного пола.

Одной из задач нашего исследования было оценить особенности аллельного полиморфизма изучаемых генов в зависимости от клинических проявлений ВТЭ (ТГВ, ТЭЛА, ТГВ+ТЭЛА). В литературе превалируют выводы о парадоксальном явлении изолированного течения ТГВ у носителей FV Leiden [164]. Напротив, при наследовании мутации в гене FII 20210G/A характерно тяжелое течение заболевания с явлениями тромбоэмболии [109]. Однако по другим наследственным факторам риска информация об особенностях клинического течения ВТЭ практически отсутствует.

По результатам нашего исследования, мы также получили заметные различия в частоте встречаемости мутаций в генах FV Leiden и FII 20210G/A между клиническими подгруппами. Так, доля гетерозиготных носителей аллеля FV 1691A среди пациентов с изолированным ТГВ в 2,3 раза превышала таковую в группе с явлениями тромбоэмболии легочной артерии (17,5 % против 7,5 %; p=0,12). Тяжелое течение ВТЭ с тромбоэмболическими осложнениями было свойственно гетерозиготным носителям мутации FII 20210G/A (11,3 % против 7,8 %; p=0,40) и гомозиготным носителям варианта FXIII 34Leu (11,3 % против 6,5 %; p=0,45), которые в 1,5 и в 1,7 раза соответственно чаще встречались в группе ТГВ+ТЭЛА, чем в группе изолированного ТГВ. Наши результаты схожи с выводами Martinelli I. et al., которые подтверждают тяжелое течение ВТЭ при носительстве FII 20210G/A, и изолированный ТГВ при наличие в геноме FV Leiden [104]. Аналогичные выводы делают и другие авторы [92; 135].

Интересно отметить протективные свойства некоторых аллельных вариантов от тромбоэмболических осложнений. Так, доля гетерозигот по гену FXIII среди пациентов с неосложненным ТГВ значимо превышала таковую в группе ТГВ+ТЭЛА (47,8 % против 30,2 % соответственно; OR=0,5; 95% CI: 0,2– 0,9; p=0,028). Механизм действия мутации гена FXIII (Val34Leu) способствует утончению волокон фибрина, однако, как влияют гомо- и гетерозиготный варианты данного полиморфизма на различные клинические проявления ВТЭ (ТГВ либо ТЭЛА), остается неясным. Также в группе с изолированным ТГВ преобладали гомозиготные носители аллелей FI –455 G/A и EPCR 219Gly, которые в 1,7 и 2,5 раза встречались чаще, чем в группе ТГВ+ТЭЛА.

Механизм ограничения прогрессирования тромбоза и его эмболизации при носительстве данных генотипов также неизвестен. Большинство исследований свидетельствует о том, что гетерозиготный вариант гена -цепи фибриногена -455 G/A приводит к повышению концентрации фибриногена в плазме, однако не влияет на тромбогенез. Опытным путем было доказано, что полиморфизм гена EPCR Ser219Gly является причиной 5–7-кратного увеличения образования растворенной формы sEPCR [128]. Ассоциация мутации в гене EPCR Ser219Gly с повышением плазменного уровня sEPCR и соответственно со снижением антикоагулянтных свойств протеина C также подтверждалась в нескольких исследованиях [31; 111]. Наряду с этими выводами, была выдвинута гипотеза, что данный полиморфизм за счет повышения уровня sEPCR, влияя на прокоагулянтные и воспалительные процессы, провоцирует тромбообразование [134; 77]. Известно, что EPCR располагается в основном на эндотелиальных клетках крупных артерий и вен с максимальной концентрацией на клапанах и в области синусов глубоких вен [26], обеспечивая тем самым дополнительный тромборезистентный барьер. Однако механизм действия мутации EPCR Ser219Gly в предотвращении нарастания тромбоза также пока не объяснен.

Также мы оценивали связь анатомической локализации ТГВ и изучаемых генотипов. Мы получили значимые различия ЧВ генотипов между проксимальной и дистальной локализации ТГВ. В группе с проксимальным ТГВ статистически значимо преобладала встречаемость варианта FII G202010A (OR=3,5; CI: 0,9-13,4; p=0,01). Для проксимальной локализацией тромбоза также были характерны варианты FV 1691G/A (OR=1,7; p=0,096), FI –455 A/A (OR=3,8; p=0,18) и PAI-1 – 675 4G/5G (OR=1,5; p=0,118). Подобные выводы делает Schulman S., который не находит различий в распределении FV 1691G/A в группах с дистальным и проксимальным ТГВ [135]. Напротив, в исследовании Huisman M.V., et al. наличие генотипа FV 1691G/A ассоциировалось с более дистальной локализацией ТГВ [74]. Однако, несмотря на проксимальную локализацию при наличии в геноме FV 1691G/A в нашем исследовании, тромбоз глубоких вен чаще протекал в изолированной форме и редко осложнялся ТЭЛА, что может также свидетельствовать о гетерогенных свойствах тромба при полиморфизме различных генов. В группе с дистальным ТГВ почти в два раза чаще встречались гомозиготы по FV 1691A/A (OR=0,4; p=0,573) и EPCR 219Gly/Gly (OR=0,6; p=0,51).

Таким образом, можно предположить, что, благодаря различным механизмам действия, носители вариантов FXIII 34 Val/Leu, FV Leiden, EPCR 219 Gly/Gly и FI –455AA, несмотря на повышенный риск тромбоза глубоких вен, защищены от развития тромбоэмболических осложнений. Напротив, наличие в генотипе мутации FII 20210G/A или/и варианта FXIII 34 Leu/Leu характеризуется тяжелым течением ВТЭ с явлениями тромбоэмболии ветвей легочной артерии.

На основании крупных эпидемиологических исследований к наиболее значимым внешним факторам ВТЭ относят операции, в первую очередь, травматологические, травмы, онкологию, ожирение, беременность, прием эстрогенов и т.д. Отсутствие какой-либо конкретной причины в разных исследованиях варьирует приблизительно от 20 % до 40 % [63; 116]. По нашим результатам, среди пациентов молодого возраста в 45,7 % случаев не было найдено какого-либо определенного внешнего фактора, спровоцировавшего заболевание. Наиболее часто встречались варикозная болезнь (24,3 %), операция (17,4 %), у женщин – прием эстрогенов (20,7 %), беременность (18,9 %), семейный анамнез по ВТЭ отмечали 20,1 % пациентов. Такой высокий показатель отсутствия конкретного приобретенного фактора риска ВТЭ у пациентов молодого возраста, вероятно, предполагает более сильное влияние на развитие заболевания наследственных факторов, многие из которых до сих пор не идентифицированы. Выявление протромботических вариантов генов FII 20210G/A и FV 1691G/A, FI-А 312 Ala/Ala, EPCR 219Gly и FXIII-А 34Leu/Leu в нашем исследовании позволило охарактеризовать причину повышенной индивидуальной склонности к тромбозу у 40,8 % больных, в том числе, в 41,8 % случаев идиопатического ВТЭ.