Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Эпидемиология, патогенез, клиника, современные методы диагностики и лечения миелодиспластического синдрома 17
1.1.1. Эпидемиология 17
1.1.2. Патогенез 18
1.1.3. Вопросы диагностики МДС 21
1.1.4. Классификация и прогностические шкалы 24
1.1.5. Риск-адаптированный подход к лечению МДС 27
1.2. Посттрансфузионный гемосидероз при МДС низкого и промежуточного риска как предиктор неблагоприятного прогноза 39
1.2.1. Изменение гомеостаза железа при МДС 39
1.2.2. Влияние гепсидина на гомеостаз железа 41
1.2.3. Посттрансфузионный гемосидероз у пациентов с МДС 47
1.2.4. Влияние перегрузки железом на выживаемость 49
1.3. Роль оксидативного стресса в патогенезе МДС 50
1.3.1. Определение оксидативного стресса 50
1.3.2. Роль свободных радикалов в патогенезе МДС (регуляция апоптоза и пролиферации) 51
1.3.3. Генерация активных форм кислорода в клетках крови и костного мозга при МДС 52
1.3.4. Роль свободного железа в развитии оксидативного стресса при МДС 53
1.3.5. Окислительное повреждение и модификация ДНК 55
1.3.6. Изменение антиоксидантного статуса при МДС 56
1.5. Роль ангиогенеза в патогенезе опухолей 57
1.5.1. Ангиогенез в патофизиологии гемобластозов 57
1.5.2. Ангиогенные и антиангиогенные факторы в патогенезе МДС 58
1.5.3. Биомаркеры ангиогенеза как предикторы неблагоприятного прогноза при опухолевых процессах 59
1.5.4. Влияние иммуномодуляторов и гипометилирующих препаратов на процессы ангиогенеза 66
1.6. Т-клеточный иммунитет при МДС 68
1.6.1. Влияние Т-клеточного иммунитета на состояние гемопоэтических клеток 68
1.6.2. CD4+CD25+FOXP3+ регуляторные клетки в МДС 74
1.6.3. Иммунологические свойства препарата леналидомид 78
Глава 2. Материалы и методы исследования 81
2.1. Клиническая характеристика пациентов 81
2.2. Метод исследования радикал-продуцирующей активности нейтрофилов 86
2.3. Определение экспрессии генов факторов роста эндотелия сосудов VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 87
2.4. Метод ПЦР в определении Т-клеточного звена 87
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 90
Глава 3. Сравнительная эффективность различных схем гипометилирующей терапии при МДС 91
3.1. Сравнительная эффективность трех- и пятидневных схем лечения препаратом децитабин у пациентов с МДС 93
3.2. Клиническая эффективность препарата азацитидин у пациентов с МДС промежуточного 2 и высокого риска прогрессирования в острый лейкоз 100
3.3. Сравнительная эффективность различных режимов гипометилирующей терапии у пациентов с МДС промежуточного 2 и высокого риска 107
Глава 4. Диагностика посттрансфузизионного гемосидероза и коррекция гемотрансфузионных осложений у пациентов МДС низкого и промежуточного 1 риска как предикторов общей выживаемости 117
4.1. Клиническая оценка влияния изменения гемопоэза железа на прогрессию посттрансфузионного гемосидероза 118
4.2. Алгоритм гемотрансфузионной терапии как предиктор коррекции посттрансфузионных осложнений 125
Глава 5. Изменение радикал-продуцирующей активности нейтрофилов у гемотрансфузионо зависимых пациентов с МДС в клинической практике и эксперименте 130
5.1. Снижение радикал-продуцирующей активности нейтрофилов как предиктор неблагоприятного прогноза прогрессии МДС 134
5.2. Радикал-продуцирующая активность нейтрофилов как параметр для индивидуального подбора протокола гемотраснфузионной терапии( ГЗТ) при миелодиспластическом синдроме 137
Глава 6. Экспрессия генов факторов роста эндотелия сосудов VEGF и их рецепторов VEGFR в костном мозге и крови больных миелодиспластическим синдромом (МДС) и у здоровых доноров 149
6.1. Значение экспрессии генов фатора роста эндотелия сосудов VEGF-A и его рецепторов VEGFR1 И VEGFR2 в диагностике Миелодиспластического синдрома (МДС) 150
6.2. Изучение экспрессии генов факторов роста эндотелия сосудов VEGF и их рецепторов VEGFR в крови пациентов с миелодиспластическим синдромом (МДС) и здоровых доноров 155
6.3. Оценка эффективности леналидомида у пациентов с миелодиспластическим синдромом (МДС) высокого риска, частично резистентных к гипометилирующей терапии 187
Глава 7. Анализ экспрессии изоформ молекулы FOXP3 регуляторными Т клетками периферической крови при миелодиспластическом синдроме 191
Глава 8. Обсуждение полученных результатов и заключение 202
Выводы 238
Практические рекомендации 240
Список литературы 241
- Патогенез
- Биомаркеры ангиогенеза как предикторы неблагоприятного прогноза при опухолевых процессах
- Алгоритм гемотрансфузионной терапии как предиктор коррекции посттрансфузионных осложнений
- Анализ экспрессии изоформ молекулы FOXP3 регуляторными Т клетками периферической крови при миелодиспластическом синдроме
Патогенез
Большой вклад в понимание патогенеза и объединение вариантов МДС внесла эпигеномная концепция, описывающая роль гиперметилирования ДНК и нарушения ацетилирования гистонов в выключении функции генов онкосупрессоров [2]. Воздействие химических факторов окружающей среды, таких как бензол, инсектициды и пестициды, могут способствовать развитию МДС. Следует отметить, что у пациентов с развитием МДС на фоне противоопухолевого лечения (приблизительно 15-20% случаев) генетическое повреждение возникает после перенесенного радиационного облучения и/или химиотерапии [272,304]. В последние годы существенно расширилось понимание молекулярных нарушений при МДС. Типичные (повторяющиеся) мутации, идентифицированные в ряде генов, уже достаточно изучены. Метилирование генов-онкосупрессоров рассматривают как один из ключевых механизмов развития МДС. К настоящему времени приблизительно у 90% пациентов с МДС удается обнаружить как минимум одну мутацию указанных генов [11,40,43,302].
МДС обычно диагностируется у пожилых людей при обследовании по поводу необъяснимых периферических цитопений. Предполагается, что генетические повреждения, накапливающиеся с возрастом, приводят к разрегуляции некоторых клеточных процессов, включая:
Эпигенетическую регуляцию — TET2, IDH1 и 2, DNMT3, ASXL1 и EZH2,
Процессы сплайсинга РНК — SF3B1, SRSF2, U2AF35, ZRSR2,
Ответ на повреждение ДНК — TP53[305]
Тирозин-киназный путь передачи сигналов- JAK2, RUNX1, KRAS, NRAS, BRAF, FLT3 [11,117,292].
С помощью секвенирования нового поколения было показано, что повторные соматические мутации наблюдаются более чем у 90% пациентов с МДС, при этом количество мутаций является независимым прогностическим фактором [213,289]. Следует отметить, что эти мутации могут возникать приблизительно у 10% здоровых людей, хотя и с меньшим количеством аллельных нарушений. Эти повторно мутирующие гены участвуют в эпигенетической регуляции (TET2, ASXL1, EZH2, DNMT3A, IDH1, IDH2), сплайсинге РНК (SF3B1, SRSF2, U2AF35, ZRSR2), восстановлении поврежденных ДНК (TP53), транскрипционном регулировании (RUNX1, BCOR, ETV6), передаче сигналов (CBL, NRAS, JAK2) и в когезиновом комплексе (STAG2). Клиническое значение при МДС имеют мутации генов DNMT3A, TET2, 1DH1/2, ASXL1, EZH2 [62,283,284,285,286,287,288,].
Роль ДНК метилтрансфераз (DNMT3A и DNMT3B) заключается в присоединении метильной группы к цитозиновому концу ДНК в положении 5 в конце динуклеотидов CG. Мутации DNMT3A возникают у приблизительно 10% пациентов с МДС, при этом наиболее распространена мутация R882 (40-60%), стимулирующая фермент, отвечающий за гиперметилирование ДНК. После лечения ингибиторами DNMT (5-азацитидин, децитабин) общий уровень метилирования становится сходным с таковым DNMT3A в ДНК дикого типа [212,289].
Группа ферментов TET (TET1, TET2, TET3) окисляют 5-метилцитозин до 5-гидроксиметилцитозина в -кетоглутарат-зависимой ферментативной реакции. Мутации TET2 с утратой функции влияют на его каталитическую активность, что приводит к накоплению 5-метилцитозина. Сведения о том, приводят ли мутации ТЕТ2 к гиперметилированию ДНК, противоречивы [43,199,214]. Тем не менее было доказано, что мутация TET2 позволяет прогнозировать ответ на терапию ингибиторами DNMT при МДС [44,163].
Наличие мутации 1DH1/2 приводит к выработке 2-гидроксиглутуарата, который по структуре схож с -кетоглутаратом, и, следовательно, осуществляет конкурирующее подавление -кетоглутарат-зависимых ферментативных процессов. К таковым относится подавление обоих ферментов TET и -кетоглутарат-зависимой группы JMJC-содержащих деметилазы гистонов. Известные в настоящее время мутации 1DH затрагивают 4-й экзон и повреждают
Три специфические аргининовых остатка: R132 (IDH1), R172 (IDH2), и R140 (IDH2) [45].
В исследовании, проведенном Bejar и соавторами, мутации EZH2, RUNX1, TP53, и ASXL1 были связаны со снижением общей выживаемости вне зависимости от LR-MDAS [49]. Однако только мутации EZH2 в этом исследовании сохраняли прогностическую значимость в мультивариантном анализе. Впоследствии, когда статус мутации EZH2 совмещали с LR-PSS, было выявлено, что у 29% пациентов с МДС в группе с низким риском отмечался прогноз "хуже, чем ожидалось". В другом исследовании перед трансплантацией был проведен молекулярный анализ и мутации TP53, TET2 и DNMT3A были определены в качестве неблагоприятных прогностических факторов после трансплантации [50,51,96].
Согласно результатам работы российских исследователей, при уточнении ассоциации статуса метилирования генов SOX7, p15INK4b, SFRP1, SFRP4 и SFRP5 с отдельными клинико-гематологическими показателями и общей выживаемостью аберрантное метилирование одного и более генов было обнаружено у 43 (93,5%) больных. С наибольшей частотой выявлялось метилирование генов SOX7 (84,8 % больных), SFRP1 (71,7% больных) и p15INK4b (54,3% больных). Метилирование гена SFRP5 было более частой находкой у больных рефрактерной анемией с избытком бластов (РАИБ): 43,5% против 13,0%. У больных без бластоза чаще выявлялись случаи с 0–1 метилированным геном: 26,1 % против 8,7 % у больных РАИБ. Авторами сделано заключение об увеличении объема эпигенетических нарушений по мере прогрессии МДС с повышением числа генов с аберрантным метилированием, в частности, гена SFRP [11,15].
Таким образом, понимание генетических процессов при МДС создает широчайшие возможности для совершенствования методов диагностики и создания инновационной таргентной терапии. Мониторинг остаточной болезни и изучение индикаторов резистентности необходим для поиска прогностических факторов и поиска новых лечебных подходов [241].
Биомаркеры ангиогенеза как предикторы неблагоприятного прогноза при опухолевых процессах
При изучении данных литературы по данному вопросу можно увидеть, что патологический ангиогенез изучен при многих онкологических заболеваниях. Так, биомаркеры ангиогенеза служат негативными прогностическими факторами при раке щитовидной железы, яичников и опухолях желудочно-кишечного тракта, множественной миеломе [181]. Судя по имеющимся экспериментальным данным, при МДС формирование новых сосудов является необходимым шагом для обеспечения адекватного кровотока КМ в многоэтапном процессе злокачественной трансформации. Показано, что архитектоника костномозговых микрососудов при МДС имеет нерегулярный характер и морфологически они отличны от тех, которые присутствуют в КМ здоровых доноров. УПМ костного мозга значимо повышается при МДС и ОМЛ, что говорит о выраженной неоваскуляризации КМ [298]. По данным измерений плотности микрососудов КМ, у пациентов с рефрактерной цитопенией с однолинейной дисплазией наиболее низкий показатель УПМ по сравнению с другими подтипами МДС. Функциональную значимость этого факта еще предстоит выяснить [251]. Оценка УПМ может быть полезной в предсказании ответа на терапию у пациентов с МДС. Так, непосредственно в момент диагностики и через 3 месяца после назначения терапии гипометилирующими агентами у пациентов со сниженной либо неизмененной плотностью микрососудов КМ наблюдали лучший ответ на терапию по сравнению с пациентами с повышенной плотностью микрососудов КМ [318]. При этом, по данным Savic. и соавт., повышенная УПМ ассоциирована с меньшей выживаемостью, но не является независимым прогностическим признаком при мультивариантном анализе [268]. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) играет значимую роль в ангиогенезе
Предположительно, при онкогематологических заболеваниях продукция и высвобождение этого фактора может вносить вклад в возникновение неэффективного гемопоэза. Избыточная экспрессия VEGF в КМ и повышение его концентрации в плазме наблюдается у пациентов с ОМЛ, что является для них достоверным независимым прогностическим фактором течения заболевания [162]. В норме CD34+-клетки КМ не экспрессируют VEGF, в то время как созревающие миелоидные клетки в различной концентрации содержат этот ростовой фактор в цитоплазме. В костном мозге при МДС VEGF присутствует как в CD34+ -клетках, так и в миелоидных клетках на разных стадиях созревания, а также миелодиспластических эритробластах [267]. В недавней работе Invernizzi R и соавт. продемонстрировали, что при МДС экспрессия VEGF в КМ повышена по сравнению с контролем. Высвобождение VEGF клетками КМ при культивировании in vitro было максимальным при МДС низкого риска. По данным авторов высокий уровень VEGF в миелоидных клетках независимо коррелирует с более длительным общим выживанием и выживанием без прогрессирования, что является противоположностью его прогностического значения при солидных опухолях [162].
Была обнаружена положительная корреляция между VEGF в миелоидных клетках и апоптозом этих клеток. Вероятно, это связано с прямым действием VEGF на транскрипцию генов в этих клетках и/или изменением цитокинового микроокружения под влиянием VEGF. Это приводит к снижению жизнеспособности клеток миелоидного и эритродного ростков и, как следствие, к недостаточности гемопоэза [77,78]. Тем не менее, ранее нескольким коллективам исследователей не удалось обнаружить достоверного повышения в экспрессии VEGF в парафиновых образцах КМ пациентов с МДС и различий по этому показателю между разными группами риска по IPSS [258]. Впрочем, хотя плотность микрососудов КМ и экспрессия VEGF не отличается у пациентов с МДС разных групп риска по шкале IPSS, но пациенты с низким риском имеют тенденцию к менее выраженной экспрессии биомаркеров ангиогенеза [258,267]. Для окончательного вывода о значении биомаркеров ангиогенеза в патогенезе МДС необходимо прояснить принципиальные противоречия, полученные в работах разных авторов. Количественная оценка отдельных компартментов микроциркуляторного русла требует установления их специфических иммунофенотипов.
В то время как в большинстве работ оценивали в основном капиллярную сеть (при помощи маркеров CD34, реже CD31), в исследовании Ewalt M. и соавт. были качественно и количественно охарактеризованы микрососуды обеих разновидностей в биоптатах КМ у пациентов с МДС по сравнению с пациентами с доброкачественными цитопениями. Маркеры CD34, и в особенности нестин, были наиболее специфичны для капилляров, CD105 выступал как специфический маркер синусоидов КМ [105]. Плотность капилляров КМ при МДС была неотличима от контроля, тогда как плотность синусоидов оказалась на 50% выше у пациентов с МДС. Следовательно, при МДС наблюдается селективная экспансия синусоидного компартмента, что подтверждает неодназначность вклада различных отделов микроциркуляторного русла в формирование дисфункционального клеточного клона при МДС [106]. Ангиогенная активность зависит от соблюдения баланса активирующих и ингибиторных регуляторных цитокинов. VEGF и bFGF считают главными активирующими факторами ангиогенеза. Фактор роста эндотелия сосудов VEGF - это димер молекулярной массой 34-42 кДа, обладающий 15-25% гомологией с тромбоцитарным фактором роста PDGF; он был впервые клонирован из лейкозных клеток линии HL6, а позднее найден и в других линиях лейкозных клеток. [60,298] Он принадлежит к генному семейству, которое также включает в себя плацентарный фактор роста (PLGF), VEGF-B, VEGF-C и VEGF-D. VEGF-A регулятор роста кровеносных сосудов, тогда как VEGF-C и VEGF-D регулируют лимфоангигенез. VEGF действует также и на клетки костномозгового происхождения: стимулирует хемотаксис моноцитов, индуцирует образование колоний гланулоцитарно-макрофагальными клетками-предшественниками, усиливает образование В-клеток и незрелых миелоидных клеток. Рецепторы VEGF являются тирозинкиназами; к ним относят VEGFR1 и VEGFR-2, которые состоят из 7 иммуноглобулин-подобных доменов и внеклеточного домена, единственной трансмембранной цепи и тирозинкиназной последовательности, которая прерывается на вставной киназный домен. VEGFR-3 не является рецептором для VEGF-A и -B. [113] Различия в паттернах экспрессии этих рецепторов в разных тканях и клеточных линиях указывает на то, что у каждого из них есть своя уникальная физиологическая роль. VEGF и его рецепторы обнаружены и в клетках костномозгового происхождения. Bellamy и соавт. (1999) изучали профиль экспрессии VEGF и его рецепторов в биоптатах костного мозга у пациентов с МДС. Экспрессия VEGF не характерна для биоптатов нормального костного мозга, в отличие от биоптатов МДС И ОМЛ. В этом исследовании было сделано два значимых открытия: (1) VEGF распределен диффузно в цитоплазме миелоидных и моноцитарных клеток-предшественников; (2) мРНК VEGF присутствует исключительно в неопластических миеломоноцитарных клетках. [46] Это согласуется с другим исследованием тех же авторов, где было показано повышение экспрессии VEGF у пациентов с ОМЛ по сравнению с МДС (82% vs 76%). [22] Присутствие VEGF и его рецепторов в микроокружении гемопоэтических клеток КМ (строма, эндотелиоциты, лейкозные бласты) и способность VEGF стимулировать образование лейкозных колоний позволяет предположить существование аутокринного и паракринного порочного круга, дающего лейкозным клеткам преимущество в выживании [162]. Внося свой вклад в развитие лейкоза, самообновление предшественников злокачественного клона и выработку провоспалительных цитокинов, ангиогенные факторы могут влиять на дифференцировку и апоптоз клеток при ОМЛ и МДС. Базовый фактор роста фибробластов (bFGF) - член семейства, состоящего из 9 близких по структуре полипептидных митогенов. Ген bFGF у человека локализован на хромосоме 4 и состоит из 3 экзонов и 2 протяженных интронных последовательностей [9]. bFGF участвует в патологическом неоангиогенезе при МДС вместе с другими про- и антиангиогенными молекулами: фактором некроза опухолей (TNF), трансформирующим фактором роста (TGF), фактором роста гепатоцитов (HGR), ангиогенином [24,25]. Как и в случае с VEGF и bFGF, повышение уровня этих молекул влияет на прогноз заболевания при некоторых солидных опухолях. Aguayo и соавт. (2002) измеряли уровень VEGF и bFGF в периферической крови пациентов МДС и ОМЛ, не получавших лечения. В обеих группах было обнаружено повышение уровня указанных факторов в плазме крови.
Алгоритм гемотрансфузионной терапии как предиктор коррекции посттрансфузионных осложнений
До настоящего времени основным критерием назначения эрироцитарной массы, согласно многочисленным рекомендациям, является уровень гемоглобина. В некоторых работах при назначении гемотрансфузионной терапии рекомендовано учитывать состояние пациента по шкале ЕСОG и индекс коморбидности. Анализ данных литературы и собственный опыт убеждают с том, что научная разработка этой проблемы актуальна и в результате использования эритроцитсодержащих компонентов крови в строгой потребности и с учетом возможных осложнений, может увеличиться как ОВ, так и качество жизни у пациентов с МДС. В связи со сложностью и многогранностью данной проблемы возникает необходимость в формировании принципов гемотрансфузионных подходов при коррекции анемического синдрома МДС, в частности с учетом уровня гепсидина, как маркера контроля за гомеостазом железа.
Проведенный анализ зависимости уровня ферритина от продукции гепсидина показал, что в отсутствие специфического подбора эритроцитов, трансфузии ведут к изменению комплементарной системы гепсидин-ферритин в сторону уменьшения уровня гепсидина, усиливающее степень сидероза. Объяснить это явление можно тем, что, вероятнее всего, поступление свободного железа в организм с каждой дозой эритроцитарной массы не имеет возможности контролироваться продукцией гепсидина. Что в свою очередь не может препятствовать гемосидерозу печени, гибели гепатоцитов, с еще большей неспособностью печени продуцировать гепсидин. Появление в кровеносном русле определенного количества гемолизированных эритроцитов способствует развитию оксидативного стресса, оказывающего однозначно негативное действие на функцию гепатоцитов. Возможно, данная ситуация может быть разрешена проведением подобным больным высокоспецифичного подбора компонентов крови и раннего индивидуального подбора дозы хелаторной терапии.
Исследование общей выживаемости больных МДС с глубокой гемотрансфузионной зависимостью от момента начала гемотрансфузионной терапии до окончания наблюдения (период наблюдения 5 лет) показало, что существует явная зависимость между повышением уровня СФ, количеством трансфузий и длительностью жизни пациентов. Повышение сывороточного ферритина является крайне неблагоприятным фактором, ведущим к развитию клиники посттрансфузионного гемосидероза и влияющим и на качество жизни пациента, и на прогрессию заболевания. Полученные данные изменения корреляции ферритина/гепсидина могут свидетельствовать об истощении функциональных резервов гепатоцитов, а также о возможном ускоренном отложении железа в печени. Было высказано предположение, что в чрезмерно быстрой прогрессии гемосидероза может сыграть роль измененная продукция гепсидина. Что однозначно негативно сказывается на качестве жизни пациентов вследствие прогрессирования синдрома перегрузки железом. Контроль гепсидина необходим каждые три месяца вместе с определением уровня ферритина для своевременного назначения хелаторов железа. Наиболее значимым фактором ускорения развития перегрузки железом является отсутствие специфического подбора эритроцитной массы для гемотрансфузионно зависимых больных.
На основе анализа собственных данных и данных литературы для оценки возможности нивелирования гемотрансфузионного риска мы предлагаем следующий лабораторный показатель: Прогностический индекс гемотрансфузионого риска.
В последнее время произошли существенные изменения в законодательстве Российской Федерации в области использования эритроцитсодержащих компонентов крови. Значительно расширен спектр иммуногематологических исследований как у доноров, так и у реципиентов. Данные меры направлены на профилактику постгеморрагических осложнений, в основном за счет профилактики аллосенсибилзации. Однако аллосенсибилизация является не единственным осложнением в группе пациентов, находящихся на постоянной гемотраснфузионной поддержке. Создание данного алгоритма гемотрансфузионной терапии позволяет учитывать достаточно много факторов, влияющих на возможность гемотрансфузионных осложнений, а значит способствует удлинению продолжительности жизни пациентов низкого риска с МДС с значительным улучшением качества жизни.
Анализ экспрессии изоформ молекулы FOXP3 регуляторными Т клетками периферической крови при миелодиспластическом синдроме
Миелодиспластический синдром (МДС) представляет собой гетерогенную группу клональных заболеваний, вызванных нарушением созревания стволовых клеток, специфических признаком которых является периферическая цитопения вследствие неэффективного кроветворения с нормальной или повышенной клеточностью костного мозга. Клинические проявления, течение и исход МДС очень разнообразны, а медиана выживаемости варьируется от 6 месяцев до 5 лет [20]. MДС всегда рассматривался через призму клональной экспансии гемопоэтической клетки-предшественника с дальнейшим риском трансформации в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) примерно у 30–40% пациентов [8]. Несмотря на существование шкал прогнозирования с четко определенной прогностической структурой, основанной на цитологических и цитогенетических лабораторных параметрах, течение заболевания и прогрессирование лейкозной инфильтрации очень часто непредсказуемы. Проблема прогнозирования острого лейкоза, в свою очередь, затрудняет выбор тактики лечения. Количество клинических исследований, направленных на изучение новых подходов к стратификации риска прогрессирования заболевания, растет с каждым годом.
Учитывая, что иммунная система играет активную роль в патогенезе МДС, можно предположить, что некоторые иммунологические параметры, например, количество регуляторных Т-клеток (Treg), могут использоваться в качестве прогностических критериев. В какой-то мере участие Treg в патогенезе MDS может объяснить связь этого заболевания как с аутоиммунными расстройствами [57], так и с трансформацией опухолевых клеток [224], учитывая, что уменьшение количества и снижение функции Treg приводят к слабому подавлению избыточного иммунного ответа, в то время как большое количество Treg и их повышенная функция могут привести к нарушению иммунного контроля за ростом опухоли.
Большинство проведенных исследований связывают увеличение количества Treg с неблагоприятным прогнозом MДС [57,187,190]. Несмотря на аналогичный вывод в этих исследованиях, данные, полученные по количеству Treg в MДС, были довольно противоречивыми, вероятно, относящимися к различным протоколам подготовки образцов и стратегиям стробирования, используемым в анализе проточной цитометрии [222]. Это предположение косвенно подтверждается различиями в частоте Treg у здоровых доноров, подобранных по возрасту.
Были также предприняты попытки использовать функциональные характеристики Treg в качестве прогностического критерия для MДС. Mailloux et al. продемонстрировали, что увеличение количества Treg с фенотипом эффекторных T-клеток коррелирует с плохим прогнозом MДС, таким как трансформация в острый миелоидный лейкоз и низкая выживаемость. Однако полученные результаты могут быть не столько прогностическим критерием, сколько отражением конкретной стадии заболевания.
Прежде чем рассматривать функциональные характеристики Treg в качестве прогностического критерия для MДС, следует обратить внимание, что основным регулятором дифференцировки и функции Treg является фактор транскрипции FOXP3 [280]. Таким образом особенности его экспрессии должны оказывать существенное влияние на функцию Treg. В исследованиях, в которых изучалась молекулярная структура FOXP3 было установлено, что у людей, альтернативный сплайсинг приводит к образованию четырех вариантов мРНК и четырем изоформам FOXP3: полноразмерная молекула (FOXP3-FL); с делецией экзона 2 (FOXP32); с делецией экзона 7 (FOXP37); и с одновременным удалением экзонов 2 и 7 (FOXP327) [308]. В не так давно опубликованном обзоре [210] Mailer R. подробно анализирует биологию альтернативного сплайсинга FOXP3 и специфические функции изоформ FOXP3. Функциональная значимость областей, кодируемых удаленными экзонами, различна. Кратко излогая, экзон 2 кодирует домен FOXP3, ответственный за связывание транскрипционных факторов семейств ROR и RORt, которые определяют провоспалительную Th17-поляризацию иммунного ответа; экзон 7 кодирует последовательность, ответственную за димеризацию FOXP3, а его отсутствие нарушает функцию супрессии Treg [208]. Существенной особенностью молекул FOXP3, в которых отсутствуют экзон 2 и 7, является их преимущественная локализация в ядре: Magg et al. показали, что они теряют сигналы ядерного экспорта (NES) последовательностей, расположенных в областях, кодируемых экзонами 1/2 и 6/7 [316]. Данная группа авторов также продемонстрировала, что экспрессия FOXP3 в основном обнаруживается в цитоплазме при активации наивных CD4+CD25- T-клеток, в отличие от преимущественной локализации в ядре в CD4+CD25+ Treg. Локализация FOXP3 в ядре очень важна для его функционирования в качестве активатора и супрессора транскрипции. Следовательно, можно предположить, что FOXP32, который обладает функцией супрессора и расположен преимущественно в ядре, является доминирующей изоформой, определяющей функциональную активность Treg.
Учитывая несоответствие имеющихся данных о количестве Treg, их потенциально важной роли в патогенезе MДС и функциональных различиях между экспрессиями изоформ FOXP3, мы решили оценить не только количество и процент Treg при этом заболевании, но также и уровень экспресии изоформ FOXP3 у пациентов с различными формами МДС.
В данное исследование включены 76 пациентов с верифицированным диагнозом МДС в соответствии с критериями классификации ВОЗ новообразований кроветворной и лимфоидной тканей от 2008 г. (табл. 34). Из них 14 пациентов с рефрактерной анемией (РА), 6 – с изолированной делецией длинного плеча 5-й хромосомы (5q-), 5 – c рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами (РАКС), 17 – с рефрактерной цитопенией с мультилинейной дисплазией (РЦМД), 15 – с рефрактерной анемией с избытком бластов 1 (РАИБ-1), 19 – с РАИБ-2. У 48 пациентов отсутствовали изменения кариотипа, 28 имели следующие хромосомные аномалии: 6 пациента – 5q-, 4 – 7q-, 2 – 20q-, 2 – Y-, 8 – патологию двух хромосом, 6 – более трёх клональных перестроек кариотипа. Согласно системе IPSS,пациенты соответствовали группам низкого риска – 19, промежуточного-1 риска – 12, промежуточного-2 риска – 19, и высокого риска – 26 человек.Они были разделены на 3 группы: первичные (MDS-primary); ранней стадии (E-MDS); поздней стадии МДС (L-MDS). Первичная группа пациентов представлена пациентами с впервые выявленным диагнозом до начала лечения. В группу E-MDS вошли пациенты, набравшие меньше 1,5 баллов по Международной прогностической бальной системе (IPSS – International Prognostic Scoring System), в группу L-MDS – пациенты, набравшие больше 1,5 баллов. Группа MDS-primary – 21 человек (14 женщин, 7 мужчин), медиана возраста – 72,0 (64–76,5) года. Из них - 12 низкого и промежуточного 1 риска (E-MDS), 9–промежуточного 2 и выского риска (L-MDS). Группа E-MDS – 27 человек (15 женщин, 12 мужчин), медиана возраста – 71,5 (64–76) года. Группа L-MDS – 28 человек (12 женщин, 16 мужчин), медиана возраста – 68,5 (63–73) года. Группа возрастного контроля – 26 человек (15 женщин, 11 мужчин), медиана возраста – 72 (48–79) года. Таким образом, характеристики пациентов по возрасту и полу были близки между собой и соответствовали группе возрастного контроля. Все пациенты из групп E-MDS и L MDS имели гемотрансфузионную зависимость. Степень гемотрансфузионной нагрузки колебалась от 2–3 до 5–6 доз эритроцитарной массы в месяц. Стаж переливания эритроцитарной массы от 4 месяцев до 5 лет. Исследование проводили до назначения гипометилирующей или цитостатической терапии.