Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Механизм действия ингибиторов BCR-ABL 8
1.2 Редукция лейкемического клона у больных ХМЛ при длительном воздействии ИТК 9
1.3 BCR-ABL -зависимые механизмы резистентности
1.3.1 Вклад мутаций BCR-ABL в развитие резистентности к иматинибу 11
1.3.2 Клиническое значение мутаций при терапии ИТК 2ого поколения 19
1.3.3 Значение использования ИТК второго поколения в первую линию терапии в развитии мутаций BCR-ABL 22
1.3.4 Гиперэкспрессия BCR-ABL 24
1.4 BCR-ABL -независимые механизмы резистентности 24
1.4.1 Дополнительные хромосомные аномалии 24
1.4.2 Нарушение лекарственного транспорта 26
1.4.3 Другие BCR-ABL -независимые механизмы резистентности 28
1.4.5 Покоящиеся стволовые клетки ХМЛ 30
1.5 Клинические характеристики резистентности и факторы риска неудачи терапии ИТК 30
1.6 Резюме 33
Глава 2 Материалы и методы исследования 35
2.1 Характеристика группы пациентов 35
2.2 Методы исследования 39
2.3 Статистическая обработка данных 41
Глава 3 Результаты исследований 42
3.1 Оценка результатов терапии иматинибом 42
3.1.1 Оценка цитогенетического ответа 42
3.1.2 Оценка молекулярного ответа
3.2 Прогрессия заболевания и выживаемость на терапии ИТК 46
3.3 Факторы резистентности к иматинибу у больных ХМЛ
3.3.1 Время до начала терапии иматинибом 48
3.3.2 Предшествующая иматинибу терапия 50
3.3.3 Клинические показатели на момент диагноза на основе существующих прогностических моделей Sokal, EURO, ГНЦ 53
3.3.4 Нарушение режима терапии 56
3.3.5 Скорость достижения цитогенетической ремиссии 60
3.3.6 Значение большого молекулярного ответа на терапии иматинибом 65
3.3.7 Мутации гена BCR-ABL 66
3.3.8 Сочетание мутаций и дополнительных хромосомных аномалий 69
3.4 Оценка результатов терапии ИТК второго поколения 71
3.5 Факторы низкой эффективности при терапии ИТК2
3.5.1 Группы риска Sokal, Euro, ГНЦ 74
3.5.2 Фаза на момент начала терапии ИТК2 75
3.5.3 Тип резистентности на терапии иматинибом 76
3.5.4 Значение мутаций гена BCR-ABL при терапии ИТК2 77
3.5.5 Эволюция клонов с мутациями BCR-ABL во время терапии ИТК2 79
Заключение 84
Выводы 95
Список литературы
- Вклад мутаций BCR-ABL в развитие резистентности к иматинибу
- Статистическая обработка данных
- Прогрессия заболевания и выживаемость на терапии ИТК
- Сочетание мутаций и дополнительных хромосомных аномалий
Введение к работе
Актуальность исследования
Основным молекулярно-генетическим событием, приводящим к
лейкемической трансформации стволовых клеток и развитию хронического миелолекоза (ХМЛ) является образование гена BCR-ABL, который возникает в результате обмена генетическим материалом между хромосомами 9 и 22 (Ph+ хромосома). Продукт гена BCR-ABL - онкобелок р210, является тирозинкиназой, играющей ключевую роль в патогенезе заболевания [Daley et al 1990]. Изучение молекулярных основ ХМЛ привело к разработке препаратов - ингибиторов тирозинкиназ (ИТК), блокирующих патологический белок р210. Лечение ИТК первого поколения иматинибом изменило представление о возможности подавления Ph+позитивного гемопоэза. Больные, достигшие полного цитогенетического ответа, имеют достоверное преимущество в выживаемости по сравнению с больными, имеющими большую массу опухоли [Baccarani М. et.al 2009]. Вероятность достижения ПЦО по результатам различных клинических исследований значительно варьирует и составляет от 60 до 82 % [Baccarani et al 2009, 2013, De Lavallade et al 2008, Hughes et al 2010]. Вопросы стабильности цитогенетического ответа при длительной терапии иматинибом обсуждаются редко и наиболее полно отражены при анализе результатов международного исследования IRIS. Через 8 лет после начала терапии больных в ранней хронической фазе (РХФ) только 55 % из них продолжали прием иматинба [Hughes et al 2010]. Причинами прекращения являлись прогрессия ХМЛ, неэффективность или непереносимость. Полного цитогенетического ответа достигли 82 % больных, 17 % из них в дальнейшем потеряли ответ.
Ингибиторы тирозинкиназ второго поколения (ИТК2) (нилотиниб, дазатиниб и бозутиниб) за счет большей специфичности значительно более активно блокируют белок р210, в том числе и его мутантные формы. В литературе имеется большое число сообщений об эффективности ИТК2 по сравнению с иматинибом [Bradeen et al 2006, Garg et al 2009, Quintas-Cardama 2007].
Вероятная продолжительность жизни пациентов, которые достигли полного цитогенетического ответа (ПЦО), практически достигает уровня общей популяции [Gugliotta et al 2013]. У пациентов с более глубоким ответом, таким как большой молекулярный ответ (БМО) или полный молекулярный ответ (ШУЮ, М04 или М04,5) не показано достоверного преимущества в выживаемости, по сравнению с больными, достигшими ПЦО. Достижение более глубокого ответа позволяет уменьшить вероятность цитогенетического рецидива и прогрессии заболевания, а длительный стабильный глубокий молекулярный ответ дает возможность ведения ремиссии без лечения у значительной доли пациентов [Mahon F. X. et al. 2010, Ross D. M. et al 2013]. В настоящее время нет полного понимания того, какая доля больных может достичь глубокого молекулярного ответа и каково значение глубины ответа на отдаленные результаты терапии ИТК.
Успех, достигнутый ингибиторами BCR-ABL, был несколько омрачен развитием резистентности у некоторых пациентов. Наиболее изученным и общим механизмом резистентности является появление различных мутаций киназного домена BCR-ABL во время лечения. Довольно много данных накопилось о роли мутаций в развитии приобретенной резистентности, при этом частота, спектр мутаций, их потенциальное значение в развитии первичной резистентности исследовано недостаточно, особенно у больных, длительно получающих иматиниб. Единичные публикации посвящены значению и частоте сочетаний мутаций и дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) при терапии иматинибом и ИТК2. На сегодняшний день недостаточно представлены отдаленные результаты терапии при последовательном применении иматиниба и ИТК2 во вторую и третью линии лечения. Описаны противоречивые данные о значении исторически используемых прогностических моделей, клинических факторах, влияющих на эффективность терапии иматинибом и ИТК2 [Milojkovic D et al 2010, Jabbour E etal2011].
Цель исследования
Оценка возможности редукции Ph-позитивного лейкемического клона у
больных ХМЛ при длительной последовательной терапии ингибиторами тирозинкиназ первого и второго поколения. Уточнение роли различных уровней редукции опухоли для выживаемости, прогрессии и стабильности ответов. Определение частоты выявления и клинического значения мутаций BCR-ABL и дополнительных хромосомных аберраций у больных с неудачей терапии иматинибом и ингибиторами тирозинкиназ второго поколения.
Задачи исследования
1. Оценить возможность редукции опухолевого клона по данным
цитогенетического и молекулярного мониторинга при длительном воздействии иматиниба и ингибиторов тирозинкиназ второго поколения.
-
Проанализировать значение сроков достижения и степени редукции Ph-позитивного клона под воздействием ингибиторов тирозинкиназ на стабильность ответов, выживаемость и прогрессию заболевания.
-
Оценить значение мутаций BCR-ABL и дополнительных хромосомных аберраций для выживаемости и прогрессии заболевания у больных хроническим миелолейкозом с неудачей терапии иматинибом и ингибиторами тирозинкиназ второго поколения.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При длительной терапии иматинибом вероятность сохранения полного цитогенетического ответа достоверно больше у больных с большим и полным молекулярным ответом.
-
Достижение полного цитогенетического ответа на любом этапе терапии ХМЛ является ключевым благоприятным фактором общей выживаемости и выживаемости без прогрессии до фазы акселерации и бластного криза.
-
Позднее начало терапии иматинибом (более 12 месяцев) уменьшает вероятность достижения полного цитогенетического, большого и полного молекулярного ответов, увеличивает вероятность прогрессии заболевания.
-
Ингибиторы тирозинкиназ второго поколения позволяют восстановить полный цитогенетический ответ у 86% и достигнуть впервые у 41% больных с неудачей на терапии иматинибом.
-
Мутации гена BCR-ABL являются значимым фактором, влияющим на прогрессию и смерть у больных с неудачей терапии иматинибом и ИТК2.
Научная новизна исследования
Данное исследование позволило дополнить имеющееся на сегодняшний день представление об молекулярных и цитогенетических основах целенаправленной терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Впервые произведена оценка возможности достижения различных уровней снижения объема лейкемического клона у больных при длительном последовательном воздействии иматиниба и ИТК2. Представлены данные по выживаемости и вероятности прогрессии у больных в ранней и поздней ХФ ХМЛ, получающих терапию иматинибом и ИТК2 как во вторую, так и в третью линию при длительном наблюдении (Me 123 мес). Показана высокая прогностическая значимость цитогенетической и глубокой молекулярной ремиссии в не зависимости от срока ее достижения, при этом отмечено снижение вероятности получения цитогенетической ремиссии с каждым последующим годом терапии иматинибом. Впервые представлена текущая кумулятивная частота цитогенетической ремиссии у больных ХМЛ во время терапии иматинибом и после перехода на ИТК2. Описана частота и спектр мутаций BCR-ABL в зависимости от типа резистентности на терапии иматинибом, сочетание мутаций и ДХА, показано влияние мутаций BCR-ABL на выживаемость, прогрессию, достижение цитогенетической и молекулярной ремиссии, а также динамика клонов с мутациями на терапии ИТК2.
Практическое значение работы
Показано, что риск прогрессии ХМЛ до фазы акселерации и бластного
криза снижается при достижении полного цитогенетического ответа в не
зависимости от срока его достижения. Установлено значение большого
молекулярного ответа для снижения риска потери полного цитогенетического
б
ответа. Подтверждено, что время начала лечения (менее 12 мес. после установления диагноза ХМЛ) является ключевым фактором не только для достижения глубоких молекулярных ответов, но и для стабильного их сохранения. Показана высокая вероятность редукции опухолевого клона после переключения на ИТК2 у больных с неудачей терапии иматинибом. Продемонстрирована важность исследования мутаций гена BCR-ABL не только у больных с неудачей терапии иматинибом, но и при неэффективности ИТК2.
Публикации
Всего по теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из которых - 3 в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.
Апробация диссертации
Материалы диссертации представлены на I Конгрессе гематологов России (Москва, 2012), II Конгрессе гематологов России (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генетика опухолей кроветворной системы» (Санкт-Петербург 2015 г), симпозиуме "Итоги и перспективы терапии ХМЛ в Российской Федерации" (Москва 2015 г.), 20th Congress of European Hematology Association (Vienna, Austria), "European Investigators on Chronic Myeloid Leukemia (EI-CML)" meeting (Italy, Bologna 2015).
Личный вклад автора
Автором лично проведены планирование диссертационного исследования и анализ литературных данных, выполнено молекулярно-генетическое исследование мутаций гена BCR-ABL у части пациентов, осуществлены статистический анализ, обобщение и интерпретация полученных данных.
Структура работы
Вклад мутаций BCR-ABL в развитие резистентности к иматинибу
В процессе разработки и изучения ИТК2ого поколения нилотиниба и дазатиниба был показан их потенциал ингибировать мутантные формы BCR-ABL in vitro [226,176,188]. В одном из исследований показано, что нилотиниб и дазатиниб способны ингибировать большинство мутантных BCR-ABL с резистентностью к иматинибу, но с разной эффективность в отношении отдельных клонов (табл. 2). Так, клоны с T315I оказались нечувствительны к обоим препаратам. Концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) клонов с F317L и E255V дазатинибом оказалась соответственно в 9 и 14 раз выше, чем для немутантного клона по данным пролиферативного теста, а для Y253F/H, E255K/V и F359V была необходима в 10-35 раз большая 1С5о нилотиниба. Спектр высокорезистентных к нилотинибу и иматинибу мутантных клонов был сходен, так как их объединяла родственная химическая структура [176]. При исследовании чувствительности мутантнтых клонов BCR-ABL к бозутинибу было показано, что Т3151-клоны также устойчивы к бозутинибу, как и к другим ИТК. У299Ь-клоны, редко выявляемые на иматинибе, но достаточно высокорезистентные к дазатинибу, оказались также резистентны и к бозутинибу, а Е255К и E255V показали промежуточную чувствительность к бозутинибу in vitro [188].
Исследования по изучению мутагенеза при воздействии нилотиниба и дазатиниба ставили целью изучить, какие мутантные клоны окажутся чувствительными к этим препаратам. На дазатинибе чаще происходила селекция T315I и F317C/I/L клонов, реже всего определялись L248V, Q252H, Е255К и V299L мутации [30], на нилотинибе чаще селектировались T315I, Y253F/H и F359C/I/Vnpn этом L248V, G250E, Q252H, E255K/V, Е282К, K285N, F311I and W430L встречались крайне редко [30,221,187]. Полученные данные коррелировали с результатами исследований in vitro по оценке ингибирующей способности ИТК.
Во время клинических исследований дазатиниба и нилотиниба у больных с неудачей предшествующей терапии иматинибом особый интерес представляла эффективность терапии у больных с мутациями BCR-ABL и без мутаций, включая различия в эффективности в зависимости от типа мутаций. Результаты лечения дазатинибом у больных с неудачей терапии иматинибом после минимум двухгодичного наблюдения были подведены более чем у 1000 больных в ХФ ХМЛ. Среди 805 больных с резистентностью к иматинибу, у которых было выполнено исследование мутаций BCR-ABL, 48% имели мутации до начала терапии дазатинибом. Вероятность достижения ПЦО у больных с мутациями и без практически не отличалась (43% против 47%), однако двухлетняя выживаемость без событий (ВБС) была ниже у пациентов с мутациями (70% против 80%) [166]. Клинические результаты были сопоставимы с результатами лабораторных данных по чувствительности мутантных BCR-ABL к дазатинибу in vitro. Из 21 пациента с мутацией T315I 0% достигли ПЦО. Из 121 больного с мутациями, которые имели промежуточное значение чувствительности к дазатинибу in vitro (L248V, G250E, Q252H, E255K/V, V299L, F317L, L384M и F486S) [176,188], 32% получили полный цитогенетический ответ. Среди тех, у кого были мутации с высокой или неизвестной чувствительностью, ПЦО достигли 53 и 51% соответственно. Двухлетняя ВБС составила 67% в группе с промежуточной чувствительностью, 75% в группе с высокой чувствительностью и 80 % с неизвестной чувствительностью мутантных клонов к дазатинибу [166]. Данная работа показала, что предыдущие исследования in vitro могли лишь частично предсказать эффективность терапии дазатинибом у больных с мутациями, особенно это относится к группе мутаций, определяющих промежуточную чувствительность к дазатинибу. Некоторые мутации были ассоциированы с относительно неплохим уровнем достижения ПЦО, включая L248V (40%), G250E (33%), Е255К (38%), E255V (36%), кроме F317L (7%) или Q252H (17%) [166].
Аналогичное исследование было проведено у 200 резистентных к иматинибу пациентов, получающих нилотиниб и у которых было выполнено мутационное исследование перед сменой терапии. 55% больных имели мутации до начала терапии нилотинибом. Больные с мутацией T315I были исключены из анализа, а группа пациентов с мутациями, характеризующими низкую чувствительность к нилотинибу in vitro (Y253H, E255K/V и F359C/V), анализировались отдельно. Через два года наблюдения ПЦО достигли 47% больных (п=91) без мутаций, 4% из группы с мутациями низкой чувствительности к нилотинибу (п=14), 47% с другими мутациями. Двухлетняя ВБС составила 62% в группе без мутаций, 7% в группе с низкой чувствительностью и 55% в группе с другими мутациями [185]. В данном случае получилось, что in vitro данные IC50 нилотиниба по отношению к различным группам мутаций соответствовали полученным клиническим результатам терапии.
Суммируя данные исследований, можно выделить группу мутаций V299L, T315I/A и F317I/L, вызывающих клинически значимую резистентность к дазатинибу и группу Y253F/H, E255K/V, T315I и F359C/V - к нилотинибу [198,166,113,106,46,207,133]. Учитывая тот факт, что на терапии иматинибом у резистентных больных могут присутствовать несколько клонов с мутациями, выявляемых только высокочувствительными методами, их выявление в первые месяцы терапии ИТК 2ого поколения говорит об их присутствии до начала этой терапии [69]. Выявление новых мутантных клонов в более поздние сроки, вероятно, говорит об их развитии и селекции уже под воздействием терапии ИТК 2ого поколения.
Стало понятно, что только данных in vitro по чувствительности отдельных мутантных клонов недостаточно для принятия решения о выборе терапии ИТК [143]. Так, авторы использовали известные данных по IC50 для нилотиниба и дазатиниба для достижения соответствующих пиковых концентраций этих препаратов в плазме больных. Для обоих препаратов вероятность достижения ПЦО слабо коррелировала с установленным уровнем 1С5о- Помимо 1С5о и пиковой концентрации препарата в плазме существуют другие факторы, которые определяют чувствительность мутантных клонов, среди них уровень связывания препарата с белками плазмы, механизмы клеточного поступления и выведения препарата и другие фармакокинетические факторы. Только клинические данные способны ответить на вопрос о предпочтении выбора ИТК2 у больных с мутациями и неудачей лечения иматинибом.
Brandford и соав. разработали рекомендации по выбору ИТК2 у больных с резистентностью к иматинибу и мутациями, основываясь на суммированных данных исследований с высоким уровнем доказательности. Больные с мутацией F317 не должны получать терапию дазатинибом, в то время как мутации Y253, Е255 и F359 являются противопоказанием к назначению нилотинба. При наличии T315I оба препарата не показаны, при этом рекомендовано выполнение аллоТГСК или использование экспериментальной терапии [22]. Клинически значимые при выборе между нилотинибом и дазатинибом мутации были выявлены у 28% больных с мутациями, а ассоциированные с недостаточным клиническим эффектом обоих препаратов в 43%.
Мутационное исследование также имеет значение при смене одного ИТК2 на другой при развитии клинически значимых для каждого препарата мутаций на терапии. При этом следует обратить внимание, что резистентность к терапии нилотинибом или дазатинибом при отсутствии мутаций говорит о вовлечении других механизмов резистентности.
Статистическая обработка данных
Медиана терапии иматинибом до переключения на ИТК2 составила 61 мес. (10-147 мес, ИР 45-85 мес). Терапию нилотинибом получали 70,9% (п=56) больных, переведенных на ИТК2, из них в качестве второй линии терапии 69,6% (п=39), третьей линии терапии 26,8% (п=15), четвертой линии 3,6% (п=2). Терапию дазатинибом получали 60,8% (п=48) больных, из них в качестве второй линии терапии 43,7% (п=21), третьей линии терапии 54,2% (п=26), четвертой линии 2,1% (п=1). Терапию бозутинибом получали 10,1% (п=8) пациентов, по 4 во вторую и третью линию.
Полный гематологический ответ констатировали при уровне лейкоцитов менее 10х109/л, базофилов менее 5%, отсутствии в гемограмме миелоцитов, промиелоцитов, миелобластов, уровне тромбоцитов менее 450x109/л, непальпируемой селезенке. Мониторинг показателей гемограммы осуществлялся 1 раз в месяц до достижения ПГО, далее не реже 1 раза в год. Внепланово клинический анализ крови выполнялся при подозрении на потерю гематологического ответа. Отсутствие ПГО через 3 месяца терапии считалось неудачей лечения, у больных констатировалась первичная гематологическая резистентность (рефрактерность). Потеря ПГО на любом сроке терапии также считается неудачей терапии. В данном случае у больных констатируется гематологический рецидив - вторичная гематологическая резистентность. Цитогенетический мониторинг осуществлялся каждые 6 месяцев до достижения ПЦО. После достижения ПЦО 1 раз в год или при подозрении на потерю цитогенетического ответа. Потерей ПЦО считалось повышение Ph+ клона более чем в 30% клеток при повторном цитогенетическом исследовании. Дополнительные хромосомные аномалии были выявлены у 7,7% (п=18) больных, из них у 13 в Ph-позитивных клетках. Хромосомные перестройки «большого пути» определялись у 4 больных (22,2%). Молекулярное исследование выполнялось всем больным, начиная с 2005 года, когда стала доступна методика определения относительной экспрессии гена BCR-ABL. Молекулярный мониторинг осуществлялся не реже 1 раза в год. Показанием для выполнения исследования мутаций BCR-ABL было наличие резистентности к проводимой терапии иматинибом, прогрессии заболевания, а также планируемый переход на ИТК2. Больным, получающим ИТК2, мутационное исследование проводилось при отсутствии уменьшения опухолевой массы по данным цитогенетического и/или молекулярного мониторинга через 12 месяцев терапии, признаках прогрессии заболевания, а также перед планируемой сменой ИТК. Исследование мутационного статуса было выполнены 68 пациентам с резистентностью к иматинибу. Мутации были выявлены в 32,4% (п=22) случаев, при этом у двух больных было выявлено одновременно 2 мутации. У пациентов, получавших ИТК2, исследование мутационного статуса было выполнено в 22 случаях (27,8% от всей группы): у 13 во время терапии дазатинибом, у 7 во время терапии нилотинибом, у 4 - бозутинибом. Мутации были выявлены в 12 случаях (54,5%). При этом у двух больных были выявлены две мутации.
Цитогенетическое исследование клеток костного мозга и FISH-исследование выполнялось с целью диагностики и мониторинга эффективности терапии пациентов с ХМЛ в кариологической лаборатории Гематологического научного центра. Цитогенетическое исследование проводилось на препаратах хромосом, дифференциально окрашенных по длине методом G-окраски. Для обнаружения химерного гена BCR-ABL методом молекулярной цитогенетики (FISH) использовалась двухцветная флуоресцентно-меченая проба для флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) хромосом, предназначенная для детекции слитного гена BCR/ABL.
С целью количественной оценки экспрессии химерного гена BCR-ABL типа р210 проводили исследования методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, включающей этапы выделения РНК, постановки реакции обратной транскрипции и проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Для определения нуклеотидной последовательности гена BCR-ABL производили выделение РНК из стабилизированной «Средой-РНК» («ИнтерЛабСервис») крови гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом. 1 мкг выделенной РНК отбирали для проведения реакции обратной транскрипции. Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор RT-Dx Kit («IPSOGEN») включающий в себя буфер для обратной транскрипции, смесь дНТФ, смесь «случайных» гексамерных праймеров, обратную транскриптазу и ингибитор РНКаз. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для клонирования, методом ПЦР, участка киназного домена гена BCR-ABL длиной 1500Ьр. Контроль результатов амплификации осуществляли посредством электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. При успешно проведенной амплификации (в геле визуализировался ПЦР-продукт искомой длины) вырезали участок геля содержащий ампликоны кДНК BCR-ABL. Амплифицированные фрагменты ДНК очищались методом сорбции на борсиликатной мембране с помощью колонок AxyPrep DNA Gel Extraction Kit («Axygen»). Выделенная из агарозного геля ДНК использовалась в качестве матрицы для постановки реакции секвенирования. Реакцию секвенирования осуществляли при помощи набора Beckman Coulter Genome Lab Method Development Kit («Beckman Coulter»). После проведения реакции продукты ее очищались, растворялись в формамиде высокой степени очистки и подвергались капиллярному электрофорезу при помощи генетического анализатора Beckman Coulter CEQ-8000. Анализ нуклеотидной последовательности и поиск мутаций проводился на программном обеспечении CEQ-8000 Genetic Analysis System v.6.0.75 («Beckman Coulter»). Референтная последовательность ДНК, мРНК гена ABL, а также аминокислотная последовательность ABL-тирозинкиназы получена из баз данных «The National Center for Biotechnology Information» (NCBI).
Прогрессия заболевания и выживаемость на терапии ИТК
Всего за весь период терапии иматинибом ПЦО достигли 72% (п=169/235), медиана (Me) времени до получения ПЦО во всей группе составила 34 мес. (ИР 17-59 мес). Потеряли достигнутый ранее ПЦО 25% (п=43/169), или 18% от всей группы. Данная категория в дальнейшем будет рассматриваться как больные с вторичной цитогенетической резистентностью. Me длительности ПЦО до потери в этой группе составила 31,5 мес (ИР 18-60 мес) Не достигли ПЦО за весь период терапии иматинибом 28,1% (п=66). При дальнейшем анализе эта группа будет отнесена к больным с первичной цитогенетической резистентностью к иматинибу. Кумулятивная частота достижения ПЦО через 10 лет терапии иматинибом составила 80,5% (Рис.3). Вероятность потери ПЦО на терапии иматинибом за тот же срок составила 28% (Рис.4). Текущая кумулятивная частота (Рис.5) отображает вероятность пребывания больных в цитогенетической ремиссии в каждый момент времени с учетом достижения и потери ПЦО на иматинибе.
Оценка уровня экспрессии гена BCR-ABL стала доступна с 2005 года, когда была внедрена в клиническую практику методика ОТ-ПЦР РВ, поэтому корректно оценить кумулятивную частоту достижения БМО возможно только у 222 больных. У 178 больных проводился регулярный молекулярный мониторинг, у 44 на терапии иматинибом не проводился молекулярный мониторинг, при этом у них не было ПЦО за весь период терапии иматинибом, что позволило отнести их к группе больных, не достигших БМО. БМО был получен у 126 больных (53,6% от всей группы, 70,8% от исследованных больных). Стабильная потеря БМО наблюдалась у 11,1% (n=14). Me времени до потери БМО составила 9,7 мес. (ИР 7,6-34,7 мес). Расчетная 12-летняя кумулятивная частота достижения БМО на терапии иматинибом составила 76% (Рис.6). Вероятность потери БМО через 10 лет составила 18% (Рис.7)
Вероятность потери БМО на иматинибе Наибольший интерес представляла оценка возможности максимальной редукции опухолевого клона до уровня, соответствовавшего стабильному полному молекулярному ответу со снижением на 4 log (М04), т.е. уменьшение уровня экспрессии BCR-ABL до 0,01% и ниже по данным минимум двух последовательных анализов за последние два года терапии иматинибом. Кумулятивная частота достижения М04 через 12 лет терапии иматинибом составила во всей группе 47% (рис. 8), при этом она достоверно отличалась у больных в РХФ и ПХФ (рис.9)
Кумулятивная частота М04 в РХФ и ПХФ на иматинибе 3.2 Прогрессия заболевания и выживаемость на терапии ИТК
За весь период наблюдения прогрессия до ФА и БК была зафиксирована у 15,3% (п=36/235). За время терапии иматинибом прогрессия в продвинутые фазы заболевания наблюдалась у 11,5% (п=27/235), еще у 3,8% (п=9/235) прогрессия случилась за время лечения ИТК2, что соответствует 11,4% (п=9/79) от всех больных, получавших ИТК2. Из 36 больных прогрессия до ФА была у 27,7% (п=10), БК у 72,3% (n=26). Me времени до прогрессии составила 36,5 мес. (ИР 17,5-59). Умерли 88,9% (п=32/36) больных в продвинутых фазах. 12-летняя выживаемость без прогрессии составила 82% (Рис. 11)
Всего за весь период терапии ИТК умерли 18,7% (п=44/235) пациента. От прогрессии ХМЛ умерли 13,2% (п=31/235). Общая 12-летняя выживаемость на терапии ИТК составила 79% (Рис.10).
Прогрессия в продвинутые фазы является крайне неблагоприятным исходом заболевания. Это обусловлено низкой эффективностью дальнейшей терапии ИТК и высокой летальностью. Me выживаемости после прогрессии составила всего 9 месяцев (рис.13). При анализе глубины ответа у больных с прогрессией было показано, что 81% (п=29) не достигли ПЦО за весь предшествующий период терапии иматинибом, 19% (п=7) потеряли ПЦО до развития ФА или БК. Доля больных с прогрессией в зависимости от цитогенетического ответа представлена на рисунке 14. 1 Время (мес.) Рисунок 13. OB от даты прогрессии в ФА/БК (п=3б)
Был показан значительный вклад фактора длительности заболевания до начала терапии иматинибом в развитие прогрессии у больных ХМЛ. Больные, начавшие лечение в ПХФ, имели достоверно меньшую выживаемость без прогрессии в ФА и БК (рис. 15), меньшую частоту достижения ПЦО на терапии иматинибом (Рис. 16), большую вероятность потери ПЦО (Рис. 17), чем больные в РХФ. 1,0
Сравнительный анализ выживаемости без прогрессии на терапии ИТК в зависимости от длительности заболевания до начала лечения иматинибом
Меньшая вероятность достижения ПЦО в группе ПХФ говорит о влиянии данного фактора на развитие первичной цитогенетической резистентности у данной категории больных.
Для оценки влияния фактора предлеченности больных миелосаном было оценено его влияние на прогноз заболевания, а также эффективность терапии иматинибом. Всего терапию миелосаном до начала ИТК получали 7,2% (n=17/235). Me длительности терапии миелосаном составила 5 мес. Учитывая тот факт, что миелосан использовался только в группе ПХФ, для более достоверной оценки все расчеты проводились в группе ПХФ.
Сочетание мутаций и дополнительных хромосомных аномалий
Больше всего было выявлено мутаций в области Р-петли (41,7%), фосфатного домена тирозинкиназы, для которого характерно специфичное стабилизирующее структуру белка пространственное расположение при неактивной конформации BCR-ABL. Мутации данной способны приводить к нарушению пространственной структуры и переводу BCR-ABL в активную конформацию, что может послужить ключевым фактором снижения ингибирования мутантного клона, так как иматиниб взаимодействует только с неактивной формой BCR-ABL-киназы. К области АТФ-связывающего домена (ИТК-связывающего участка) относились 20,8% обнаруженных мутаций. При наличии мутаций данного региона происходит снижение афинности BCR-ABL-киназы и иматиниба или ингибирование его пространственного связывания. К области каталитического домена относились 20,8% выявленных мутаций. Мутации данного региона, который участвует во взаимодействии с белками-регуляторами и передаче внутриклеточных сингалов, предположительно, могут стимулировать аномально высокую тирозинкиназную активность. К области А-петли относились 16,7% мутаций. А-петля - участок тирозинкиназы, который закрывает каталитический центр при сохранении неактивной конформации BCR-ABL. Мутации этого участка киназного домена также способны изменить пространственное расположение петлевой структуры и переводить белок в активную конформацию. Мутации, влияющие на выбор ИТК2 были выявлены в 36,4% (п=8). Среди них F317L (n=2), T315I (п=1), вызывающие клинически значимую резистентность к дазатинибу и Е255К (n=4), F359C (п=2), T315I (п=1), вызывающие клинически значимую резистентность к нилотинибу. Выбор дальнейшей терапии ИТК2 у этих больных осуществлялся с учетом предполагаемой чувствительности мутантных клонов.
По данным проведенного анализа вероятность прогрессии в продвинутые фазы ХМЛ была выше в группе больных, у которых были выявлены мутации киназного домена BCR-ABL (Рис.30). 1,0
Сравнительный анализ выживаемости без прогрессии на терапии ИТК от даты исследования мутационного статуса. По результатам проведенного анализа можно сделать заключение, что выявление мутаций гена BCR-ABL у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, сопряжено с худшим прогнозом заболевания, увеличением вероятности прогрессии заболевания в продвинутые фазы вследствие снижения эффективности ингибирования мутантной BCR-ABL-киназы иматинибом. По данным литературы известно, что частота развития мутаций больше у больных с рецидивом заболевания, чем у больных с первичной рефрактерностью [206]. В данной группе больных не было показано достоверной разницы в частоте выявления мутаций у пациентов с отсутствием ПЦО за все время терапии иматинибом и с потерей ранее достигнутого ПЦО. Возможно, это связано с тем, что группа больных с первичной резистентностью длительно получала иматиниб до перехода на ИТК2 (Me 49 мес), а длительно существующий BCR-ABL-позитивный клон сам является фактором геномной нестабильности и может приводить к появлению и дальнейшей селекции резистентных к иматинибу клеточных линий с мутациями BCR-ABL.
Сочетание мутаций и дополнительных хромосомных аномалий В настоящее время известно, что геномная нестабильность, возникающая вследствие образования BCR-ABL киназы, приводит к появлению ДХА и мутаций, а в итоге это приводит к прогрессии в продвинутые фазы ХМЛ. Наиболее неблагоприятными для прогноза заболевания считаются трисомия 8 хромосомы, удвоение Ph-хромосомы и изохромасома 17. Частота и клиническое значение сочетания ДХА и мутаций BCR-ABL в настоящее время недостаточно описаны. ДХА в Ph-позитивных клетках были выявлены у 6 % (п=13/235). Спектр выявленных ДХА в Ph-позитивных клетках представлен в таблице 7.
Сочетание мутаций гена BCR-ABL и ДХА в Ph-позитивных клетках было выявлено у 54% (п=7/13) больных с ДХА. Из 7 больных с сочетанием ДХА и мутаций за все время наблюдения умерло 57% (п=4/7). Больные с ДХА, но без мутаций (п=6) за весь период наблюдения живы все, у одного больного случилась прогрессия в ФА. Общая выживаемость
Терапию ИТК2 получали 79 человек (33,6% от всей группы). Me длительности терапии ИТК2 составила 59 мес. (ИР 25-80 мес). Переведены на ИТК2 из-за первичной цитогенетической резистентности 57% (п=45), в связи с отсутствием гематологического ответа на иматиниб 5% (п=4), из-за потери цитогенетического ответа на иматиниб 29% (п=23), трое пациентов были переведены на ИТК2 из-за токсичности иматиниба и имели ПЦО на момент перевода. Еще 5% (п=4) были переведены на ИТК2 при наличии ПЦО, но при отсутствии БМО. Итого на момент начала терапии ИТК2 не имели ПЦО 72 пациента. Оценка цитогенетического ответа проводилась 95,8% (п=69) больным из 72. За все время терапии ИТК2 ПЦО был достигнут у 65,2% (п=45/69), при этом впервые ПЦО за все время терапии ИТК был достигнут у 50% (п=20) из 40 больных с первичной цитогенетической резистентностью к иматинибу. Me времени достижения ПЦО наИТК2 составила 11 мес. (ИР 5-21 мес).
Для того, чтобы нагляднее продемонстрировать вклад ИТК2 в возможности преодоления цитогенетической резистентности на терапии иматинибом, проведен анализ текущей кумулятивной частоты цитогенетического ответа на терапии иматинибом и после перехода на ИТК2 (Рис.39).