Особенности аллельного полиморфизма генов цитокинов у больных множественной миеломой Павлова Анастасия Александровна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1 Обзор литературы 13

1.1. Цитокины и полиморфизм генов цитокинов 13

1.2. Роль цитокинов в развитии множественной миеломы . 22

ГЛАВА 2 Объект, материалы и методы исследования

2.1. Объект исследования 36

2.1.1. Характеристика контрольной группы 36

2.1.2 Характеристика группы пациентов 36

2.2. Использованные реактивы 38

2.3. Выделение геномной ДНК из ядросодержащих клеток периферической крови 38

2.4. Геномное типирование 2.4.1. Геномное типирование полиморфного участка -889 C/T (rs1800587) в гене IL-1 45

2.4.2. Геномное типирование полиморфного участка – 511 C/T (rs 3087258) в гене IL-1 45

2.4.3. Геномное типирование полиморфного участка + 3962 C/T (rs 1143634) в гене IL-1 46

2.4.4. Геномное типирование полиморфного участка pst11970 C/T (rs

2234650) в гене IL-1R 46

2.4.5. Геномное типирование полиморфного участка mspa1 11100 T/C (rs 315952) в гене IL-1RA 47

2.4.6. Геномное типирование полиморфного участка +1902 A/G (rs 1801275) в гене IL-4R 47

2.4.7. Геномное типирование полиморфного участка -1188 C/A (rs 3212227) в гене IL-12 48

2.4.8. Геномное типирование полиморфного участка +874 A/T (rs 2430561) в гене IFN- з

2.4.9. Геномное типирование полиморфного участка сodon 10 T/C (rs 1800470) в гене TGF-1 49

2.4.10. Геномное типирование полиморфного участка сodon 25 G/C (rs 1800471) в гене TGF-1 49

2.4.11. Геномное типирование полиморфного участка -308 G/A (rs 1800629) в гене TNF- 50

2.4.12. Геномное типирование полиморфного участка -238 G/A (rs 361525) в гене TNF- 50

2.4.13. Геномное типирование полиморфного участка -330 T/G (rs 2069762) в гене IL-2 51

2.4.14. Геномное типирование полиморфного участка +166 G/T (rs 2069763) в гене IL-2 51

2.4.15. Геномное типирование полиморфного участка -1098 T/G (rs 2243248) в гене IL-4 51

2.4.16. Геномное типирование полиморфного участка -590 C/T (rs 2243250) в гене IL-4 52

2.4.17. Геномное типирование полиморфного участка -33 C/T (rs 2070874) в гене IL-4 52

2.4.18. Геномное типирование полиморфного участка -174 G/C (rs 1800795) в гене IL-6 53

2.4.19. Геномное типирование полиморфного участка nt565 G/A (rs 1800797) в гене IL-6 53

2.4.20. Геномное типирование полиморфного участка -1082 A/G (rs 1800896) в гене IL-10 54

2.4.21. Геномное типирование полиморфного участка -819 C/T (rs 1800871) в гене IL-10 54

2.4.22. Геномное типирование полиморфного участка -592 C/A (rs 1800872) в гене IL-10 55 2.5. Статистическая обработка полученных результатов 55

ГЛАВА 3 Собственные результаты исследования ... 57

3.1. Полиморфизм генов цитокинов в популяции здоровых жителей Северо-Западного региона России 57

3.1.1. Сравнение полиморфизма генов цитокинов здорового населения Северо-Западного региона России с народами других стран Мира 60

3.2. Полиморфизм генов цитокинов у больных множественной миеломой

3.2.1. Взаимосвязь однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов и клинико-лабораторных показателей у больных множественной миеломой 75

3.2.2. Роль однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов в развитии костной болезни у больных множественной миеломой 95

3.2.3. Взаимосвязь однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов и иммунохимического варианта множественной миеломы 105

ГЛАВА 4 Обсуждение 116

Выводы 131

Практические рекомендации 132

Список литературы

• Роль цитокинов в развитии множественной миеломы
• Использованные реактивы
• Геномное типирование полиморфного участка +874 A/T (rs 2430561) в гене IFN- з
• Сравнение полиморфизма генов цитокинов здорового населения Северо-Западного региона России с народами других стран Мира

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Множественная миелома (MM) – наиболее часто встречающаяся форма парапротеинемических гемобластозов. Это заболевание отличается вариабельностью клинических проявлений, форм и вариантов течения, что обусловлено как особенностями клеток опухолевого клона, так и резистентностью организма индивидуума к развитию неоплазии [Черныш Н.Ю. и др., 2009]. В развитии множественной миеломы наряду с генетическими поломками и нарушениями нормального функционирования костномозгового микроокружения существенную роль играет и недостаточная эффективность противоопухолевой иммунной защиты организма [Alexander D.D. et al., 2007].

Выживание миеломных клеток увеличивается при действии ростовых факторов, к которым относится, в том числе, целый ряд интерлейкинов (IL-6, IL-10, IL-1, IL-4, IL-5, IL-12). Главным цитокином, стимулирующим пролиферацию опухолевых лимфоцитов при этом заболевании является IL-6. Он активирует путь JAK2/STAT3 в миеломных клетках и способствует их выживаемости, вызывая гиперэкспрессию Bcl-XL и ингибицию CD95 [Бессмельцев С.С., 2013]. Интерлейкин-1 синтезируется миеломными клетками и играет ведущую роль в процессах межклеточного взаимодействия, стимулируя, в частности, продукцию молекул эндотелиально-лейкоцитарной адгезии, а также активирует продукцию IL-6. Показано, что повышенная продукция IL-1 влияет на диссеминацию опухолевых клеток при ММ [Гельцер Б.И. и др., 2011; Dinarello C., 2011]. Цитокины также играют значительную роль в развитии остеолитических поражений при ММ, причиной которых может быть как существенное увеличение активности остеокластов, так и ингибирование остеобластов [Бессмельцев С.С., 2013]. К остеокластактивирующим факторам относятся такие цитокины и их рецепторы, как IL-1, IL-1, IL-1R, IL-1RA, TNF-, IL-6 [Axmann R. еt al., 2009; Roodman G.D., 2001].

Гены цитокинов обладают чрезвычайно высокой степенью аллельного полиморфизма. Частота аллельных вариантов и соответствующих генотипов варьирует в различных популяциях. Количество вариабельных участков в одном гене может достигать нескольких десятков и располагаться они могут в кодирующих областях (экзонах), а также в интронах и промоторных регуляторных зонах. Известно, что одиночные нуклеотидные замены (single nucleotide polymorphisms – SNP) в промоторной области генов цитокинов в наибольшей степени влияют на скорость секреции и биологическую активность этих факторов [Коненков В.И. и др., 2003; Коненков В.И. и др., 2012]. Поэтому изучение аллельных вариантов генов, определяющих базовый уровень продукции цитокинов, позволит установить новые иммуногенетические факторы, ассоциированные с высоким риском развития заболеваний, в патогенезе которых цитокины играют важную роль.

Степень разработанности темы

Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению роли непосредственно самих цитокинов в развитии ММ, данные о значении аллельного полиморфизма соответствующих генов в патогенезе этого заболевания практически отсутствуют. При этом гендерные, расовые, возрастные отличия частоты возникновения ММ в популяции, а также наличие семейных случаев данного заболевания свидетельствуют о

существенном вкладе генетической предрасположенности в его развитие [Kekik C. et al., 2007]. Более того, индивидуальные особенности генотипа пациента могут играть значительную роль в определении характера течения и, в частности, прогноза заболевания.

В этой связи, принципиально новым направлением является изучение полиморфизма генов цитокинов у здоровых лиц, проживающих в Северо-Западном регионе России и исследование влияния однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов на развитие и клиническое течение множественной миеломы. Данные об особенностях генотипов и аллельных вариантов генов цитокинов в этой группе больных позволят установить новые иммуногенетические критерии, ассоциированные с высоким риском развития ММ, а также с клиническими особенностями заболевания. Полученные сведения позволят расширить представления об этиопатогенезе ММ, определить новые факторы прогноза течения заболевания и ответа на терапию.

Цель исследования:

Определение особенностей полиморфизма генов цитокинов у больных множественной миеломой и оценка его значимости в развитии и прогнозировании течения заболевания.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить частоту аллелей и генотипов регуляторных (IL-2, IL-4, IL-4R, IL-10, IL-12, IFN-, TGF-1) и провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-1, IL-1R, IL-1RA, TNF-, IL-6) в здоровой популяции Северо-Западного региона России и провести сравнительный анализ с популяциями европейских и других стран.

2. Провести молекулярно-генетический анализ полиморфизма указанных генов цитокинов у больных ММ, установить новые иммуногенетические факторы риска развития ММ, в том числе и в зависимости от иммунохимического варианта заболевания (IgG, IgA, Бенс-Джонса).

3. Изучить влияние однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов на клинические особенности течения ММ и оценить вклад сочетаний генотипов ряда регуляторных и провоспалительных цитокинов в патогенез заболевания.

4. Оценить роль полиморфизма генов цитокинов в развитии костной болезни у больных ММ.

5. Установить значимость клинико-генетических ассоциаций в прогнозировании течения множественной миеломы.

Научная новизна

Впервые получены новые научные данные о частоте аллелей и генотипов цитокинов, ответственных за характер иммунного ответа в здоровой популяции Северо-Западного региона России.

Впервые на основании комплексной оценки результатов исследования однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов определены новые иммуногенетические факторы, предрасполагающие к развитию множественной миеломы (IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG и IL-6 nt565 GG) в популяции из Северо-Западного региона России, а

также определяющие устойчивость индивидуумов к данному заболеванию (IL-4 -33 CC, TGF-1 codon 25 GG, IL-6 -174 GC и IL-6 nt565 GA).

Впервые выделены генотипы цитокинов (сочетание IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG, IL-6 nt565 GG), ассоциированные с неблагоприятными прогностическими факторами ММ - с низким уровнем альбумина (<3,5 г/дл) и высокими показателями 2-микроглобулина (>5,5 мг/л), которые могут служить дополнительными критериями стратификации больных на группы риска.

Впервые установлены новые данные об ассоциации генотипов цитокинов с иммунохимическими вариантами множественной миеломы (для миеломы G характерен генотип IL-4R +1902 AA; для миеломы Бенс-Джонса – IL-4 -590 CC, TNF- -308 AA, TNF- -238 AA и IL-6 -174 CC; при миеломе А чаще встречается генотип TGF-1 codon 25 GC).

Впервые получены данные о частоте генотипов некоторых цитокинов (IL-4 -33 TC, IL-1 -889 TC, IL-1 +3962 TC), которые расширяют представление о роли цитокинов в патогенезе костной болезни у пациентов с ММ.

Теоретическая и практическая значимость

Получены новые данные, которые способствуют расширению знаний о популяционной генетике жителей Северо-Западного региона России. Несмотря на схожесть в распределении частот генов цитокинов (IL-1, IL-12, TGF-1) у жителей Северо-Западного региона России с жителями европейских стран и стран Южной и Северной Америки, установлены различия, касающиеся генотипов IL-4, IL-6, IL-10, IFN- и TNF-, а с жителями Саудовской Аравии, Сингапура и Африки, помимо перечисленных выше цитокинов, отличия наблюдались и в генотипах IL-2. Эти данные отражают этнические различия между популяциями и могут служить для дальнейших иммуногенетических популяционных исследований.

Совокупность полученных результатов по изучению клинически значимых однонуклеотидных полиморфных вариантов у больных ММ свидетельствует об участии отдельных генотипов цитокинов в патогенезе множественной миеломы и доказывает необходимость продолжения изучения роли иммуногенетических факторов в развитии злокачественных заболеваний системы крови. Получены новые данные о генотипах, предрасполагающих к развитию ММ (IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG и IL-6 nt565 GG) и определяющих устойчивость организма (IL-4 -33 CC, TGF-1 codon 25 GG, IL-6 -174 GC и IL-6 nt565 GA) к этому заболеванию.

Обоснована важность и необходимость исследования однонуклеотидного полиморфизма генов цитокинов (IL-1, IL-6, IL-4, IL-4R, TGF-1, TNF-) у больных ММ. Установлено, что гетерозиготы IL-1 -889 TC, IL-1 +3962 TC и IL-4 -33 TC ассоциированы с развитием более тяжелых поражений костной ткани при ММ. Полученные данные об ассоциации генов цитокинов с ММ открывают дополнительные возможности в прогнозировании течения множественной миеломы и могут быть использованы для формирования групп риска.

Методология и методы исследования

Работа основана на сравнении частот аллелей и генотипов 22 клинически значимых полиморфных вариантов генов цитокинов у здоровых жителей Северо-Западного региона

России и больных ММ. Геномное типирование проводили методом, основанном на полимеразой цепной реакции с применением аллелеспецифических праймеров (PCR-SSP).

Положения, выносимые на защиту:

6. Частоты аллелей и генотипов, исследованных цитокинов сопоставимы с таковыми в других здоровых популяциях Восточной и Южной Европы.

7. Однонуклеотидный полиморфизм генов цитокинов играет значимую роль в патогенезе множественной миеломы: генотипы IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG и IL-6 nt565 GG увеличивают шанс развития заболевания в 2-4 раза (p<0,05). В совокупности с другими клиническими и биологическими параметрами эти маркеры могут быть использованы в качестве критериев прогноза развития заболевания.

8. Характер клинических проявлений и особенности течения множественной миеломы взаимосвязаны с аллельными полиморфными вариантами генов цитокинов: генотипы IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG, IL-6 nt565 GG ассоциированы с риском более агрессивного течения множественной миеломы; увеличение риска тяжелых остеолитических поражений - с генотипами IL-1 -889 TC, IL-1 +3962 TC и IL-4 -33 TC.

9. Однонуклеотидные полиморфные варианты генов цитокинов участвуют в молекулярно-генетическом контроле возникновения определенного иммунохимического типа множественной миеломы.

Степень достоверности и апробации результатов исследования

Результаты получены современными молекулярно-генетическими методами. Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными и соответствуют полученным результатам. Достоверность подтверждается статистической обработкой данных.

Данные, полученные в процессе выполнения работы, были представлены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013), «Объединенный иммунологический форум» (Нижний Новгород, 2013), VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика – 2014» (Москва, 2014), «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2014), Юбилейная научно-практическая конференция «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокиновой регуляции», посвященной 40-летию ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России (Санкт-Петербург, 2014), научный форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2015» (Санкт-Петербург, 2015), «Актуальные вопросы иммуногенетики и тканевого типирования» (Санкт-Петербург, 2015), IX Международный симпозиум памяти Р.М. Горбачевой «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, генная и клеточная терапия» (Сочи, 2015), IV Евразийском гематологическом форуме (Санкт-Петербург, 2016), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2016), III Конгрессе гематологов России (Москва, 2016), II Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2016). А также, на международных конференциях: 7^th East-West Immunogenetics Conference (Прага, 2013), 27^th European Immunogenetics and Hisocompability Conference (Маастрихт, 2013), 39^th Annual

Meeting of the American Society for Histocompability and Immunogenetics (Чикаго, 2013), 8^th East-West immunogenetics Conference (Вена, 2014), 28^th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (Стокгольм, 2014), 29^th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (Женева, 2015), 9^th East-West Immunogenetics conference (Любляна, 2015), 20^th Congress of European Hematology Association (Вена, 2015), 10^th East-West Immunogenetics conference (Вроцлав, 2016), 30^th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (Кос, 2016), 21^st Congress of European Hematology Association (Копенгаген, 2016).

Внедрение результатов работы

Разработан, освоен и внедрен в практику работы лаборатории иммуногематологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России молекулярно-генетический метод типирования (PCR-SSP) аллельных однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP) генов цитокинов. Апробация разработанного метода была произведена в лаборатории иммуногематологии и гематологической клинике ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России, а также в гематологическом отделении СПб ГБУЗ «Городская больница № 15» города Санкт-Петербурга.

Итоги работы освещались на семинарских занятиях с клиническими ординаторами в ФГБУ «Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии» ФМБА России. Материалы исследования используются в учебном процессе на циклах дополнительного профессионального образования по повышению квалификации врачей клинической лабораторной диагностики в ФГБОУ ВО «Северо-Западном государственном медицинском университете им. И.И. Мечникова» Минздрава России (Санкт-Петербург).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для публикаций материалов диссертации.

Объем и структура диссертации

Роль цитокинов в развитии множественной миеломы

Первый класс включает молекулы, несущие 4 антипараллельные короткие (15 аминокислот) спирали (IL-2, IL-5, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), IFN-) и молекулы, содержащие 4 антипараллельные длинные (более 25 аминокислот) спирали (IL-6, IL-10, IL-11, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), IFN-, IFN-). Второй класс включает цитокины, молекулы, которых несут длинные вытянутые цепи: IL-1, IL-1, TNF-, TNF-. Третий класс представлен молекулами с короткими - и -цепями (эпидермальный фактор роста - EGF, IL-8 и другие хемокины), четвертый - молекулами, имеющими мозаичное строение (IL-12, фактор роста глиальных клеток) [31, 75].

Также цитокины классифицируются по третичной структуре белка, что более точно отражает эволюционное происхождение молекул у высших млекопитающих и внутригрупповое сходство по конформации и аминокислотной последовательности специфических клеточных цитокиновых рецепторов [119]. Например, суперсемья рецептора TNF/TNF содержит иммунорегуляторные цитокины, включая TNF-, лимфотоксины и клеточные лиганды, такие как CD40L, которые опосредуют активацию B- и T- клеток и FasL (CD95), участвующий в процессе апоптоза [106]. Точно так же, суперсемья рецептора IL-1/IL-1 содержит цитокины, такие как IL-1, IL-1, антагонист IL1-рецептора (IL-1RА), IL-18 и IL-33, которые опосредуют физиологические и защитные функции организма. Эта суперсемья включает Toll-подобные рецепторы, которые играют важную роль в ранних врожденных реакциях иммунного ответа [110]. Несмотря на такую широкую классификацию, тем не менее, спектры биологических активностей цитокинов в значительной степени перекрываются: один и тот же процесс может стимулироваться в клетке более чем одним цитокином [32].

Действие цитокинов на клетку-мишень опосредуется высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами, которые представляют собой трансмембранные гликопротеины, состоящие более чем из одной субъединицы и имеющие несколько типов центров связывания (отдельные цитокины могут использовать общие субъединицы рецепторов, которые в свою очередь, могут находиться в растворимой форме, сохраняя способность связывать лиганды) [15, 71]. Цитокиновые рецепторы не обладают тирозинкиназной активностью (за исключением рецепторов I класса, которым присуща слабая тирозинкиназная активность, например рецепторы IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, G-CSF) [45]. Кроме того, существуют общие групповые рецепторы, способствующие устранению избытка цитокинов в очаге поражения [8, 154]. На основании сходства внеклеточных лигандсвязывающих доменов и трехмерной структуры выделяют несколько типов рецепторов цитокинов [15, 62]. Анализ строения этих рецепторов показал, что также как и сами цитокины эти молекулы могут быть разделены на несколько классов или типов согласно сходству аминокислотных последовательностей и их особенностям по организации внеклеточных доменов. Многие рецепторы цитокинов состоят из 2-3 субъединиц, кодируемых разными генами и экспрессируемых независимо. При этом для формирования высокоаффинного рецептора требуется одновременное взаимодействие всех субъединиц [31].

Наиболее крупное семейство рецепторов – гемопоэтиновые рецепторы (класс I) - характеризуется наличием от 2 до 7 внеклеточных участков с гомологичной последовательностью длиной примерно в 200 аминокислотных остатков, наличием 4 цистеинов и последовательности аминокислот Trp-Ser-Xrp-Ser (WSXWS) [31]. К данному типу относятся рецепторы к IL-2 – IL-7, IL-9 – IL-13, IL-15, IL-21, IL-23, IL-27, G-CSF, GM-CSF, а также рецепторы гормона роста и пролактина (гуморальных факторов), действующих преимущественно вне иммунной системы [62]. Семейство рецепторов интерферона – класс II – состоит из 1-2 внеклеточных доменов, которые содержат 4 цистеина. Этот класс объединяет рецепторы к интерферонам (IFN-, IFN-, IFN-), а также рецепторы к IL-10, IL-20 и IL-22 [31]. Цитокиновые рецепторы третьего семейства – III класс – рецепторы к факторам некроза опухолей (TNF) -содержат цистеин-богатый внеклеточный домен, три рецептора объединяются в гомотример для взаимодействия с тримером TNF [31]. К этому семейству относят рецепторы к лимфотоксинам TNF-, TNF- и ряд родственных цитокинов, в том числе NGF (фактор роста нервов) [106]. Выделяют также семейство рецепторов интерлейкина-1 (класс IV), которые состоят из 3 внеклеточных доменов и их внутриклеточная часть имеет сходство в строении и механизмах передачи сигнала с Toll рецепторами. К этому классу относят рецепторы IL-1 и IL-18 [31, 62]. Иммуноглобулиновое суперсемейство рецепторов (класс V): содержат 5 внеклеточных доменов и сходны по строению с рецепторами иммунной системы (антигенами, молекулами клеточной адгезии и некоторыми цитокинами). Иммуноглобулиновые домены содержат от 70 до 110 аминокислотных участков, к этому суперсемейству относятся рецепторы к IL-6, макрофагальному колониестимулирующиму фактору M-CSF, белковая тирозинкиназа c-kit (CD117), fms-подобная тирозинкиназа-3 (flt-3; CD135) [46]. Хемокиновые рецепторы (класс VI) имеют 7 трансмембранных спиралей, связанных с G-белком. В настоящее время описано 19 хемокиновых рецепторов, к ним относятся рецептор к IL-8, хемокиновые рецепторы 1-7 (CXCR1-CXCR7) и C-C рецепторы хемокинов 1-11 (CCR1-CCR11) [114].

Нормальная работа цитокиновой сети во многом базируется на механизмах, лежащих в основе регуляции экспрессии генов цитокинов [25]. Большинство цитокинов не синтезируется клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа. Их синтез начинается в ответ на проникновение в организм патогенов, антигенное раздражение или повреждение тканей через короткий промежуток времени. Одними из наиболее сильных индукторов синтеза провоспалительных цитокинов служат патоген-ассоциированные молекулярные структуры. Для запуска синтеза Т-клеточных цитокинов требуется активация клеток специфическим антигеном с участием Т-клеточного антигенного рецептора. Спектр детектируемых мРНК цитокинов узок и уровень экспрессии соответствующих генов невысок. При повреждении тканей, воспалении, образование опухоли и во многих других физиологических и патологических ситуациях спектр экспрессирующихся генов цитокинов, обладающих как местной, так и дистантной активностью, значительно расширяется, а уровень экспрессии генов, обладающих базальной активностью, многократно возрастает [25, 127]. Действие цитокинов инициируется в результате их взаимодействия со специфическими клеточными рецепторными комплексами на поверхностях клеток-мишеней. Их количество для разных медиаторов значительно варьирует (от сотен до сотен тысяч) [74]. Эти комплексы связывают лиганды с цитокинами с высокой аффинностью (некоторые цитокины могут использовать общие субъединицы рецепторов) [40, 42]. Сигналы этих комплексов могут регулировать экспрессию данного цитокина и его рецептора и синтез целого спектра медиаторов и поверхностных рецепторов. Синтез прекращается в результате действия отрицательных обратных связей, опосредуемых простагландинами, кортикостероидными гормонами и другими факторами, а также за счет механизмов саморегуляции. В основе «выключения» синтеза лежат, как правило, события, ведущие к блокаде транскрипции и/или сокращению времени жизни мРНК [25]. Двумя важными характеристиками экспрессии генов цитокинов являются - тканеспецифичность и зависимость от активации клеточных сигнальных путей. Значительная часть цитокинов производится практически только одним типом клеток, но есть цитокины, гены которых эффективно экспрессируются в клетках нескольких типов. Например, IL-2 в основном синтезируются Т-лимфоцитами, а эозинофилы синтезируют лишь незначительное его количество [53, 103, 115, 129, 156].

Использованные реактивы

Объектом исследования являлись больные множественной миеломой - 80 человек и здоровые лица - 100 человек. Обследованные лица, в обеих когортах, были жителями Северо-Западного региона России и считали себя русскими.

Контрольную группу составили практически здоровые жители восточнославянской популяции Северо-Западного региона России. Нами были обследованы 100 индивидуумов, не связанных кровным родством, потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток. Средний возраст доноров составил 51,2 ± 6,9 лет. Из них 49 мужчин (ср. возраст – 51,6 ± 7,5) и 51 женщина (ср. возраст – 50,7 ± 6,4).

Под нашим наблюдением находились 80 больных множественной миеломой (ММ) русской этнической принадлежности (средний возраст - 69,6 ± 8,6; соотношение мужчин и женщин составило 1:2, т.е. 26 мужчин и 54 женщины), которые проходили обследование и лечение в клиническом отделе химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России и в отделении гематологии СПб ГБУЗ «Городская больница №15» в период с 2013 по 2015 гг.

Диагноз симптоматической ММ был верифицирован на основании критериев, разработанных European Group for Blood and Bone Marrow Transplant/ International Bone Marrow Transplant Registry/American Bone Marrow Transplant Registry (EBMT/IBMTR/ABMTR) [49], дополненных экспертами Международной рабочей группой (International Myeloma Working Group -IMWG) [7, 67]: 1) выявление в пунктате костного мозга 10% и более опухолевых плазматических клеток (при цитофлуориметрии более 90% с опухолевым фенотипом CD138+) или обнаружение плазмоклеточной опухоли (плазмоцитомы); 2) выявление моноклонального иммуноглобулина (М-протеина) методом иммуноэлектрофореза сыворотки и/или суточной мочи (при низком содержании моноклонального белка использовали метод иммунофиксации), за исключением несекретирующей формы ММ; 3) выявление дисфункций, обусловленных повреждением органов или тканей (CRAB-синдром): C (Calcium) – гиперкальциемия (уровень кальция в сыворотке крови 11,5 мг/дл или 2,75 ммоль/л или на 0,25 ммоль/л выше верхней границы нормы); R (Renal) – нарушение функции почек (уровень креатинина в сыворотке крови мг/дл или 173 ммоль/л); A (Anaemia) – нормохромная, нормоцитарная анемия (уровень гемоглобина 100 г/л или на 20 г/л меньше нижней границы нормы); B (Bone) – поражение костей скелета (очаги лизиса, тяжелая остеопения, патологические переломы, компрессия тел позвонков с уменьшением их высоты) подтверждались рентгенографией, магнитно-резонансной томографией и позитронно-эмиссионной и компьютерной томографией. 4) другие симптомы: гипервязкость, амилоидоз, частые бактериальные инфекции (более 2 эпизодов в течение 12 месяцев).

У 44% больных диагноз ММ был установлен в возрасте от 61 до 70 лет; у 92,5% — от 51 до 80 лет. Наиболее часто у больных наблюдалась миелома G (64%). Частота миеломы A (21%), как и болезни легких цепей (15%), была практически одинаковой и составила около 20%, что соответствует данным литературы [5].

Для того чтобы установить влияют ли SNP на развитие костной болезни у пациентов с множественной миеломой, мы проанализировали результаты иммуногенетического обследования больных с проявлениями остеопороза и единичными очагами лизиса в костях (38 пациентов; ср. возраст 70,1 ± 8,0; II стадия по классификации Durie-Salmon Plus) - 1-ая группа и данные пациентов с выраженными остеолитическими поражениями костной ткани (42 пациента; ср. возраст 69,2 ± 9,2; III стадии по классификации Durie-Salmon Plus) - 2-ая группа.

Всем больным проводилось лечение по различным программам терапии. Терапию с использованием ингибитора протеасом бортезомиба получали 79 пациентов. Бортезомиб (велкейд) назначался как в режиме монотерапии, так и в сочетании с другими препаратами: VD (бортезомиб + дексаметазон), VMP (велкейд + мелфалан + преднизолон), CVD (циклофосфамид + бортезомиб + дексаметазон), PAD (бортезомиб + доксорубицин + дексаметазон), RVD (леналидомид + бортезомиб + дексаметазон). Результаты лечения оценивали с использованием критериев EBMT [49]. Объективный ответ (полная ремиссия; частичная ремиссия; минимальный ответ) в целом в группе больных составил 55%.

Геномное типирование полиморфного участка +874 A/T (rs 2430561) в гене IFN- з

Такая же картина наблюдалась и для гена цитокина IL-4 -33 T/C: частота аллеля T у потенциальных доноров нашего региона была достоверно выше, чем у жителей Чехии и Македонии (0,36 к 0,19 и 0,15 соответственно). Достоверно ниже, у здоровых лиц из Санкт-Петербурга, встречался аллель C, по сравнению с населением городов Оломоуц и Скопье - 0,65 к 0,81 (2=7,87; p=0,005) и 0,65 к 0,85 (2=13,01; p=0,0003) соответственно. Достоверные отличия между частотой выявления аллелей в гене регуляторного цитокина IL-2 +166 T/G были найдены среди жителей Северо-Западного региона России и Македонии. Аллель Т достоверно реже встречался у жителей Скопье (0,22) относительно жителей Санкт-Петербурга (0,36), тогда как аллель G, наоборот, достоверно чаще обнаруживался среди здоровой популяции Македонии - 0,78, нежели в России - 0,64 (2=5,05; p=0,025). Частота встречаемости аллелей провоспалительного цитокина IL-6 также значительно отличалась между двумя популяциями, а именно, у здоровых лиц из Северо-Западного региона России и Македонии. Частота аллеля G в гене IL-6 -174 G/C, была выше у жителей Скопье, чем у потенциальных доноров из Санкт-Петербурга, и, наоборот, в популяции Северо-Западного региона России аллель C гена IL-6 -174 G/C встречался чаще, чем у македонцев (0,52 к 0,29 соответственно; 2=12,56; p=0,0004), сходная картина наблюдалась и в гене IL-6 nt565 G/A для аллелей G – 0,54 (Россия) к 0,72 (Македония) и для аллелей A - 0,47 (Санкт-Петербург) к 0,28 (Скопье), 2=7,81; p=0,005.

Для установления более широкой картины распределения частоты аллелей генов регуляторных и провоспалительных цитокинов в Европе и ее отличий от популяции, проживающей в Северо-Западном регионе России, нами были проанализированы следующие страны: Болгария (Юго-Восточная Европа), Польша (Восточная Европа), Италия (Южная Европа) и Северная Ирландия (Западная Европа) [96, 112, 151], таблица Приложение 1.

Было обнаружено выраженное сходство частоты встречаемости аллелей генов регуляторных цитокинов в исследованной группе из России с жителями Европейских стран. Статистически значимые различия были выявлены в распределении только IL-10 -1082 G/A у жителей Софии (Болгария), для которых характерна более низкая частота обнаружения аллеля G по сравнению с жителями Санкт-Петербурга (Россия) (0,31 к 0,47 соответственно) и более высокая частота выявления аллеля A - 0,69 (Болгария) к 0,53 (Россия), 2=4,70; p=0,030. При анализе литературных данных о частоте встречаемости аллелей выявлены статистически значимые отличия в гене IL-6 -174 G/C в здоровых популяциях из Болгарии, Италии и России [96, 112, 151], таблица Приложение 1. Частота выявления аллеля G была выше у болгар (0,63) относительно популяции Северо-Западного региона России (0,48; p 0,05), а у итальянцев встречалась в 1,5 раза чаще (0,66; p 0,01). Аллель C регистрировалась чаще у доноров из Санкт-Петербурга, чем у жителей Болгарии и Италии (0,52 к 0,37 и к 0,34 соответственно; p 0,05). Мы также оценили различия встречаемости аллелей генов цитокинов между жителями России и народами Северной и Южной Америк (Бразилия, Мексика, США) [112, 151], таблица Приложение 1. В гене цитокина TNF- -308 G/A достоверных отличий выявлено не было, частоты встречаемости были практически одинаковыми во всех исследованных популяциях, а вот частота аллелей гена цитокина IL-6 -174 G/C в популяции из Северо-Западного региона России достоверно отличалась от всех исследованных народов Америк. Аллель G в два раза чаще регистрировался у мексиканцев (0,94) и афроамериканцев (0,91) и в 1,5 раза чаще у бразильцев (0,70) и американцев (0,65) по сравнению с Россией (0,48), p 0,05. И, наоборот, аллель A был найден реже у мексиканцев (0,06), афроамериканцев (0,09), бразильцев (0,30) и американцев (0,35) по сравнению с русскими (0,52), p 0,05.

При анализе встречаемости аллелей в генах регуляторных цитокинов в Южной и Северной Америках по сравнению с популяцией из Северо-Западного региона России нами не было выявлено достоверных отличий [112, 151], таблица Приложение 1. В работе были обнаружены существенные отличия в распределении аллелей некоторых генов цитокинов среди жителей России, Саудовской Аравии, Африки и Сингапура [112, 151], таблица Приложение 1. Например, в цитокине IL-2 -330 T/G аллель T встречался у жителей ЮАР в 0,96 случаев, а аллель G у жителей Африки - всего в 0,04. У русских аллели в гене IL-2 -330 T/G обнаруживались значительно реже: у 0,65 жителей был аллель T, а аллель G встречался у населения России с частотой равной 0,35 (p 0,05). Также значительные отличия в частоте распределения аллелей между здоровыми жителями России, Африки и Саудовской Аравии были зарегестрированы для IL-6 -174 G/C. Аллель G у африканцев встречался с частотой 0,99, у арабов выявлялся почти у 0,88, а в популяции из СевероЗападного региона России частота равнялась 0,48. А аллель C регистрировался с частотой 0,006 (ЮАР), 0,13 (Саудовская Аравия) и 0,52 (Россия), p 0,05. Интересно, что частота аллелей трех генов цитокина IL-10 достоверно отличалась среди населения России и Сингапура. Так аллель G гена IL-10 -1082 G/A у россиян встречался почти в 20 раз чаще (0,47), чем у жителей Сингапура (0,03), p 0,05. Аллель T регуляторного цитокина IL-10 -819 T/C почти в 3 раза чаще выявлялся у населения Сингапура, чем у россиян (0,67 к 0,28 соответственно), p 0,05. Однако, аллель C гена IL-10 -592 C/A у русских регистрировался с частотой 0,74, а в Сингапуре только с частотой 0,33 (p 0,05).

В работе также был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости генотипов исследованных генов цитокинов в различных популяциях, как Европы, Америки, так и Азии [96, 112, 151], таблица Приложение 2.

Например, при сравнении кластера генов IL-1 (IL-1, IL-1, IL-1R, IL-1RA) в популяции Северо-Западного региона России с чехами, отличия были выявлены в генотипе IL-1R pst 1 1970 TT: у чехов данный генотип встречался реже (0,09), чем в популяции из Северо-Запада (0,19), 2=6,05; p=0,049 (рис. 3.1) [96].

Сравнение полиморфизма генов цитокинов здорового населения Северо-Западного региона России с народами других стран Мира

На основании полученных собственных результатов исследования генотипы IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG, IL-6 nt565 GG были отнесены к факторам, предрасполагающим к развитию ММ. Тогда как генотипы IL-4 -33 CC и TGF-1 codon 25 GG вероятно, определяют устойчивость организма к развитию ММ.

Далее, в работе было проанализировано, существование взаимосвязи некоторых лабораторных показателей, которые используются в классификации ММ (Durie-Salmon и ISS) с неблагоприятными и протективными генотипами. Нами были выбраны три лабораторных параметра: гемоглобин, альбумин и 2-микроглобулин.

Необходимо отметить, что у подавляющего большинства пациентов в нашей выборке уровень гемоглобина превышал 100 г/л, однако нами было установлено, что в группе пациентов с сочетанием двух протективных генотипов TGF-1 codon 25 GG и IL-4 -33 CC уровень гемоглобина был достоверно выше, чем у всех остальных больных (146,5 ± 0,71 г/л).

Анализ уровня альбумина у обследованных нами больных ММ показал, что в группе пациентов с генотипами, ассоциированными с развитием ММ (IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG и IL-6 nt565 GG) этот показатель был наименьшим и составил 3,34 г/дл, тогда как у пациентов, не имеющих предрасполагающих иммуногенетических факторов содержание альбумина было 3,9 г/дл (p 0,05).

Однако у пациентов с высоким уровнем альбумина ( 3,5 г/дл) аллель C цитокина IL-1 +3962 T/C встречалась чаще, чем у пациентов с уровнем данного показателя находящемся в пределах 1,7-3,4 г/дл (p 0,05).

Что касается пациентов с различными уровнями 2-микроглобулина, то достоверные отличия были выявлены для аллеля G цитокина IL-6 -174 G/C, который встречался реже у пациентов с высоким уровнем 2-микроглобулина ( 5,5 мг/л), тогда как аллель A цитокина IL-6 nt565 G/A встречался чаще, у пациентов с высокими значениями 2-микроглобулина, чем у больных с уровнем 2-микроглобулина в пределах 3,5-5,5 мг/л (p0,05).

Значительные отличия были выявлены и у пациентов с различным уровнем альбумина: генотип IL-1 +3962 TT выявлялся в 3,5 раза чаще у пациентов с низким уровнем альбумина в сравнении с больными с высоким уровнем данного белка (p 0,01). Интересно, что отличия по гомозиготам IL-1RA mspa1 11100 TT у больных с уровнем альбумина находящимся в пределах 1,7-3,4 г/дл и в группе с высоким содержанием белка были достаточно существенны (p 0,05). Частота IL-1RA mspa1 11100 CC у пациентов с показателями альбумина, находящимся в пределах 1,7-3,4 г/дл составила 0,25 к 0,05 для пациентов с показателями выше 3,5 г/дл. Abazis-Stamboulieh D. et al. в исследовании ассоциации IL-1 с множественной миеломой показал, что генотип IL-1RA mspa1 11100 CC и его комбинации с IL-1 +3954 CC оказывают защитные действия [38].

Было выявлено, что шанс обнаружения низких уровней альбумина (OR) при наличии комбинации генотипов IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 -174 GG и IL-6 nt565 GG увеличивается до 5 раз (p 0,05), а при наличии сочетания гомозигот IL-6 -174 GG и IL-6 nt565 GG – почти до 4-х раз (p 0,05).

Различались также и показатели уровня 2-микроглобулина среди пациентов с разными генотипами. В 100% случаев у пациентов с наличием комбинации TGF-1 codon 25 GG и IL-4 -33 CC выявлялся низкий уровень 2-микроглобулина (p 0,05). В группах с наличием только TGF-1 codon 25 GG или без иммуногенетических протективных факторов, количество больных ММ со средним уровнем 2-микроглобулина (3,5-5,5 мг/л) было достоверно выше (0,67 и 0,68 соответственно), чем в группе с сочетанием TGF-1 codon 25 GG и IL-4 -33 CC (p 0,05). Интересно, что высокий уровень 2-микроглобулина (более 5,5 мг/л) вообще не выявлялся в группе больных с наличием TGF-1 codon 25 GG и IL-4 -33 CC, что может говорить о протективных свойствах этого генотипа.

Расчет отношения шанса (OR) показал, что наличие в генотипе сочетания гомозигот IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 174 GG и IL-6 nt565 GG у пациентов с ММ, указывает на то, что вероятность повышения уровня 2-микроглобулина ( 5,5 мг/л) увеличивается более чем в 2 раза. Полученные данные также указывают на то, что регуляторные цитокины, ответственные за иммунный ответ, у больных ММ с наличием в генотипе сочетания двух гомозигот TGF-1 codon 25 GG и IL-4 -33 CC достоверно ассоциированы с содержанием низкого уровня 2-микроглобулина ( 3,5 мг/л) в сыворотке крови.

Поскольку согласно шкале ISS уровень 2-микроглобулина более 5,5 мг/л и уровень альбумина менее 3,5 г/дл являются неблагоприятными прогностическими факторами, полученные в работе данные позволяют отнести генотипы IL-1 -889 TT, IL-1 +3962 TT, IL-6 174 GG и IL-6 nt565 GG к дополнительным негативным показателям развития заболевания, которые, вероятно, могут влиять на выживаемость больных ММ.

Одним из характерных симптомов ММ являются боли в костях, обусловленные процессами деструкции костной ткани. Степень деструкции костной ткани может быть различной – от остеопороза до выраженных остеолитических поражений [60, 122, 125, 141, 149]. При более агрессивном течении заболевания наблюдается выраженный процесс резорбции костей, осуществляющийся остеокластами, происходящими из клеток-предшественников в линии дифференцировки моноцит-макрофаг с образованием неактивных остеокластов. Цитокины и гормоны регулируют образование и активность остеокластов, а активированные остеокласты, в свою очередь, осуществляют резорбцию костной ткани и затем подвергаются апоптозу [66, 132, 133, 142, 145]. В увеличении активности остеокластов участвует ряд остеокластогенных факторов, таких как IL-1, IL-6, макрофагальный воспалительный протеин-1 (MIP-1) и RANKL - мембранный белок, цитокин семейства факторов некроза опухоли (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand; также обозначается TNFSF11 – Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11) [26]. Установлено, что при деструктивных костных поражениях при ММ, резорбция костей усиливается, в то время как формирование костей, наоборот, подавляется за счет нарушения дифференцировки остеобластов от клеток-предшественников. В связи с этими фактами, мы разделили пациентов на две группы согласно классификации Durie-Salmon Plus: 1-ая группа - больные с проявлениями остеопороза и единичными очагами лизиса в костях (не более 20 фокальных очагов лизиса или умеренные диффузные поражения позвоночника); 2-ая группа - пациенты с выраженными остеолитическими поражениями костной ткани (более 20 фокальных очагов лизиса или тяжелые диффузные поражения позвоночника).

Также как на предыдущих этапах, вначале было проведено сравнение частоты встречаемости аллелей в этих группах. Оказалось, что достоверно отличались частоты аллелей доноров и пациентов 2-ой группы в IL-1 -889 T/C, IL-1 +3962 T/C и в TGF-1 codon 25 G/C (p 0,05). Так, частота распределения аллеля T гена IL-1 -889 T/C у пациентов с тяжелыми поражениями костной ткани встречалась почти в два раза чаще, чем у здоровых лиц (0,46 к 0,27 соответственно; p 0,05). У пациентов 2-ой группы аллель IL-1 +3962 T встречался чаще (0,42), чем у доноров (0,23), p 0,05. Наоборот, для аллеля IL-1 +3962 C – 0,77 (доноры) к 0,58 (пациенты 2-ой группы), p 0,05. Аллель TGF-1 codon 25 C у пациентов с тяжелыми остеолитическими поражениями выявлялась в 3 раза чаще, чем у здоровых лиц (0,28 к 0,09 соответственно, p 0,05).