Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Современная классификация острых лимфобластных лейкозов 10
1.2. Факторы риска при В-клеточных острых лимфобластных лейкозах взрослых 13
1.3. Лечение острых лимфобластных лейкозов 19
1.4. Факторы риска на протоколах лечения острых лимфобластных лейкозов Российской исследовательской группы ОЛЛ-2009 и ОЛЛ-2016 22
1.5. Мутационный статус гена IKZF1 при острых лимфобластных лейкозах 25
1.5.1. Структура гена IKZF1 25
1.5.2. Регуляция транскрипции 26
1.5.3. Регуляция нормального В-лимфопоэза 28
1.5.4. Мутации гена IKZF1 в лейкемогенезе 29
1.5.5. Прогностическое значение мутаций гена IKZF1 при В-клеточных острых лимфобластных лейкозах 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Характеристика больных 35
2.2 Описание протоколов терапии острых лимфобластных лейкозов 37
2.2.1 Протокол ОЛЛ-2009 37
2.2.2. Протокол ОЛЛ-2012 39
2.2.3. Протокол ОЛЛ-2016 40
2.3. Клинико-лабораторные исследования 40
2.3.1. Стандартное цитогенетическое исследование и флуоресцентная гибридизация in situ 41
2.3.2. Исследование минимальной остаточной болезни 42
2.3.3. Исследование внутригенных делеций гена IKZF1 43
2.4. Статистическая обработка данных 47
Глава 3. Результаты и их обсуждение 48
3.1. Ph-негативные В-клеточные острые лимфобластные лейкозы 48
3.1.1. Клинико-лабораторная характеристика больных Ph-негативным В-клеточным острым лимфобластным лейкозом 48
3.1.2. Результаты исследования внутригенных делеций гена IKZF1 51
3.1.3. Клиренс минимальной остаточной болезни в зависимости от наличия внутригенных делеций гена IKZF1 62
3.1.4. Практическое применение анализа внутригенных делеций IKZF1 у больных Ph-негативным В-клеточным острым лимфобластных лейкозом 67
3.2. Исследование внутригенных делеций гена IKZF1 у больных Ph-позитивным В клеточным острым лимфобластным лейкозом 72
Заключение 77
Выводы 82
Список литературы 83
Приложение А. Схемы протоколов лечения ОЛЛ 109
Приложение В. Результаты исследования внутригенных делеций гена IKZF1 112
- Факторы риска при В-клеточных острых лимфобластных лейкозах взрослых
- Исследование внутригенных делеций гена IKZF1
- Клиренс минимальной остаточной болезни в зависимости от наличия внутригенных делеций гена IKZF1
- Исследование внутригенных делеций гена IKZF1 у больных Ph-позитивным В клеточным острым лимфобластным лейкозом
Факторы риска при В-клеточных острых лимфобластных лейкозах взрослых
Возраст
Возраст является наиболее значимым и универсальным прогностическим фактором при ОЛЛ. Чем старше возраст больных, тем выше корреляция с неблагоприятным исходом, что обусловлено увеличением гетерогенности заболевания и частоты коморбидности больных. В качестве фактора риска в большинстве исследований определяется возраст больных выше 35-40 лет [58, 181]. В исследовании J. Chessells и соавт. MRC UKALL вероятность 10-летней ОВ в группе больных В-ОЛЛ в возрасте от 20 до 39 лет составила 43%, в то время как в группе больных старше 40 лет – лишь 19% [135]. В старшей возрастной группе наблюдается тенденция к увеличению числа больных с гиподиплоидией и комплексным кариотипом [139], а также повышение частоты Ph-позитивных В-ОЛЛ, которая достигает 50% согласно данным ряда исследований [80, 135, 189]. Наличие сопутствующей патологии приводит к худшей переносимости интенсивных программ лечения. Так, например, показатели 2-летней смертности, не связанной с рецидивом заболевания, для пациентов старше 35 лет, перенесших алло-ТГСК от родственного донора, составили 36% по сравнению с больными моложе 35 лет, у которых этот показатель был значительно ниже и составил 19% [75]. Существует термин «возраст-адаптированная терапия» [73], согласно которому больным 60 лет и старше, ввиду плохой переносимости интенсивных программ лечения, проводится редукция доз химиопрепаратов, а также рассматриваются возможности проведения таргетной терапии [114]. Пациенты из так называемой группы «молодые взрослые», чей возраст менее 30 лет, продемонстрировали лучшие результаты на интенсивных педиатрических программах терапии [49]. Таким образом, возраст остается ключевым прогностическим фактором для больных ОЛЛ.
Лейкоцитоз
Другим основным фактором риска для больных В-ОЛЛ является инициальный показатель лейкоцитов в периферической крови, превышающий 30х109/л. Он считается прогностическим фактором фактически в каждом исследовании по лечению ОЛЛ и, вероятно, никогда не утратит своей актуальности [182].
Иммунофенотип
Исторически ИФТ рассматривался в качестве важного прогностического фактора и, несомненно, имел значение в выборе терапевтической тактики при В-ОЛЛ [182]. Прогностически неблагоприятным иммунофенотипическим вариантом заболевания считали ранний пре-В ОЛЛ [179]. Такие результаты приводились до того, как в качестве критериев стратификации больных на группы риска стали применять молекулярно-генетические параметры [133]. По результатам последних исследований ИФТ не является независимым прогностическим фактором [90]. При этом несомненны роль иммунофенотипирования как диагностического инструмента и его значение для определения возможности использования таких таргетных терапевтических подходов, как препараты моноклональных антител, в зависимости от обнаружения антигенных детерминант на поверхности опухолевых клеток [82]. Не менее важным аспектом является возможность детекции исходного уровня антигенной экспрессии для последующей оценки кинетики МОБ [31].
Минимальная остаточная болезнь
Определение МОБ является важнейшим прогностическим признаком при ОЛЛ. МОБ – это остаточное количество опухолевых клеток после достижения костномозговой ремиссии, не определяемых стандартными морфологическими методами [51]. Выявление остаточной опухолевой популяции клеток возможно только высокочувствительными диагностическими методами при наличии специфических молекулярных и иммунофенотипических маркеров лейкемических клеток, отличающих их от неопухолевых у нормальных костномозговых предшественников. Изучение кинетики МОБ на этапах противоопухолевой ПХТ продемонстрировало ее значимость как мощного предиктора развития рецидива в многочисленных исследованиях у детей и взрослых, а также позволило использовать ее как критерий стратификации пациентов на группы риска в рамках используемой программы лечения [18, 27, 31, 143, 156].
Методы исследования МОБ должны отвечать следующим требованиям: высокая чувствительность, высокая специфичность, воспроизводимость результатов, простота стандартизации, быстрое получение результатов для клинического применения, а также возможность количественного или полуколичественного измерения МОБ [199]. К основным высокочувствительным методам детекции МОБ относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР) и многоцветная проточная цитофлуориметрия (МПЦ) [37, 56, 61, 63].
С помощью ПЦР возможно выявить индивидуальные реаранжировки генов Т-клеточных рецепторов (TCR) и иммуноглобулинов (Ig), а также химерных генов и химерных транскриптов, ассоциированных с хромосомными аномалиями (например, BCR-ABL, MLL-AF4) [18]. При этом химерные гены и их транскрипты встречаются лишь в 40% случаев ОЛЛ, а клональные реаранжировки генов IG и TCR находят у 98% пациентов с В-ОЛЛ и у 95% больных с T-ОЛЛ. Детекция клональных реаранжировок генов IG и TCR проводится методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью пациент-специфичных праймеров. Для каждого лимфоцита характерны свои уникальные нуклеотидные последовательности V-D-J-области клонально перестроенных генов IG и ТCR, на которые и нацелены индивидуально разработанные пациент-специфичные праймеры. Чувствительность метода достигает 0,001% при анализе 1000000 клеток, то есть возможно выявить 1 опухолевую клетку среди 100 000 нормальных [163].
В основе определения МОБ методом МПЦ лежит детекция аберрантного ассоциированного с лейкозом иммунофенотипа, который отличает опухолевые клетки от нормальных гемопоэтических клеток. При использовании МПЦ лейкоз-ассоциированный иммунофенотип возможно обнаружить в 90% случаев В-ОЛЛ и более чем в 95% случаев Т-ОЛЛ. Максимальная чувствительность метода достигает 0,001% (анализ 1000000 клеток) [47, 56, 216]. Главным преимуществом МПЦ является быстрое получение результата исследования в течение нескольких часов по сравнению с более трудоемким процессом диагностики МОБ методом ПЦР-РВ с помощью пациент-специфичных праймеров, для выполнения которого требуется около 3 недель.
Многочисленные клинические исследования стали доказательством значимости определения МОБ как у детей, так и у взрослых на различных программах терапии, до и после алло-ТГСК. В ряде протоколов определение МОБ используется для стратификации больных на группы риска [32, 38, 124]. Значительный интерес представляет исследование кинетики МОБ в сочетании с внутригенными делециями гена IKZF1 [192, 196]. Согласно данным педиатрического Stanulla и соавт. на протоколе AIEOP-BFM [196] пациенты с IKZr г фенотипом (определяемом наличием внутригенных делеций гена IKZF1 c возможным сочетанием с делециями генов CDKN2A, CDKN2B, РАХ5 или PARI, но обязательным отсутствием делеций гена ERG) были стратифицированы по статусу МОБ после индукционной терапии. Были получены статистически значимые различия в зависимости от указанных параметров: в группе стандартного риска по МОБ-статусу с IKZr г фенотипом 5-летняя БСВ составила 94+5% против 40+10% в группе промежуточного риска и против 30+14% в группе высокого риска (P 0.001). Таким образом, IKZr г фенотип был определен как крайне неблагоприятный МОБ-зависимый молекулярный профиль В-ОЛЛ.
У взрослых больных, получавших лечение по протоколу GRAALL, также было показано, что позитивный МОБ-статус и наличие делецией гена IKZF1 являются независимыми критериями неблагоприятного прогноза, определяющими показания к алло-ТГСК [50].
Таким образом, исследование статуса МОБ обладает самостоятельной прогностической ценностью и позволяет интерпретировать значение молекулярно-генетического профиля больных В-ОЛЛ.
Исследование внутригенных делеций гена IKZF1
Молекулярные исследования проведены в лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ (зав. лаб. д.б.н. А.Б. Судариков). Для исследования внутригенных делеций IKZF1 применяли метод ПЦР, фрагментный анализ (ФА) и секвенирование по методу Сэнгера. Исследование выполнено 67 пациентам, среди них ретроспективная группа представлена 42 пациентами, проспективная – 25. В качестве материала для исследования использовали образцы пунктата костного мозга, полученные до начала терапии.
Выделение клеток и ДНК
Костный мозг больных брали в объеме 1,5 мл в пробирку с ЭДТА для предотвращения свертывания. Выделение ядросодержащих клеток костного мозга проводили методом лизиса эритроцитов с последующим отмыванием фосфатным буфером (ФБ). Для ретроспективной группы ДНК была выделена из лейкемических клеток замороженных образцов костного мозга, для проспективной группы выделение проводили из незамороженного материала. ДНК выделяли модифицированным солевым методом: полученный клеточный осадок лизировали раствором, содержащим 100 mM Tris-НCl (pH 7,6) (Синтол, Россия), 40 mM EDTA (pH 8,0) (Синтол, Россия), 50 mM NaCl (Синтол, Россия), 0,2% SDS; насыщенным раствором ацетата аммония осаждали белки, после чего ДНК осаждали изопропанолом и промывали 70% этиловым спиртом. Концентрацию выделенной ДНК определяли на спектрофотометре Genesys 10uv (Thermo, electron corporation, США). Образцы ДНК хранили при температуре -20С.
ПЦР
Анализ проводили с помощью мультиплексной флуоресцентной ПЦР, специфичной к горячим точкам внутригенных делеций - АEx2-7, АEx2-8, АEx4-7, АEx4-8 [39]. В систему входят праймеры, находящиеся слева (АEx2a, АEx2b, АEx4) и справа (АEx7, АEx8) от горячих точек разрыва после 1, 3, 7 и 8 экзонов, представленных на Рисунке 3.
Вставки светло-серого цвета с нумерацией обозначают экзоны гена IKZF1. Некодирующий экзон 1 выделен темно-серым цветом. Стрелки синего и зеленого цвета обозначают прямые праймеры с соответствующей флуоресцентной маркировкой, стрелки черного цвета – обратные немаркированные праймеры.
При отсутствии рассматриваемых делеций в гене праймеры находятся друг от друга на расстоянии более чем 10000 пар оснований, поэтому ПЦР невозможна. При внутригенных делециях расстояние между праймерами не превышает 1000 н.п.. В качестве эндогенного контроля в систему добавлен герминальный фрагмент AEx4-GL, находящийся в 3 интроне. Данные праймеры находятся с разных сторон от потенциальных точек разрыва. При отсутствии делеций в данном регионе получается ампликон длиной 760 н.п.. При наличии делеций данный ампликон отсутствует. Данная система позволяет по длине фрагмента и флуоресцентной маркировке определить каждый тип вышеуказанных делеций.
ПЦР проводили на автоматическом термоциклере С1000 Thermal Cycler (BioRad, США). Реакционная смесь в конечном объеме 25 мкл содержала 50-200 нг ДНК, 5 пмоль каждого праймера (Синтол, Россия), 2,5 мкл 10хПЦР буфера (Синтол, Россия), 1,5 мкл MgCl2 25 мМ (Cинтол, Россия), 2 мкл dNTP 2,5 мМ (Синтол, Россия), 0,2 мкл Taq-полимеразы (Синтол, Россия).
Программа амплификации включала предварительную денатурацию при температуре 95С (4 мин), 30 циклов ПЦР: 95С (30 сек), 60С (30 сек), 72С (1 мин) и окончательную элонгацию - 72С (4 мин).
Фрагментный анализ
Перед ФА наличие и качество ПЦР-продуктов проверяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия (Синтол, Россия). В зависимости от интенсивности свечения ПЦР-продукты разводили в 10-40 раз. Разведенные продукты смешивали с формамидом (HiDi Formamid, Thermofisher Scientific, США) следующим образом: 2 мкл разведенного продукта, 10 мкл формамида, 0,05 мкл внутреннего стандарта GeneScan 500LIZ (Applied Biosystems, США). Полученную смесь инкубировали в течение 5 мин при температуре 95С, а затем охлаждали до 0С в течение 10 мин. Далее 10 мкл денатурированного продукта наносили в плашку автоматического анализатора. Для ФА полученных ПЦР-продуктов использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот Нанофор05 (ФГБУН ИАП РАН, Россия) и программное обеспечение ДНК ФА v. 5.0.0.73 (ФГБУН ИАП РАН, Россия). Положительный результат ФА, свидетельствующий о наличии внутригенной делеции, был виден как один или несколько пиков в области амплификации, отражающих характерную длину полученного продукта в виде определенного количества пар нуклеотидов с цветом, позволяющим индентифицировать тип праймера. Зеленым цветом был маркирован прямой праймер к интрону 3, синим - прямой праймер к интрону 1. Контрольный продукт Gl длиной 760 н.п. подверждает успешно проведенную амплификацию. Отрицательный результат диагностировали при отсутствии пиков ПЦР-продукта, характерных для внутригенных делеций IKZF1. Представление результатов ФА отражено на Рисунке 4.
Зеленый пик обозначает наличие продукта с внутригенной делецией гена IKZF1, включающей 4 экзон. Синий пик обозначает наличие продукта с внутригенной делецией гена IKZF1, включающей 2 экзон. Сплошной линией обозначены диапазоны размеров ампликонов. Пунктирной линией обозначены диапазоны размеров ампликонов для вариантных точек разрыва. Длина ампликонов отражает протяженность делеции и позволяет установить вариант делеции.
Наличие обнаруженных внутригенных мутаций подтверждали прямым секвенированием по методу Сэнгера с использованием коммерческого набора Big Dye Xerminator v. 1.1 (Thermofisher Scientific, США) согласно инструкции производителя. Сиквенсную реакцию проводили с использованием тех же праймеров (но без флуоресцентной метки), которые применялись для получения ПЦР-продукта. Очистку сиквенсной реакции выполняли набором BigDye XTerminator Purirfication Kit (Applied Biosystems, США). Полученные данные были сопоставлены с референсной последовательностью гена IKZF1 (NG_034231.1) в онлайн-программе Standard Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Молекулярные исследования проводились вслепую относительно клинических данных.
Клиренс минимальной остаточной болезни в зависимости от наличия внутригенных делеций гена IKZF1
Среди больных Ph-негативным В-ОЛЛ, которым выполнено исследование делеций гена IKZF1 (n=49), 21 больному проведена оценка МОБ методом проточной цитометрии. Из них 8 больных получали терапию по протоколу ОЛЛ-2009 и 13 – по протоколу ОЛЛ-2016. Клиренс МОБ оценивали на 70 (окончание 2 фазы индукции) и 133 дни протоколов (окончание 3 фазы консолидации). Отсутствие различий в программах ПХТ до 133 дня позволило объединить больных в единую группу для исследования клиренса МОБ. Делеции гена IKZF1 были обнаружены у 6 больных (29%) и отсутствовали у 15 (71%). Медиана наблюдения больных без делеций составила 9,3 мес., больных с делециями – 15,6 мес.. Результаты исследования МОБ представлены в Таблице 8.
Как видно из Таблицы 8, в группе больных без делеций гена IKZF1 у 4 (26,6%) был определен МОБ-позитивный статус на 70 день, который сохранился к 133 дню у всех, кроме одного больного, не достигшего контрольной даты протокола на момент проведения анализа. Один (6,6%) из больных с МОБ-позитивным статусом на 133 день (в Таблице 8 больной №11) умер на сроке наблюдения 24,8 месяцев в результате развития рецидива заболевания (рецидив развился на сроке 18,9 месяцев). У других двух больных неблагоприятных событий не было отмечено, однако срок наблюдения был коротким и составил 5,37 и 5,8 мес. Среди больных с МОБ-негативным статусом на 70 и 133 дни неблагоприятных событий не наблюдалось.
У всех больных с делециями гена IKZF1 на 70 день терапии был определен положительный статус МОБ, на 133 день МОБ-негативный статус был достигнут только у одного больного. В связи с риском развития рецидива, учитывая высокие значения МОБ на 133 день терапии, трое больных (в Таблице 8 больные №19, 20, 21) из этой группы были переведены на другую линию терапии. Одному больному была выполнена алло-ТГСК после 2-х курсов поддерживающей ПХТ по протоколу ОЛЛ-2009, однако на +7 мес после алло-ТГСК у него был констатирован рецидив заболевания. Одному больному была выполнена смена линии терапии после III фазы консолидации по протоколу ОЛЛ-2009 (после 133-го дня) на блинотумомаб в сочетании с весаноидом и дазатинибом с последующей ауто-ТГСК (описание клинического случая в разделе 3.1.4). И один больной после 133 дня терапии был снят с лечения в связи с запланированной алло-ТГСК (информация из базы ОЛЛ-2016). Таким образом, в группе больных с делециями у 1(16,6%) был констатирован рецидив заболевания.
Выполнено сравнение значений МОБ на 70 и 133 дни в группах больных в зависимости от наличия делеций гена IKZF1. Результаты исследования представлены на Рисунке 7. Серым цветом выделена область МОБ негативности.
Как видно из Рисунка 7, при сравнении значений МОБ в зависимости от наличия делеций гена IKZF1 как на 70, так и на 133 дни выявлены статистически достоверные различия между группами. На 70 день терапии у всех больных с делециями IKZF1 была выявлена МОБ, в то время как среди больных без делеций МОБ обнаружена только у 4 (26,6%) (p=0,0024). На 133 день у пациентов без делеций гена IKZF1, также как и на 70 день, частота выявляемости МОБ и ее значения были ниже, чем у пациентов с делециями IKZF1 (p=0,0134). Графическое представление клиренса МОБ в сравниваемых группах больных отражено на Рисунке 8.
Как продемонстрировано на Рисунке 8, у пациентов с делециями гена IKZF1 отмечено снижение значений МОБ к 133 дню по сравнению с 70 днем (р=0,016), МОБ-негативный статус достигнут только у одного больного. Среди 3 пациентов без делеций гена IKZFJ, у которых определялась МОБ, к 133 дню у всех наблюдается уменьшение МОБ по отношению к 70 дню (р=0,063), однако МОБ-негативный статус не был достигнут. Таким образом, было продемонстрировано, что у пациентов с внутригенными делециями гена IKZF1 происходит более медленный клиренс опухолевых клеток. На Рисунке 8 видно, что в большинстве случаев значения МОБ у больных с делециями гена IKZF1 были значительно выше таковых у больных без делеций.
Согласно данным литературы больные с высоким значением МОБ ( 10 ) относятся к наиболее неблагоприятной прогностической группе. В нашем исследовании у 5 из 6 больных с делециями гена IKZF1 МОБ персистировала. В педиатрическом исследовании P. Drge и соавт. наличие внутригенных делеций гена IKZF1 значимо чаще наблюдалось у пациентов из группы высокого риска, установленной в соответствии со статусом МОБ 10 , по сравнению с пациентами группы промежуточного и стандартного риска (p 0,01). 5-летняя БСВ была значимо ниже у больных с делецией гена IKZFJ по сравнению с другими больными [51].
Во французском исследовании K. Beldjord [20] наблюдались сходные с нашими данными результаты: среди взрослых больных частота встречаемости делеций гена IKZF1 была выше у тех, у кого статус МОБ был положительным, по сравнению с теми, у кого при наличии делеций МОБ статус был негативным (65% против 36%, p=0,001). Примечательно то, что у больных с реаранжировками гена MLL ассоциации с МОБ не наблюдалось (48% с МОБ «+» против 42% с МОБ «-»). Это демонстрирует тот факт, что не все неблагоприятные генетические нарушения взаимосвязаны с МОБ статусом. При анализе ВРР у больных с устойчивой МОБ и наличием делеций гена IKZF1 в описанном исследовании наблюдались худшие результаты по сравнению с теми, у кого обнаружили только делеции, только позитивный МОБ статус или отсутствие того и другого. Вероятно, в нашем исследовании невысокая частота рецидивов, представленная одним случаем (16,6%), среди больных с делециями и положительным МОБ статусом, обусловлена тем, что больные с высокими значениями МОБ были переведены на другие линии терапии, что могло нивелировать роль неблагоприятных факторов.
Динамическое исследование внутригенных делеций гена IKZF1 качественным методом было выполнено 5 больным на 70 и 133 дни протокола ПХТ. В связи с отсутствием образцов ДНК костного мозга от контрольных дат 4 больным исследование не проводили. Результаты по определению делеций на 70 и 133 дни терапии методом ФА представлены в Приложении В2. У одного больного с АEx2-8 была констатирована рефрактерность к проводимой терапии на 70 день протокола, в этом случае выявленная исходно делеция при контрольном исследовании сохранялась (описание клинического случая представлено в разделе 3.1.4). У 4-х больных была достигнута ремиссия заболевания, и у 3-х из них определяемая в дебюте заболевания АEx4-7 на 70 и 133 дни терапии не детектировалась. У одного больного с наличием 3-х делеций в дебюте заболевания, АEx4-7, АEx4-8, АEx2-8, наблюдалась персистенция АEx4-7 как на 70, так и на 133 дни терапии, в то время как две другие делеции не были обнаружены. В последнем случае наличие нескольких внутригенных делеций у одного больного может являться следствием перестроек, происходящих в разных опухолевых клетках и дающих начало новым субклонам (описание клинического случая представлено в разделе 3.1.4).
Сопоставление результатов исследования делеций гена IKZF1 с данными о статусе МОБ на 70 и 133 дни лечения выполнено у 3 пациентов. Результаты представлены в Таблице 8. Из нее видно, что у двух больных с недетектируемыми делециями в котрольные даты значения МОБ был значительно ниже по сравнению с больным, у которого сохранялась делеция гена IKZF1. У одного пациента был достигнут МОБ-негативный статус (в таблице 8 пациент №16), у другого - наблюдалось снижение уровня МОБ к 133 дню и достижение МОБ негативности на поддерживающей терапии (в таблице 8 пациент №18). В дальнейшем у этих больных сохранялась клинико-гематологическая ремиссия заболевания и МОБ негативность. Сроки наблюдения на момент проведения анализа составили 31,8 мес. и 9,5 мес, соответственно. У пациента с персистенцией делеции IKZF1 на 70 и 133 дни терапии отмечены высокие значения МОБ, что определяло высокий риск развития рецидива (в таблице 8 пациент №21), и, как отмечено ранее, пациент был переведен на терапию с блинотумомабом в сочетании с весаноидом и дазатинибом с последующей ауто-ТГСК.
Тот факт, что при наличии одних и тех же внутригенных делеций гена IKZFJ, заболевание иногда характеризуется более агрессивным течением, свидетельствует о необходимости комплексной оценки всех факторов риска. По данным ряда исследований, определяемые в дебюте заболевания, внутригенные делеции IKZF1 приобретают клиническую значимость лишь в сочетании с исследованием клиренса МОБ, а также в комбинации с другими молекулярно-генетическими аберрациями [20, 196].
Исследование внутригенных делеций гена IKZF1 у больных Ph-позитивным В клеточным острым лимфобластным лейкозом
Исследование внутригенных делеций гена IKZF1 было выполнено 18 больным Ph-позитивным В-ОЛЛ. Делеции были обнаружены в 9 (50%) случаях и у 1 больного (6%) была диагностирована моносомия 7, что расценено как гаплонедостаточность исследуемого гена. Таким образом, в общей сложности выявлено 56% случаев с делециями гена IKZF1, что было достоверно чаще, чем при Ph-негативном В-ОЛЛ, где делеции этого гена были выявлены у 18% больных (p=0,0074). Характерная для Ph-позитивных ОЛЛ высокая частота делеций IKZF1 продемонстрирована в многочисленных исследованиях [91, 130, 147, 227]. Распределение вариантов делеций в нашем исследовании было следующим: АEx4-7 была выявлена у 4 больных (44%), АEx2-7 - также у 4 (44 %), АEx4-8 - у 1 (11%) и АEx2-8 у 1 (11%). Частота встречаемости различных вариантов делеций была сопоставима с таковой у больных Ph-негативным В-ОЛЛ. Результаты исследования делеций гена IKZF1 методом ФА (у всех больных) и методом секвенирования по Сэнгеру (у шести больных) представлены на Рисунке 11 и в Приложении В3.
А) Результат ФА. Синий пик в области амплификации длиной 233 н.п. позволяет идентифицировать наличие внутригенной делеции гена IKZF1 Ex2-7.
Б) Результат секвенирования по Сэнгеру в виде выявленной нуклеотидной последовательности гена с указанием локализации вставки.
Результаты анализа клинико-лабораторных характеристик больных Ph-позитивным В-ОЛЛ с делециями и без них представлены в Таблице 9.
Как представлено в Таблице 9, корреляции с исследуемыми параметрами такими, как возраст, пол, инициальный лейкоцитоз выше 30109/л, ЛДГ более 750 Ед/л, гепатомегалия, спленомегалия, нейролейкемия в зависимости от обнаружения делеций IKZF1 не установлено. У больных с делециями IKZF1 также, как и при Ph-негативном В-ОЛЛ, чаще наблюдался B(II) иммунофенотип – у 80%, однако различия с частотой других иммунологических подтипов не были значимы. В отличие от Ph-негативного при Ph-позитивном В-ОЛЛ не выявлено взаимосвязи между экспрессией миелоидных антигенов и наличием делеций гена IKZF1.
Эффективность лечения у больных Ph-позитивным В-ОЛЛ оценивали по молекулярному ответу на 70 день ПХТ в сочетании с ИТК первой линии (Таблица 9). BCR-ABL негативный статус был достигнут у 11(61%) больных, остальным 7 (38%) выполнена смена терапии ИТК. Наличие делеций гена IKZF1 не имело значения при оценке молекулярной ремиссии на 70 день – 70% больных с делециями IKZF1 и 38% без делеций достигли молекулярной ремиссии (р=0,16). Смертей в индукции не было зарегистрировано. Алло-ТГСК была выполнена 12 больным, из них 4-м во второй ремиссии заболевания, ауто-ТГСК выполнена 1 пациенту. Медиана времени до ТГСК составила 10,1 мес (5,8 – 17,9). Различий в долгосрочных результатах терапии (5-летние ОВ, БРВ, ВРР) также не обнаружено: среди больных В-ОЛЛ с делециями гена IKZF1 ОВ составила 60% (n=10), без них – 42% (n=8) (p=0,41), БРВ 25%(n=10) и 33%(n=7) (p=0,96), а ВРР 50% (n=10) и 50%(n=7), соответственно (p=0,92) (Рисунок 12).
Сходные с нашими данными результаты были продемонстрированы в исследовании H. Li и соавт., где корреляции между отсутствием молекулярного ответа и обнаружением делеций не наблюдалось. Однако комбинация этих факторов при оценке долгосрочных результатов была ассоциирована с худшим прогнозом [116]. По данным публикации M. Kim и соавт., напротив, у больных с делециями наблюдалась низкая частота молекулярного ответа по сравнению с больными с диким типом гена IKZF1 (28% против 56%, соответственно, р=0,028) [105]. В итальянском исследовании GIMEMA было продемонстрировано негативное прогностическое значение делеций IKZF1 при анализе выживаемости без болезни и ВРР [130].
Наряду с данными о неблагоприятной роли делеций гена IKZF1 при Ph-позитивном В-ОЛЛ, при мета-анализе с включением 1008 взрослых больных В-ОЛЛ из 8 исследований с применением различных схем ПХТ, было продемонстрировано, что делеции ассоциированы с худшим прогнозом при Ph-негативном, но не при Ph-позитивном В-ОЛЛ [227].
Ph-позитивный ОЛЛ представляет наиболее неблагоприятный вариант лимфобластных лейкозов. Несмотря на фундаментальное значение препаратов ИТК в терапии этого варианта заболевания, их возможности ограничены, и основной стратегией, направленной на излечение больных, является алло-ТГСК. Поэтому поиск дополнительных терапевтических мишеней особенно актуален как в отношении преодоления первичной рефрактерности к ИТК, так и в отношении рецидивов заболевания. При детекции делеций гена IKZF1 при Ph-позитивном В-ОЛЛ дополнительной терапевтической опцией могут быть дериваты ретиноевой кислоты, обладающие прямой и опосредованной способностью воздействия на опухолевые клетки [42].
Таким образом, прогностическая роль внутригенных делеций IKZF1 на протоколе ОЛЛ-2012 не доказана. Однако их обнаружение позволяет осуществление дополнительного терапевтического воздействия с помощью препаратов ретиноевой кислоты.