Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение свойств эмбриональных и взрослых стволовых клеток в настоящее время является наиболее интенсивно развивающейся областью биологии и медицины. Наличие во взрослом организме стволовых клеток, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и способны дифференцироваться во все виды клеток той или иной ткани, показано для кроветворной системы, скелета, кожи, кишечника, мозга и других систем. Было выдвшгуго предположение, что не только нормальные ткани взрослого организма, по и опухоли тоже обладают стволовыми клетками. Открытие клоналыюсти лейкозов привело к возникновению понятия лейкозных стволовых клеток (ЛСК) - небольшой популяции клеток, которые производят основную массу опухолевых клеток и ответственны за длительное поддержание опухоли. Понимание концепции ЛСК, изучение их свойств и отличий от нормальных стволовых кроветворных клеток (СКК) привело к открытию и применению лекарственных препаратов, нацеленных на причину болезни, а не на её симптомы, к возникновению новых курсов химиотерапии, постоянному мониторингу минимальной остаточной болезни у больных, например, хроническим миелолейкозом (ХМЛ). Одним из специфических препаратов является ингибитор тирозиновых киназ STI 571, известный как Гливек (Иматиниб), который на сегодняшний день является терапией 1 линии при ХМЛ и приводит к 96% полных гематологических ответов у этих больных. К сожалению, этот препарат является не полностью специфичным и помимо активности сливного белка BCR-ABL, который является причиной ХМЛ, ингибирует и другие тирозиновые киназы, важные для нормального функционирования СКК. Результатом изучения отличий между ЛСК и СКК и специфических сигнальных каскадов, активированных в ЛСК, станет возникновение лекарственных средств, избирательно действующих на ЛСК.
Дальнейшее изучение ЛСК привело к гипотезе о том, что многие лейкозы организованы в иерархию клеток, аналогичную иерархии нормальных кроветворных клеток, на вершине которой находится ЛСК, способная к самоподдержанию и дифференцировке, ниже располагаются активно пролиферирующие н частично дифференцированные потомки ЛСК, а подножие составляют клетки основной массы опухоли, не способные к самоподцержанию.
Одним из главных инструментов для изучения нормальных СКК и ЛСК являются мышиные модели лейкозов. Широкое применение в изучении острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) получили иммунодефицитные NOD/SCID мыши. Серийные трансплантации человеческих клеток от больных ОМЛ таким мышам позволили, например, оценить концентрацию ЛСК в данном типе лейкозов. Для изучения ХМЛ активно используются
трансгенные мыши, в геном которых встроен гибридный ген, кодирующий BCR-ABL. Отдельную проблему при изучении ЛСК составляет их низкая концентрация в общей популяции опухолевых клеток, которая может составлять всего 1 ЛСК на 2500000 клеток опухоли. Проводится специальный генный скрининг для получения мышиных моделей различных гематологических заболеваний для изучения их ЛСК и подбора специфической для данного заболевания терапии.
Одна из таких моделей представлена и охарактеризована в данной работе. Согласно гипотезе В.Г. Савченко, трансформированные клетки, способные привести к лейкозу, находятся в КМ людей с рождения, но находятся в «дремлющем» состоянии. Лейкоз не возникает до тех пор, пока такая клетка не получит сигнал к пролиферации. Если стимулировать кроветворные клетки-предшественники к делению, то повышается вероятность того, что «дремлющая» трансформированная клетка войдет в клеточный цикл, что приведет к возникновению лейкоза. Эта гипотеза была проверена на мышах, которым в качестве стимулятора к пролиферации кроветворных предшественников использовали гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ). У мышей после нескольких курсов введения Г-КСФ развились различные гематологические заболевания. В том числе у одной из них был обнаружен миелоидный лейкоз, который оказался перевиваемым, то есть заболевание можно было перенести сингенным реципиентам клетками костного мозга мышей, находившихся в терминальной фазе лейкоза Согласно международной классификации мышиных лейкозов, описанное заболевание характеризуется как подобный миелопролиферативному заболеванию лейкоз с элементами гистиоцитарной саркомы. При этом заболевании опухолевые клетки активно инвазируют печень и животные погибают очень быстро от острой печеночной недостаточности.
Цель работы:
Цель данной работы состояла в том, чтобы охарактеризовать полученный миелоидный лейкоз на клеточном и молекулярном уровне и выяснить возможный механизм произошедшей опухолевой трансформации, изучить свойства ЛСК данного заболевания и исследовать иерархию опухолевых клеток.
Задачи:
Выяснить, какие популяции клеток костного мозга способны переносить заболевание сингенным реципиентам.
Установить концентрацию ЛСК в различных популяциях клеток, переносящих заболевание.
Сравнить костный мозг больных и здоровых мышей и установить изменения, происходящие на клеточном и генетическом уровне.
Установить роль Г-КСФ в возникновении данного лейкоза
Проследить за динамикой заселения печени лейкозными клетками.
Получить популяцию, обогащенную ЛСК, и изучить их свойства, анализируя экспрессию генов.
Научная новизна:
Показано, что ЛСК содержатся в популяции, несущей как маркеры ранних кроветворных предшественников, так и монопотентных клеток-предшественников. Установлено, что лейкоз организован в иерархшо, которая подобна иерархии нормальных кроветворных клеток, однако, способность к самоподдержанию и переносу заболевания сохраняется на каждой ступени иерархии опухолевых клеток. Этот результат позволяет объединить две существующие на данный момент концепции организации лейкозов - иерархическую и стохастическую. Обнаружено, что микроокруженис печени способно поддерживать пролиферацию ЛСК, что позволяет утверждать существование ниш, поддерживающих кроветворение в печени, не утраченных и после окончания эмбрионального кроветворения в этом органе. Показано, что одним из компонентов этих ниш являются хемокины, секретируемые печенью, и их рецепторы на поверхности опухолевых клеток. Удалось выделить популяцию клеток, обогащенігую ЛСК, и установить гены, экспрессия которых повышена в ЛСК. Показано, что многие факторы транскрипции принимают участие в возникновении данного лейкоза. Установлено, что в ЛСК активирован сигнальный путь NF-кВ, что может способствовать удержанию ЛСК в кроветворных нишах печени. В целом, обнаружены новые свойства ЛСК.
Научно-практическое значение работы:
Результаты исследований могут быть использованы в экспериментальной гематологии. Использование охарактеризованной модели может привести к лучшему пониманию клеточной организации гемобластозов, механизмов инвазии лейкозными клетками экстрамедуллярных территорий и к разработке препаратов, препятствующих распространению опухоли. Данная модель может служить инструментом для изучения свойств ЛСК и поиска их отличий от нормальных СКК, что имеет значение для мониторинга и предотвращения рецидивов лейкозов.
Положения, выносимые на защиту:
Изучаемое гематопролиферативное заболевание переносится лейкозными стволовыми клетками (ЛСК), организованными в иерархию, на вершине которой находятся ранние мультипотентные предшественники. Клетки, находящиеся на более низких ступенях иерархии, с дифференцировочными маркерами коммитированных предшественников сохраняют свойства ЛСК и могут переносить заболевание при пассировании in vivo.
Основная масса опухолевых клеток инвазирует печень. По мере развития заболевания в печени нарастает количество CD45 положительных клеток, что приводит к гибели животных от печеночной недостаточности.
3. Заселение опухолевыми клетками печени может быть обусловлено повышенной
экспрессией на них рецепторов к некоторым хемокинам, секретируемым клетками печени, а
также способностью опухолевых клеток использовать строыальное микроокружение печени
в качестве «ниш» для ЛСК.
4. В опухолевых клетках значительно увеличена экспрессия онкогенов, генов, отвечающих за
самоподдержание, пролиферацию, адгезию клеток к субстрату. Активированы многие
факторы транскрипции, в том числе сигнальные пути NF-kB и Runx 1, связанные с
опухолевой трансформацией.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Апробация работы
Диссертационная работа апробирована 31 мая 2010 года на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.
Материалы работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:
"Alterations in gene expression in murine leukemia cells developed after G-CSF treatement." 11th Congress of the European Hematology Association, Amsterdam, The Netherlands, June, 2006.
"Analysis of gene expression pattern in bone marrow and liver of mice developed myeloproliferative disease after long-term G-CSF treatement" 12th Congress of the European Hematology Association, Vienna, Austria, June 7-10,2007.
. Characteriazation of gene expression in malignant hematopoietic cells invading the liver of mice developed transplantable myeloproliferative disease. 36th Annual Scientific Meeting of ISEH International Society for Hematology and Stem Cells, Hamburg, Germany, September 28-30,2007.
"Dynamics of leukemia development on murine model of myeloproliferative disorder. Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis and
hematopoiesis/lymphopoiesis", Summer School of Mechanisms of Early Differentiation, Barsmghausen, Germany, September 1-5,2008.
"Murine myeloproliferative disorder with liver lesion: characteristics of leukemia stem cells and phenotype of cells invaded liver." 14th Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 12-15,2009.
"Characteristics of leukemia stem cells in murine myeloproliferative disorder with liver lesion." 38th Annual Scientific Meeting of ISEH International Society for Hematology and Stem Cells, Athens, Greece, September 9-12,2009.
"Leukemia stem cells (LSCs) invading liver in the murine MPD-like myeloid leukemia with liver lesion: Molecular characteristics." I5th Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 12-15,2009.
"The dynamics of the formation of extranodal leukemia metastasis in the liver leading to acute liver failure in mice." Congress of International Society for Cellular Oncology, Dresden, Germany, March 17-19,2010.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и двух приложений. Материалы диссертации изложены на 180 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок, 20 таблиц и список литературы из 352 источников.
Личный вклад автора
Автором лично выполнены эксперименты по исследованию экспрессии генов в КМ и печени больных животных, эксперименты по исследованию динамики заселения печени опухолевыми клетками, включавшие в себя сортировку клеток и изучение экспрессии генов. Проведена обработка данных, статистический анализ, обобщение результатов исследований.
