Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 11
1.1Историческая справка, эпидемиология, патогенез . 11
1.2 Классификация 15
1.3 Структура тромбоцитов. Функции тромбоцитов и их роль в механизмах гемостаза 15
1.4 Мегакариоцитопоэз 21
1.5 Антитромбоцитарные антитела 22
1.6 Лечение 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования . 37
2.1 Объекты исследования 37
2.2 Методы исследования 38
2.3 Специальные лабораторные исследования. Методика компьютерной морфометрии тромбоцитов 39
2.4 Методы статистической обработки результатов . 42
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение . 44
3.1 Клиническая характеристика пациентов 44
3.2 Витальная компьютерная фазово-интерференционная микроскопия тромбоцитов периферической крови у практически здоровых людей
3.3 Оценка морфометрических показателей тромбоцитов крови у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией методом компьютерной морфометрии . 50
3.4 Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии . 54
3.4.1. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии глюкокортикостероидами . 55
3.4.2. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне спленэктомии 57
3.4.3. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии внутривенным иммуноглобулином 59
4.4. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии агонистами тромбопоэтина . 61
3.5.Морфоцитометрические показатели тромбоцитов у больных ИТП в зависимости от уровня антитромбоцитарных антител 62
Глава 4. Оценка морфометрических показателей тромбоцитов крови у пациентов с вторичными тромбоцитопениями методом компьютерной морфометрии 91
Заключение . 95
Выводы . 102
Практические рекомендации 104
Библиография .
- Структура тромбоцитов. Функции тромбоцитов и их роль в механизмах гемостаза
- Специальные лабораторные исследования. Методика компьютерной морфометрии тромбоцитов
- Оценка морфометрических показателей тромбоцитов крови у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией методом компьютерной морфометрии
- Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне спленэктомии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Первичная иммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуются срывом толерантности к собственным антигенам тромбоцитов. Несмотря на многочисленные исследования, причины этого процесса к настоящему времени остаются не установленными.
Специалисты отмечают неоднородность патогенетических механизмов, лежащих в основе ИТП, отсутствие достоверных клинических и лабораторных показателей, позволяющих прогнозировать рецидивирование заболевания. Всё это диктует необходимость проведения широкого дифференциального поиска, внедрения новых высокочувствительных лабораторных методов обследования.
Не вызывает сомнения, что новые и информативные данные об особенностях патогенеза этого заболевания можно получить, изучая морфофункциональное состояние тромбоцитов. До последнего времени с этой целью использовали визуальный анализ микроскопического изображения, который не позволял с достаточной надежностью количественно оценить изменения элементов структуры тромбоцитов, их роль в различных нарушениях, в том числе и иммунологических конфликтах.
С появлением современных компьютерных технологий, основоположником которых в нашей стране является профессор Г.И. Козинец, принципиальным образом расширились возможности количественного изучения морфологии клеточных элементов системы кроветворения. Применение новых объективных количественных показателей позволило повысить информативность микроскопического исследования поверхности, формы, площади, объема, высоты и оптических свойств цитоплазмы тромбоцитов, а также изучить, каким образом изменения указанных параметров отражают функциональные особенности кровяных пластинок.
Изучение морфо-функционального состояния тромбоцитов методом компьютерной морфометрии имеет как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку способствует углублению представлений о патогенезе и особенностях течения первичной иммунной тромбоцитопении, проведению дифференциальной диагностики с другими тромбоцитопениями на качественно новом уровне, более детальному пониманию механизмов развития заболевания и оптимизации проводимой патогенетической терапии.
В связи с этим, несмотря на достигнутый за почти 25 лет прогресс в изучении механизмов развития, клинических особенностей и подходов к лечению, ИТП продолжает оставаться одной из актуальных дисциплинарных проблем современной гематологии, требующих разработки и внедрения в практическое здравоохранение новых информативных критериев, исследовательских методик и современного диагностического оборудования.
Цель исследования
Установить диагностическую и клиническую значимость витальных (прижизненных) показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у больных первичной иммунной тромбоцитопенией.
Задачи исследования
1.Выявить особенности витального морфофункционального состояния тромбоцитов у больных первичной иммунной тромбоцитопенией при установлении диагноза до терапии, сравнить полученные данные с аналогичными показателями у здоровых лиц.
2.Сравнить особенности морфофункционального состояния тромбоцитов у больных первичной иммунной тромбоцитопенией и тромбоцитопениями другого генеза.
3.Оценить динамику морфометрических показателей тромбоцитов при различных видах терапии больных с первичной иммунной тромбоцитопенией (глюкокортикостероиды, спленэктомия, иммуноглобулин, агонисты тромбопоэтина).
4.Оценить взаимосвязь уровня антитромбоцитарных антител и морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов у больных с иммунной тромбоцитопенией.
5.Определить диагностическую и прогностическую ценность метода в сравнении с другими диагностическими тестами.
Научная новизна
Выявлены и количественно оценены структурные особенности и функциональная активность тромбоцитов периферической крови при первичной иммунной тромбоцитопении. Установлено, что при ИТП, нарушения в тромбоцитарном звене связаны с изменениями функционального состояния клеток и морфологического состава циркулирующей популяции.
Впервые проведена комплексная оценка тромбоцитов периферической крови у пациентов с первичной и вторичной тромбоцитопенией, а также установлена возможность их дифференциации на основе морфометрических параметров клеток.
Выявлена корреляция между титром антитромбоцитарных антител и нарушениями морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови.
Проведен мониторинг динамики показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у пациентов с ИТП в зависимости от методов лечения. Установлено, что показатели морфофункционального состояния тромбоцитов могут служить критериями эффективности проводимой терапии. При этом в более ранние сроки нормализация морфометрических параметров циркулирующих тромбоцитов наблюдалась у больных при использовании внутривенного иммуноглобулина по сравнению с проведением спленэктомии или терапии ГКС.
Практическая значимость
Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов апробирован в клинической практике как скрининговый при обследовании больных с первичной иммунной тромбоцитопенией.
Повышение эффективности диагностики первичной иммунной тромбоцитопении на основе использования витальной компьютерной фазометрии позволяет своевременно выявлять нарушения, проводить адекватную профилактическую или лечебную их коррекцию, способствует уменьшению количества больных с тяжелыми формами заболевания, сокращению сроков временной нетрудоспособности, а также своевременной смены лечебной тактики терапии.
Основные положения, выносимые на защиту
Изменения тромбоцитов у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией заключаются в нарушении функциональной полноценности и морфологической структуры клеток, увеличении гетерогенности циркулирующей популяции.
Предикторами тяжести заболевания у больных с ИТП могут служить морфометрические показатели живых тромбоцитов периферической крови (увеличение их размерных параметров, повышение содержания активированных клеток).
Характер изменения морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с первичной иммунной тромбоцитопенией непосредственно определяется глубиной тромбоцитопении и титром циркулирующих антитромбоцитарных антител.
Публикации
Результаты исследований отражены в 7 публикациях, из них две в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы Апробация диссертации проведена 19 ноября 2012 года на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ “Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)”.
Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на II научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 49 отечественных и 76 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 18 таблицами.
Структура тромбоцитов. Функции тромбоцитов и их роль в механизмах гемостаза
Осложнения. В случае значительного снижения числа тромбоцитов возрастает риск профузных кровотечений с развитием тяжелой постгеморрагической анемии. Основная причина смерти, хотя и достаточно редкая (менее 1% при ИТП), внутричерепные кровоизлияния. Факторы риска последнего следующие: крайняя степень выраженности кожного геморрагического синдрома с локализацией петехий на слизистых полости рта, кровоизлияния в склеру, кровотечения из слизистых при количестве тромбоцитов менее 10-20000/мкл. У пожилых больных геморрагические осложнения встречаются чаще, чем у молодых с тем же числом тромбоцитов [16, 21, 49, 62, 72, 83, 109].
В формировании синдрома кровоточивости, кроме снижения уровня тромбоцитов в пределах 30-50тыс, играют роль и такой фактор как выраженная хрупкость капилляров; эта механическая слабость объясняется тем, что тромбоциты, кроме репарации поломок эндотелия, несут функцию поддерживания эндотелиального гомеостаза. [4, 10, 22, 47, 48, 76]. При тромбоцитопении во время беременности редко наблюдается истинная ИТП. Примерно в 75% случаев это тромбоцитопения беременных (обычно незначительное снижение числа тромбоцитов в поздние сроки беременности, спонтанно исчезающее после родов). Уменьшение числа тромбоцитов у 12% беременных объясняется возникновением гемоделюции, так как объем плазмы увеличивается быстрее объема клеточных элементов крови [12, 21, 32, 38, 45, 46, 118, 122, 124]. У новорожденных, чьи матери больны ИТП (в отличие от детей, родившихся у женщин с тромбоцитопенией беременных) может также наблюдаться транзиторная тромбоцитопения и повышенный риск развития внутричерепных кровоизлияний во время родов или после них. [45, 56, 84].
Классификация.
I. По продолжительности течения выделяют 3 варианта: острую (продолжающиеся менее 3 месяцев), персистирующую (от 3 до 12 месяцев) и хроническую формы ИТП. Хроническая форма ИТП, свойственная взрослому населению подразделяется на варианты: - легкая форма (с единичными рецидивами и количеством тромбоцитов выше критического уровня); - средне-тяжелая форма (рецидивы до 2-3-х раз в год); - тяжелая форма (более 3-х рецидивов в год)
II. По периоду болезни выделяют рецидив, клиническую компенсацию (отсутствие каких-либо проявлений геморрагического синдрома при сохраняющейся тромбоцитопении выше критического уровня) и клинико гематологическую ремиссию [20, 22, 60, 74, 76, 79, 94].
Диагностика ИТП основывается на установленных лабораторных критериях, отражающих повышенную продукцию и усиленный распад тромбоцитов. Они включают изолированную тромбоцитопению периферической крови, неизмененный костный мозг с нормальным или увеличенным количеством мегакариоцитов, наличие свободных или связанных антитромбоцитарных антител [6, 16, 19, 22, 60, 74, 94].
Структура тромбоцитов. Функции тромбоцитов и их роль в механизмах гемостаза. Тромбоциты, или кровяные пластинки, представляют собой третий форменный элемент крови, являясь цитоплазматическими осколками гигантских клеток костного мозга – мегакариоцитов. Тромбоциты выполняют в организме важные биологические функции, главным образом в процессах гемостаза. Их физиологическая активность связана с содержанием большого количества ферментов – тромбоцитарных факторов, которые определяют - 16 фибринопластические, тромбопластические, антигепариновые, адгезивные, ретрактильные, сосудосуживающие свойства тромбоцитов. [11, 12, 13, 47, 48]. Тромбоциты продуцируются в органах кроветворения гигантскими полиплоидными клетками - мегакариоцитами, от цитоплазмы которых они отшнуровываются в виде округлых или овальных плоских дисков диаметром от 2 до 4 мкм. В норме основным источником тромбоцитов служат зрелые, богатые зернистостью мегакариоциты, но при необходимости интенсивного воспроизводства их (например, при большой убыли из крови под влиянием антитромбоцитарных антител или при потреблении в процессе массивного свертывания крови) происходит отшнуровка частиц от более молодых клеток мегакариоцитарного ряда, в результате чего в циркуляции появляются крупные с базофильной цитоплазмой и незначительной зернистостью клетки протромбоциты [11, 15, 48].
Продолжительность жизни тромбоцитов человека составляет 7-10 дней. После выхода из костного мозга они циркулируют в крови и частично депонируются в селезенке и печени (около 20-25% всех клеток), откуда происходит вторичный их выход в кровоток. В среднем мегакариоцит высвобождает до 3000 тромбоцитов [11, 13, 48].
В крови здоровых людей содержится 150-400x109/л тромбоцитов. Общая популяция тромбоцитов представлена циркулирующими в крови (70%) и находящимися в селезенке (30%). Накопление тромбоцитов в селезенке возникает из-за их медленного движения через извилистые селезеночные корды, занимающего до 8 мин.
Специальные лабораторные исследования. Методика компьютерной морфометрии тромбоцитов
На определенном этапе для выявления антитромбоцитарных антител использовали иммунофлуоресцентный метод, предложенный в 1978г von dem Borne, который позволяет обнаружить антитела как связанные с тромбоцитами, так и циркулирующие в кровяном русле больного. В данной методике используется параформальдегид, который гасит неспецифическое свечение, образующееся при образовании комплексов «антиген + антитело», оставляя лишь связанное с антитромбоцитарными антителами. Это исследование может выполняться даже при низком содержании тромбоцитов в периферической крови. Метод иммунофлуоресценции тромбоцитов состоит в обнаружении тромбоцитарных антител с помощью меченных люминесцентным красителем иммунных сывороток против глобулинов человека. Прямой иммунофлуоресцентный тест позволяет выявить фиксированные на тромбоцитах антитела. Непрямой иммунофлуоресцентный тест дает возможность обнаружить тромбоцитарные антитела в сыворотке после ее инкубации с аутологичными или аллогенными тромбоцитами. Чувствительность метода составляет 85%[Катаджан1985].
К числу положительных характеристик этого метода следует отнести возможность идентификации находящихся на тромбоцитах антител класса IgG, IgМ, IgА. Однако этот метод имеет определенные ограничения, поскольку для получения положительной реакции на поверхности тромбоцита должно находиться, по крайней мере, 1000молекул IgG [19].
В последние годы применение усовершенствованного метода – иммуноферментного анализа (ИФА)(ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay) расширило клинико-диагностические возможности выявления антигенспецифических АТ-антител. Методические подходы, используемые в ИФА позволяют: 1) различать выработку специфических антитромбоцитарных антител от неспецифического повышения уровня тромбоцитассоциированного иммуноглобулина G; 2) отличать специфические антитела тромбоцитов от анти - 27 -HLA антител при рефрактерности к переливаниям тромбоцитов и 3) проводить аллотипирование индивидуальных белков при неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении. В последнее время наибольшее распространение получили несколько модификаций "сэндвич" ИФА с использованием моноклональных антител для иммобилизации антигена. В наиболее простой модификации “сэндвич” ИФА антигены иммобилизуют путем инкубации лизата тромбоцитов больного (прямой вариант) или донора (непрямой вариант) с сорбированными на пластик моноклональными антителами против антигенов мембраны тромбоцитов (ГП IIb-IIIa, ГП Ib и др.). В непрямом варианте тромбоциты донора предварительно обрабатывают сывороткой больного или проводят инкубацию с сывороткой после фиксации антигенов. Затем тромбоцит-ассоциированные антитела (прямой вариант) или сывороточные антитела (непрямой вариант), связанные с антигеном, выявляют с помощью меченых общевидовых антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с «проявителем» (чаще – щелочной фосфатазой или пероксидазой). В более сложных модификациях моноклональные антитела (в непрямом варианте вместе с сывороткой) сначала инкубируют с цельными тромбоцитами, а уже затем лизируют тромбоциты и фиксируют антигены на поверхности с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека или мыши. При ИТП положительные ответы в антиген- специфических тестах регистрируются у 80% больных при исследовании тромбоцит- ассоциированных антител и у 30-50% больных при исследовании сывороточных антител[24].
Радиоимунный анализ (РИА). Данный метод был изобретен в 1950-х годах прошлого столетия Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу. РИА основывается на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с последующей их детекцией на специальных счетчиках, так называемых, радиоспектрометрах. Таким образом, главное отличие радиоиммунного анализа от иммуноферментного анализа (ИФА) заключается в том, что вместо фермента антитело помечается изотопом. Как правило, для метки - 28 антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.
Радиоиммунный анализ обладает довольно высокой чувствительностью и специфичностью. Неоспоримым преимуществом РИА является возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Что касается недостатков, то они, как правило, связываются с ограничениями, определяемыми режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно коротким сроком годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки. Кроме того, диагностика посредством радиоиммунного анализа предусматривает наличие специализированной лаборатории, а также использование дорогостоящего оборудования (гамма счетчиков). Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью. В основе метода лежит использование поликлональных антител, меченных радиоактивным йодом I125 и направленных против иммуноглобулинов человека. К исследуемым тромбоцитам добавляют антитела против иммуноглобулинов класса G человека, меченные I125. После инкубации взвесь тромбоцитов, несущих на своей поверхности IgG, пропускают путем центрифугирования через раствор сахарозы для отделения не связавшихся с тромбоцитами меченных I125 антител (125I-АТ).
Оценка морфометрических показателей тромбоцитов крови у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией методом компьютерной морфометрии
Проведенное исследование показало, что у пациентов с легкой степенью тромбоцитопении при ИТП изменения морфометрических параметров тромбоцитов по отношению к норме выражены незначительно. Тромбоциты находится в начальной стадии активации: количество клеток покоя и активированных составляет 62% и 35% соответственно.
В группе пациентов со средней степенью тяжести заболевания изменения морфометрических показателей выражаются в значительном увеличении диаметра, периметра, площади и объема тромбоцитов при снижении фазовой высоты. Клеточное звено гемостаза находится в состоянии активации: содержание тромбоцитов покоя составляет 51%, активированных тромбоцитов; -43%, а дегенеративно измененных клеток — 6%.
У пациентов с тяжелой формой течения ИТП сохраняется характер изменения морфометрических параметров клеток, но они являются более значимыми. Функциональное состояние клеточного звена гемостаза находится в стадии активации с элементами декомпенсации: тромбоциты покоя составляют всего 40%, активированные клетки - 53%, дегенеративно измененные - 7%.
При оценке эффективности применяемых методов терапии больных ИТП отмечено, что у пациентов, получавших только традиционную глюкокортикостероидную терапию, даже несмотря на значительный подъем уровня тромбоцитов (больше 100 тысяч) к концу 1 месяца наблюдения, не вызвала значительных положительных сдвигов в морфофункциональном статусе тромбоцитов: преобладали диско-эхиноциты I и II порядка, тогда как количество форм покоя составило всего 54% (при норме 63—70%). Применение гормональных препаратов с целью предупреждения рецидива заболевания в малых дозах (5-10мг/день) выявило нормализацию морфофункционального статуса лишь к концу 3-го месяца лечения: содержание форм покоя (I тип) находилось на нижней границе нормы (55%), значительно снизилось содержание форм II типа.
У 14 пациентов с ИТП, в лечении которых применялись 2-ая линия терапии (спленэктомия), через 5 суток отмечены значительные изменения морфофункционального состояния тромбоцитов: резко возрос процент форм IV типа максимально до 18%, то есть после оперативного вмешательства идет резкий выброс дегенеративно разрушенных клеток. Однако через месяц и более при динамическом наблюдении соотношение всех форм постепенно нормализовалось до нормальных значений. Самый значительный результат был получен на фоне использования иммуноглобулина. У всех пациентов, получавших эту терапию, к 5 суткам лечения отмечены значительные положительные изменения морфофункционального состояния тромбоцитов: увеличилось содержание форм покоя — до 62% (при норме 63%), также нормализовалось соотношение форм II и III порядка. При анализе изменений размеров тромбоцитов установлено, что на фоне этой терапии одним из первых показателей уже через 5 дней от начала лечения нормализуется фазовая высота тромбоцитов. Данный метод лечения позволяет быстро купировать геморрагический синдром, в среднем на 2-3 сутки по сравнению с традиционными методами терапии. Результаты применения ВИГ в лечении пациентов с тяжелой формой первичной иммунной тромбоцитопенииидиопатической свидетельствуют о положительном влиянии на течение аутоиммунного процесса, которое может быть объяснено блокировкой Fc-рецепторов мононуклеаров макрофагальной системы селезенки, что препятствует преждевременной элиминации покрытых антителами тромбоцитов и способствует сохранению их в кровеносном русле. Кроме этого не исключается инактивация антитромбоцитарных аутоантител антиидиотипическими антителами, содержащимися в препаратах ВИГ.
У 6 пациентов, получающих аганисты тромбопоэтина, отмечается очень медленное восстановление морфометрических показателей.
Таким образом, морфометрические показатели циркулирующих тромбоцитов, определяемые экспресс-методом в режиме реального времени, являются объективными и информативными критериями, позволяя оперативно получать результаты мониторирования гемостаза пациентов при использовании различных методов терапии.
Анализ размерных показателей тромбоцитов позволил выявить некоторые закономерности динамики клеточных характеристик у пациентов с ИТП в зависимости от уровня антитромбоцитарных антител. С нарастанием титра АТА наблюдается активация тромбоцитов: прямопропорционально росту АТА возрастает процент активных форм тромбоцитов (II и III тип тромбоцитов), снижение высоты и увеличения геометрических параметров, что косвенно указывает на повышение скорости тромбопоэза у этой категории больных.
Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне спленэктомии
Для диагностики первичной иммунной тромбоцитопении, выявления осложнений и сопутствующих заболеваний, определения функционального состояния важнейших систем организма больные были обследованы с использованием комплекса клинико-лабораторных методов обследования: клинический анализ крови, исследование костномозгового кроветворения, определение уровня антитромбоцитраных антител, исследование на ВИЧ-инфекцию, исключение носительства вирусных гепатитов, ревматологические пробы (волчаночный антикоагулянт, антитела к кардиолипинам). Исследование морфологии и функциональной активности живых тромбоцитов периферической крови проводили в рамках одного метода - витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии, с использованием фазово-интерференционного комплекса «Цитоскан». Комплексный алгоритм фазометрии предполагал автоматическое определение заданных размерных параметров (диаметра, периметра, высоты, площади, объема) изучаемых отдельных цитообъектов и всей популяции тромбоцитов в целом, статистическую обработку данных и документирование результатов в виде протоколов. Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды MatLab и математического пакета "Statistica 6".
Преимущества использования КФМ для изучения тромбоцитарного звена гемостаза заключались в возможности исследования живых, не фиксированных и не окрашенных тромбоцитов; в реализации принципа индивидуального подхода к детальному анализу характеристик каждого цитообъекта; в оперативном получении высокоточных и объективных количественных данных на основе компьютерной технологии; в использовании универсальных критериев оценки клеточных параметров, характеризующих как морфологические, так и функциональные их особенности; в потребности малого (не более 1-1,5 мл) объема крови для проведения анализа; в отсутствии необходимости использования дорогостоящих реактивов или длительной пробоподготовки.
На основе полученных фазово-интерференционных портретов тромбоцитов были идентифицированы и охарактеризованы 4 основных морфофункциональных типа живых тромбоцитов, отражающих степень их активации в соответствии с различными вариантами формы клеток, рельефа поверхности, наличием, величиной и числом псевдоподий. Эти данные соотносятся с классификацией тромбоцитов по степени активации, принятой в отечественной и зарубежной литературе. К I морфофункциональному типу были отнесены гладкие и рифленые тромбоциты дискоидной формы без псевдоподий – клетки «покоя», ко II – тромбоциты с широкими короткими единичными отростками – тромбоциты с начальной стадией активации, к III типу принадлежат высокоактивированные клетки, отличающиеся наличием большого числа тонких длинных отростков, к IV – распластанные, широкие, вакуолизированные дегенеративно-измененные тромбоциты, представляющие собой клетки с опустошенным гранулярным аппаратом, израсходовавшие свой функциональный потенциал.
Процентное соотношение морфологических типов тромбоцитов у практически здоровых лиц выглядит следующим образом: 63% тромбоцитов представлено клетками «покоя», 21% - тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип). Количество клеток с длинными отростками – «антеннами» -высоко активированные тромбоциты – составляет 12% (III тип), а дегенеративно-измененные (IV тип) – всего 4%, у пациентов с ИТП I:II:III:IV типы тромбоцитов распределяются как 51:30:17:2% соответственно.
При выполнении данного исследования учитывалась степень тяжести течения ИТП. Критериями для условной оценки степени тяжести течения заболевания явились данные объективного осмотра, клинико-лабораторного обследования пациентов. Под легкой степенью тяжести течения понималось отсутствие геморрагического синдрома, снижение уровня тромбоцитов не более чем до 50тыс (тромбоцитопения в пределах 50-170 x1091/л).
Под течением средней тяжести – понимается наличие кожно-геморрагического синдрома в виде геморрагической сыпи на коже нижней половине туловища; умеренной интенсивности носовые, десневые кровотечения, а также наличие тромбоцитопении (уровень тромбоцитов колеблется в пределах 20-50 x1091/л). Количество рецидивов не более двух раз в год.
При тяжелой степени – выражен геморрагический синдром в виде геморрагической сыпи на верхней половине туловища, маточных, желудочно-кишечных, профузных носовых кровотечений, жалоб на головную боль, снижения остроты зрения с и/или снижением уровня тромбоцитов ниже 20тыс ( 20 x1091/л). Течение заболевания постоянно рецидивирующее (более 3-х рецидивов в год).
Наибольшее количество пациентов, принимавших участие в исследовании, было со средней степенью тяжести течения тромбоцитопенической пурпуры— 56 (41,48 %), с легким течением наблюдались 38 пациент (28,15 %) и с тяжелой степенью течения в исследовании приняли участие 41 пациент, что составило (30,37%).
Проведенное исследование показало, что у пациентов с легкой степенью тяжести течения иммунной тромбоцитопенией изменения морфометрических параметров тромбоцитов по отношению к норме выражены незначительно. Состояние клеточного звена гемостаза находится на начальной стадии активации: количество тромбоцитов покоя и активированных клеток составляет 62% и 35% соответственно. При этом значительной разницы в оптико-геометрических показателях живых тромбоцитов у пациентов с ИТП в сравнении с контрольной группой не наблюдается.
В группе пациентов со средней степенью тяжести заболевания, изменения, морфометрических показателей выражаются в значительном увеличении диаметра, периметра, площади и объема тромбоцитов при снижении фазовой высоты. Тромбоциты находится в состоянии активации: содержание тромбоцитов покоя составляет 51%, активированных тромбоцитов - 43%, а дегенеративно измененных клеток - 6%.