Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Острые лейкозы у детей первого года жизни (обзор литературы) 16
1.1. Злокачественные новообразования у детей первого года жизни 16
1.2. Пренатальное происхождение острых лейкозов у детей первого года жизни 17
1.3. Эпидемиология острых лейкозов у детей первого года жизни 20
1.4. Острый лимфобластный лейкоз у детей первого года жизни 21
1.4.1. Клинико-лабораторные показатели 21
1.4.2. Цитогенетические исследования 27
1.4.3. Иммунофенотипическая характеристика 29
1.4.4. Результаты терапии 32
1.5. Острый миелоидный лейкоз у детей первого года жизни 35
1.5.1. Клинико-лабораторные показатели 35
1.5.2. Цитогенетические исследования 38
1.5.3. Иммунофенотипическая характеристика 44
1.5.4. Результаты терапии 45
1.6. Структура и функции гена MLL 46
1.7. Перестройки гена MLL 53
1.7.1. Механизм действия химерных генов с участием MLL 53
1.7.2. Спектр перестроек 11q23/MLL 55
1.7.3. Прогностическое значение перестроек 11q23/MLL 75
1.7.4. Методы выявления перестроек 11q23/MLL 76
1.8. Прогностическое значение ответа опухолевых клеток на интенсивную химиотерапию. Определение минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни 81
Глава 2. Материалы и методы 93
2.1. Характеристика пациентов 93
2.2. Методы обследования пациентов 97
2.2.1. Им мунофенотипирование 97
2.2.2. Цитогенетическое исследование 99
2.2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ 100
2.2.4. Обратно-транскриптазная ПЦР 102
2.2.5. Секвенирование 106
2.2.6. Длинная инвертированная ПЦР 107
2.2.7. Определение минимальной остаточной болезни в кДНК методом ПЦР в режиме реального времени 107
2.2.8. Определение минимальной остаточной болезни путем выявления химерных генов с участием MLL в геномной ДНК методом ПЦР в режиме реального времени 109
2.3. Статистическая обработка полученных данных 120
Глава 3. Цитогенетические и молекулярно генетические характеристики острых лейкозов у детей первого года жизни 121
3.1. Цитогенетическая характеристика острого лимфобластного лейкоза 121
3.2. Перестройки 11q23/MLL при остром лимфобластном лейкозе 126
3.3. Цитогенетическая характеристика острого миелоидного лейкоза 135
3.4 Выявление транслокации t(7;12)(q36;p12) 141
3.5. Перестройки 11q23/MLL при остром миелоидном лейкозе 147
3.6. Цитогенетическая характеристика других вариантов острого лейкоза 158
3.7. Перестройки 11q23/MLL при других вариантах острого лейкоза 158
3.8. Использование метода флуоресцентной гибридизации in situ для выявления перестроек гена MLL 159
3.9. Структура химерных генов с участием MLL и ее взаимосвязь с клинико-лабораторными характеристиками острых лейкозов 172
Глава 4. Диагностика редких перестроек 11q23/mll при острых лейкозах у детей первого года жизни 184
4.1. Транслокация t(11;19)(q23;p13) / MLL-MYO1F 184
4.2. Транслокации t(2;11)(p21;q23) и t(X;11)(q24;q23) / MLL-SEPT6 188
4.3. Транслокация t(11;17)(q23;q25) / MLL-SEPT9 190
4.4. Частичный тандемный повтор в гене MLL (MLL-PTD) 190
4.5. Транслокация t(2;11)(q12;q23) / MLL-AFF3 192
4.6. Транслокация t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15 195
4.7. Транслокация t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 197
4.8. Транслокация t(1;11)(q21;q23) / MLL-MLLT11 198
Глава 5. Иммунофенотипическая характеристика острых лейкозов у детей первого года жизни 201
5.1. Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного лейкоза 201
5.2. Иммунофенотипическая характеристика острого миелоидного лейкоза 204
5.3. Возможность использования экспрессии NG2 в качестве маркера для мониторинга минимальной остаточной болезни 205
Глава 6. Диагностика минимальной остаточной болезни 207
6.1. Определение минимальной остаточной болезни методом ПЦР в режиме реального времени у пациентов с наличием химерных гена и транскрипта MLL-EPS15 207
6.2. Сравнительный анализ результатов диагностики минимальной остаточной болезни методами проточной цитометрии и обратно-транскриптазной ПЦР у детей первого года жизни c острым лимфобластным лейкозом и перестройками 11q23/MLL 215
6.3. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в костном мозге, выявленной методами обратно-транскриптазной ПЦР и ПЦР в режиме реального времени, при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих лечение по протоколу MLL-Baby 217
6.4. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в периферической крови, выявленной методом ПЦР в режиме реального времени, при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих лечение по протоколу MLL-Baby 229
Заключение 237
Выводы 242
Практические рекомендации 244
Перспективы дальнейшей разработки темы 245
Список сокращений и условных обозначений 246
Список литературы 249
- Клинико-лабораторные показатели
- мунофенотипирование
- Цитогенетическая характеристика острого миелоидного лейкоза
- Частичный тандемный повтор в гене MLL (MLL-PTD)
Клинико-лабораторные показатели
Острые лейкозы (ОЛ) — группа злокачественных заболеваний кроветворной ткани, характеризующихся поражением костного мозга незрелыми кроветворными (бластными) клетками с вытеснением ими нормальных элементов и инфильтрацией различных органов и тканей [11]. В ряде случаев ОЛ у детей первого года жизни могут развиваться уже in utero [241,349]. Наиболее типичными ультразвуковыми признаками врожденного лейкоза являются обнаруживаемые во время беременности водянка, многоводие и/или гепатоспленомегалия плода [241], несколько реже применяются такие показатели как повышение индекса пульсации в пупочной артерии с сопутствующим снижением индекса пульсации средней мозговой артерии, локальные выпоты в полость плевры, перикард, брюшинную полость [349]. В то же время необходимо отметить, что сходные ультразвуковые признаки (водянка плода неимунной природы и гепатоспленомегалия) могут являться признаками внутриутробной инфекции [395]. Наиболее ранней датой, для которой имеется морфологическое подтверждение диагноза ОЛ, является 30 неделя гестации [349].
H.Isaacs приводит описание 145 случаев перинатально диагностированных ОЛ, которые были выявлены либо внутриутробно, либо в неонатальном периоде [241]. Им было показано, что более половины случаев (81, 56%) приходилось на ОМЛ, а в 9 случаях (6%) был выявлен острый бифенотипический лейкоз. Соотношение мальчиков и девочек в описываемой группе составляло 1:1. Характерными клиническими признаками данной группы пациентов являлись гепатоспленомегалия, частое поражение центральной нервной системы (нейролейкоз), лейкемиды, высокий инициальный лейкоцитоз. 58% пациентов с ОМЛ имели острый миеломонобластный и острый монобластный лейкозы (М4 и М5 варианты по FAB классификации), а 18% — острый мегакариобластный лейкоз (ОМЛ М7). Частота мертворождений у пациентов с ОЛ без синдрома Дауна составила 3% (5 из 145 случаев), что несколько ниже, чем у 69 пациентов с синдромом Дауна (включая транзиторный миелопролиферативный синдром), где частота мертворождений была 7% (5 из 69 случаев).
Еще одним доказательством пренатального происхождения ОЛ является сходство ОЛ, возникших у монозиготных близнецов в течение первого года жизни. Это подтверждается наличием одинаковыми клональными перестройками в бластных клетках, выявленными при стандартном цитогенетическом исследовании, а также аналогичными молекулярно-генетическими характеристиками химерных генов: идентичные точки разрыва в ДНК химерных генов, идентичные индивидуальные перестройки генов тяжелых цепей иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов (Ig и TCR) [227,256]. Считается, что возможной причиной возникновения идентичных ОЛ у монозиготных близнецов является наличие сосудистых анастомозов внутри монохорионической плаценты [412], благодаря чему опухоль, возникнув во внутриутробном периоде у одного плода, может диссеменировать во второй [87,468]. Однако описан также случай возникновения ОЛ и у дихорионических близнецов на первом году жизни, но, следует подчеркнуть, что в этом случае, при наличии идентичной транслокации t(11;19)(q23;p13.3) с вовлечением в обоих случаях гена MLL, авторы описали различающиеся перестройки гена IgH [98]. Также в пользу пренатального происхождения ОЛ свидетельствует выявление идентичной нуклеотидной последовательности химерного гена MLL-AF4 в опухолевых бластах пациента и сухих пятнах его же пуповинной крови, взятых за несколько лет до клинического дебюта ОЛ [63].
Характерной чертой ОЛ, который развивается в течение первого года жизни у монозиготных близнецов, является близкая к 100% вероятность развития ОЛ у второго близнеца из пары, в то время как у более старших детей эта величина составляет примерно 10% [256]. В литературе приводятся лишь единичные описания об отсутствии развития ОЛ в паре монозиготных близнецов, у одного из которых поставлен диагноз ОЛ. Возможным объяснением этого феномена авторы посчитали тяжелую вирус-индуцированную нейтропению, которая привела к самопроизвольной редукции клона, несущего химерный ген MLL-MLLT1 [135]. В то же время последний случай является еще одним подтверждением теории двух последовательных генетических событий (двух «ударов»), предложенной А. Кнудсоном для объяснения механизмов возникновения злокачественных новообразований [249].
По данным Автоматизированной информационной системы онкологических заболеваний у детей (Automated Childhood Cancer Information System–ACCIS) заболеваемость ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни, проживающих в европейских странах, за период с 1988 по 1997 составила 30,3 на 1 млн. населения [255]. Несколько более высокие показатели приводит Программа по наблюдению, эпидемиологии и отдаленным результатам онкологической заболеваемости и смертности: заболеваемость ОЛЛ и ОМЛ в США у детей младше 1 года по их данным составила 32,0 на 1 млн. населения [191]. В то же время заболеваемость ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни в Республике Беларусь, очень близка к европейской: 30,0 на 1 млн. населения [10]. Несмотря на имеющиеся цифровые различия в уровнях заболеваемости ОЛЛ и ОМЛ среди девочек и мальчиков первого года жизни между странами и континентами везде показано преобладание среди заболевших девочек [10,191,255]. Так, при ОЛЛ соотношение девочек и мальчиков колебалось от 1,04 в европейских странах [255] до 1,40 в США [191]. При ОМЛ получен несколько меньший разброс данных: соотношение девочек и мальчиков по консолидированным европейским данным 1,13 [255], по американским — 1,26 [191].
К сожалению, аналогичных данных для Российской Федерации найти не удалось, в силу того, что пациенты этой возрастной группы объединяются со старшими детьми, и представляются в категории 0-4 года [5]. Используя данные Всероссийской переписи населения 2010 года, согласно которой число детей первого года жизни составляло 1 641 644 человек [3], и грубые показатели заболеваемости, приводимые европейской системой Автоматизированной информационной системой злокачественных новообразований у детей [255], можно предположить, что ежегодно в РФ должно регистрироваться 27-28 случаев ОЛЛ и 20-21 случай ОМЛ у детей исследуемой возрастной группы.
мунофенотипирование
При проведении цитогенетического исследования применялась техника приготовления «прямых препаратов» или краткосрочное культивирование клеток (24, 48 часов). Дифференциальную окраску хромосом на G-полосы проводили красителем Гимза после предварительной обработки препаратов трипсином. В большинстве случаев анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Анализ хромосом выполняли в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека, принятой на момент выполнения стандартного цитогенетического исследования [242-245]. В ходе данной работы все кариотипы были повторно оценены с учетом рекомендаций ISCN 2013 [245]. Дополнительными хромосомными аберрациями (ДХА) считали все клональные аномалии, сочетавшиеся с перестройками 11q23/MLL [362]. Кариотип считали комплексным, если у пациентов с ОМЛ каждая клетка лейкозного клона содержала не менее трех хромосомных изменений, включая перестройки района 11q23 [436,467].
В настоящее время в употреблении одновременно находятся как традиционные названия генов, так и их современные аналоги, рекомендованные комитетом по номенклатуре генов HUGO (HGNC) [209]. В дальнейшем в ходе работы будет использована только современная номенклатура. В таблице 8 приведены названия наиболее распространенных химерных генов и химерных транскриптов, а также их соответствие различным транслокациям.
Для выявления перестроек гена MLL методом FISH был использован двухцветный ДНК-зонд Vysis LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular, США), который состоит из двух частей, меченных различными флуоресцентными красителями: 5 -фрагмент окрашен Spectrum Green, 3 -фрагмент — Spectrum Orange с небольшой зоной перекрывания в 7 экзоне MLL (Рисунок 13).
Схема флуоресцентного ДНК-зонда для выявления перестроек гена MLL, использованного в данной работе. 5 -часть зонда окрашена Spectrum Green (прямоугольники черного цвета), 3 -часть—Spectrum Orange (прямоугольники белого цвета) с зоной перекрывания в 7 экзоне MLL (прямоугольники серого цвета); (а)—идеограмма 11 хромосомы; (б)—фрагмент локуса 11q23 с указанием генов, перекрывающихся ДНК-зондом. Цифры на шкале (тысячи пар нуклеотидов) соответствуют координатам генов на хромосоме. Цифрами внутри черного и белого прямоугольников указана протяженность 5 - и 3 -частей ДНК-зонда (тысячи пар нуклеотидов); (в) — Схема гена MLL, включая основной регион разрыва (Mbcr) в гене MLL протяженностью 7699 пар нуклеотидов, расположенный между 7 и 13 экзонами. Цифры соответствуют нумерации экзонов.
В нормальных клетках две части зонда располагаются вместе, что дает 2 желтых совмещенных (сливных) сигнала, которые обозначаются как «2F». В случае стандартной (типичной) перестройки гена MLL выявляются 1 красный, 1 зеленый и 1 желтый совмещенный (сливной) сигналы (1R1G1F). В ряде случаев наряду с перестройкой гена MLL одновременно могут наблюдаться делеции данного гена, располагающиеся дистальнее (3 ) по отношению к зоне перекрытия двух частей зонда, что приводит к исчезновению красного сигнала (1G1F). У 27 пациентов дополнительно проведено исследование с использованием цельнохромосомных зондов для полного окрашивания 1, 2, 4, 10, 11, 15 хромосом — XCP 1 FITC, XCP 2 FITC, XCP 4 FITC, XCP 10 FITC, XCP 11 Texas Red, XCP 15 FITC, соответственно (все Metasystems, Германия). Все методики выполнялись согласно инструкциям производителей. Для выявления транслокации t(7;12)(q36;p12) методом FISH по нашему заказу компанией Metasystems (Германия) был разработан трехцветный флуоресцентный зонд, состоящий из (1) зонда на точку разрыва в хромосомном районе 12p13 центромерная часть которого, меченная оранжевым флуоресцентным красителем, расположена проксимальнее гена ETV6, а теломерная, меченная зеленым флуоресцентным красителем, — дистальнее гена ETV6 с небольшой зоной перекрытия самого гена; (2) двух последовательностей, меченных голубым флуоресцентным красителем (Aqua), фланкирующих нуклеотидную последовательность гена HLXB9 в хромосомном районе 7q36 (Рисунок 14).
Для проведения анализа методом ОТ-ПЦР срок доставки материала в лабораторию варьировал от 0 до 48 часов. ОТ-ПЦР проводилась в двух модификациях. В 147 случаях лейкоциты и бластные клетки выделяли из костного мозга путем лизиса в 0,84% растворе хлорида аммония, после чего проводили подсчет ядросодержащих клеток на гематологическом анализаторе KX-21 (Sysmex, Япония). Рисунок 14. Схема трехцветного флуоресцентного зонда, использованного для выявления t(7;12)(q36;p12).
В работу брали 5ґ106 ядерных клеток. Для выделения РНК использовали TRIreagent (Molecular Research Center, США) в количестве 1 мл. Полученную РНК обрабатывали ДНК-азой I (Fermentas, Латвия) согласно инструкции производителя. 1 мкг РНК переводили в комплементарную ДНК (кДНК) в ходе реакции обратной транскрипции, которая проходила при 37С в течение 60 минут с использованием MML-V обратной транскриптазы (Promega, Германия) и смеси случайных нонамеров (Синтол, Россия). В ПЦР брали кДНК в количестве эквивалентном 100 нг РНК. Для проведения ПЦР использовали 1 ед. ДиаТак-полимеразы (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) и амплификатор «GeneAmp PCR system 9700 Gold» (Applied Biosystems, США). Все исследования проводили методом двухстадийной, т.н. гнездной ПЦР, при этом после проведения амплификации (ПЦР-1) 1 мкл ПЦР-продукта переносили в смесь реактивов для второго раунда ПЦР (ПЦР-2), которая отличалась лишь комбинацией праймеров, и повторно проводили амплификацию. Для химерных транскриптов MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MYO1F использовался т.н. полугнездный вариант проведения ОТ-ПЦР, при котором в ПЦР-1 и ПЦР-2 вносили один и тот же праймер, комплементарный гену-партнеру MLL. Нуклеотидная последовательность праймеров для выявления MLL-AF4 взята из работы A. Borkhardt et al. [303], для MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11– из работы N. Pallisgaard et al. [315]. Из-за вариабельности зон слияния в химерном транскрипте MLL-MLLT10 для его выявления методом ОТ-ПЦР использовали мультиплексный вариант. Комбинации всех использовавшихся праймеров и зондов приведены в таблице 9. Детекцию проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия с последующим фотодокументированием при помощи системы визуализации GelDoc XR 2000 (Bio-rad, США). Чувствительность ОТ-ПЦР, которую оценивали методом лимитирующих разведений клеточных культур RS4;11, MV4-11 и THP-1, составила 5ґ10-5. При отсутствии выявления наиболее широко распространенных химерных транскриптов (MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLL-EPS15, MLL-MLLT11, MLL-MLLT4) и наличии достаточного количества материала (n=48) дополнительно проводили исследование методом ОТ-ПЦР с использованием набора HemaVision (DNA Diagnostic A/S, Дания) согласно инструкции производителя с целью обнаружения редких химерных транскриптов MLL-ELL, MLL-FOXO4, MLL-MLLT6. Данный анализ выполняли в два этапа, согласно инструкции производителя, c применением TaqF ДНК-полимеразы (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия). На первом этапе из полученной ранее кДНК ставили 8 мультиплексных ПЦР-реакций. При получении положительного результата в одной из пробирок в ходе первого этапа, кДНК повторно вносится в гнездные моноплексные реакции. Результат расценивали как позитивный, если на обоих этапах ПЦР обнаруживалось наличие специфического ПЦР-продукта, совпадающего по размеру с ожидаемым.
Цитогенетическая характеристика острого миелоидного лейкоза
Реципрокные гены, которые участвовали в образовании комплексных транслокаций: DNAH6, DCPA1, MCL1, а также некодирующие последовательности ДНК, расположенные в хромосомных районах 2q21.2 и 2p21.
Мы также оценили расположение точек разрыва в генах-партнерах MLL. За исключением описанных выше случаев транс-сплайсинга, выявлено по 3 случая локализации точек разрыва в генах MLLT1 и EPS15 в пределах 1 интрона. У обоих обследованных пациентов с наличием химерного гена MLL-MLLT1 в гене MLLT11 точка разрыва также располагалась в 1 интроне. В гене MLLT3 у 12 пациентов (по 6 ОЛЛ и ОМЛ) точки разрыва были расположены в 5 интроне и у двух (по 1 ОЛЛ и ОМЛ) — в 4 интроне. В гене AF4 основная зона разрывов включала в себя интроны 3 (19 случаев), 4 (6 случаев, включая 1 с ОМЛ), 5 (2 случая). Также нами выявлено по 1 случаю локализации точки разрыва в интронах 6 и 10. В гене MLLT10 нами было обнаружено три зоны разрывов: 3-й интрон (1 случай), 8-й интрон (3 случая, включая 1 ОНдЛ) и 9-й интрон (1 случай).
Прогностическая оценка локализации точки разрыва в 11 интроне проведена у 31 пациента с ОЛЛ, получавшего терапию по протоколу MLL-Baby. Кумулятивная вероятность развития рецидива у пациентов с точкой разрыва в 11 интроне гена MLL (n=18) оказалось выше (0,85±0,01), чем в тех случаях, в которых точка разрыва лежала между 8 и 11 экзонами, включительно (n=13) (0,57±0,02), однако различия не достигли статистической значимости (p=0,261). Медиана наблюдения составила 30 мес. (диапазон 6-42 мес.).
Исследование методом ДИ-ПЦР является универсальным методом, позволяющим выявлять практически любую перестройку с участием гена MLL, включая и реципрокные гены. Необходимо отметить, что такие редкие химерные гены как MLL-AFF3, MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9 не были обнаружены нами на этапе первичной диагностики с использованием цитогенетики, ОТ-ПЦР и FISH, а впервые были выявлены только после проведения ДИ-ПЦР. Важно также подчеркнуть, что ДИ-ПЦР помогла в двух случаях верифицировать наличие редких вариантов химерного гена MLL-AF4. В первом случае у мальчика в возрасте 2,5 мес. с диагнозом ОЛЛ при отсутствии метафаз методом FISH была выявлена перестройка гена MLL, а проведенное исследование методом ОТ-ПЦР не выявило ни одного химерного транскрипта. При выполнении ДИ-ПЦР было показано, что в этом случае точка разрыва локализовалась в 7-м интроне гена MLL, в то время как использовавшиеся праймеры для гена MLL в ОТ-ПЦР комплементарны 8-му экзону. В рамках крупнейшего на сегодняшний день исследования аналогичная локализация точки разрыва была описана только в 2 из 600 (0,3%) случаев [433]. Во втором случае у пациентки в возрасте 8,1 мес. с диагнозом ОЛЛ и кариотипом лейкозного клона 46,XX,t(4;11)(q21;q23), der(7;10)?t(7;10)(q22;p15), было подозрение на то, что в образование химерного гена вовлечен не только MLL и AF4, но и еще какой-то третий ген, так как при ОТ-ПЦР химерный транскрипт MLL-AF4 не был выявлен. ДИ-ПЦР показала, что механизм образования химерного гена в этом случае — это обычная реципрокная транслокация, но точка разрыва в гене AF4 лежит в 10-м интроне за пределами покрытия использовавшихся праймеров, которые комплементарны 8-му экзону. Такая ситуация описана всего в 7 из 600 случаев (1,2%) с наличием MLL-AF4 [433].
У взрослых пациентов с ОЛЛ локализация точек разрыва в гене MLL при формировании химерного гена MLL-AF4 отличалась от полученной нами. В 40% случаев точка разрыва локализовалась в 9-м интроне MLL, в 34% — 10 интроне и 24% — в 11-м интроне [433], который по нашим данным был самым частым при ОЛЛ у детей первого года жизни. Преобладание точек разрыва в 9-м интроне гена MLL было выявлено и в других работах, исследовавших MLL-позитивный ОЛЛ у взрослых [434]. В то же время распределение точек разрыва в гене AF4 не было связано с возрастом, и было идентичным у детей первого года жизни, детей старше 1 года и взрослых [64]. Для других генов-партнеров MLL подобных исследований в доступной нам литературе не встретилось.
Выявленное нами бимодальное распределение точек разрыва в гене MLL при ОМЛ у детей первого года жизни очень сходно с картиной, описанной у взрослых пациентов с ОМЛ [320].
Ранее на основании данных ДИ-ПЦР были выделены несколько механизмов образования химерных генов, наиболее частым из которых является реципрокная транслокация [320]. Это становится возможным при наличии двух точек разрыва в двухцепочечной ДНК. Делеции и инверсии также происходят при наличии двух точек разрыва в ДНК. Комплексные транслокации с участием трех хромосом возможны только при наличии трех точек разрыва в двухцепочечной ДНК. Также описаны варианты, при которых комплексная транслокация сочетается с делецией; для реализации этого механизма также необходимо наличие трех разрывов в двухцепочечной ДНК. Выделяют инсерции 1 типа, при которой часть 11 хромосомы, включающая в себя ген MLL, встраивается в партнерскую, а также инсерции 2 типа, характеризующаяся тем, что ген-партнер, вместе с хромосомой, на которой он расположен, встраивается в ген MLL. Самым сложным механизмом является комплексная транслокация с участием не менее чем четырех хромосом, которая возможна только при наличии четырех и более (хромотрипсис) точек разрыва в двухцепочечной ДНК [320].
Нами найден первый случай транс-сплайсинга у пациента с химерным геном MLL-MYO1F. Также интересно отметить, что из 12 описанных нами случаев MLL-MLLT1 подобный механизм выявлен в 9. Возможно, что его реальная частота у детей первого года жизни с MLL-MLLT1-позитивным ОЛЛ несколько выше, чем приводится в литературе [406].
В работе M. Emerenciano et al. был проведен анализ исходов терапии пациентов с MLL-позитивными ОЛ в зависимости от локализации точки разрыва. Авторам удалось показать негативное прогностическое значение локализации точки разрыва в 11-м интроне гена MLL при ОЛ у детей возрасте младше 24 мес. по сравнению с пациентами, у которых точка разрыва находилась в 8-м, 9-м, 10-м интронах и 10-м экзоне [422]. Одно из возможных объяснений, которое приводят авторы — различная структура PHD домена гена MLL, что в случае с локализацией точки разрыва в 11-м интроне приводит к повышенной стабильности химерного белка или потере его способности переключаться в направлении репрессии транскрипции [422,433].
Частичный тандемный повтор в гене MLL (MLL-PTD)
Структура химерного гена MLL-AFF3 сходна с описанной ранее [170,252,329]. Реципрокный ген в данном случае образован при слиянии 28-го интрона гена CEP164 c 10-м интроном MLL. Известно, что ген CEP164 (11q23.3) отвечает за синтез центросомного белка 164 кДА. Описано 15 изоформ транскрипта дикого типа CEP164, но только 7 из них кодируют белок [145]. Основной транскрипт кодирует белок с молекулярной массой 164314 Да, состоящий из 1460 аминокислот. Кроме участия в образовании веретена деления центросомный белок играет определенную роль в восстановлении клеток после повреждающего действия ультрафиолетового облучения [177]. В зависимости от фазы клеточного цикла центросомный белок может локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме
Транслокация t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS В исследование было включено 6 пациентов с наличием транслокации t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15. Их инициальные характеристики представлены в таблице 32. Из этого числа исследование методом ОТ-ПЦР проведено 5 пациентам (№№ 1, 3-6 в таблице 32). Пример выявления транслокации t(1;11)(p32;q23) и соответствующего химерного транскрипта MLL-EPS15 приведен на рисунке 31.
Рисунок 31. Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических методов исследования. (а) Частичная кариограмма пациента с наличием t(1;11)(p32;q23); (б) Результаты скрининговой (слева) и подтверждающей (справа) ОТ-ПЦР с использованием набора HemaVision у пациента с наличием химерного транскрипта MLL-EPS15. K- — негативный контроль. Также на каждой электрофореграмме присутствует ДНК-маркер размерности ПЦР-продуктов (М); (в) Результат исследования методом FISH в интерфазных ядрах, характерный для перестройки гена MLL; (г) Данные FISH c применением цельнохромосомных зондов к 1 и 11 хромосомам, свидетельствующие о наличии транслокации t(1;11).
Выявлено два типа химерных транскриптов (Рисунок 15). У пациентов №1 и №2 в таблице 32 инициально было проведено только цитогенетическое исследование, выявившее наличие транслокации t(1;11). У пациента №1 молекулярный мониторинг был начат через 5,5 мес от начала терапии, и с этого времени, пациент находился в молекулярной ремиссии: химерный транскрипт ни разу не был обнаружен. Из-за отсутствия доступного материала у пациента №2 методом исследование методом ОТ-ПЦР не проведено. Наиболее частым механизмом образования химерного гена являлась реципрокная транслокация, в одном случае (у пациента № 6) — транс-сплайсинг.
Ранее было показано, что транслокация t(1;11)(p32;q23) чаще выявляется у лиц женского пола [212,420]. Также необходимо отметить, что для пациентов с наличием t(1;11)(p32;q23) характерны общие черты всех MLL-позитивных ОЛ: доминирование CD10-негативного иммунофенотипа, частый инициальный гиперлейкоцитоз [69,344,378,472]. Целенаправленное исследование структуры химерного гена MLL-EPS15 было выполнено лишь однажды: C. Meyer et al. приводят собственные данные о 13 пациентах, включая 12 случаев ОЛ у детей [320]. Точка разрыва в гене EPS15 у обследованных нами пациентов локализовалась либо в интроне 1, на долю которого приходится около 30% всех случаев формирования химерного гена MLL-EPS15, либо в некодирующей последовательности ДНК в хромосомном районе 1p32 в непосредственной близости от 5 -конца гена MLL [320]. В последнем случае механизмом образования химерных генов являлся транс-сплайсинг [406]. В гене MLL точки разрыва у обследованных нами пациентов располагаются в 10-м и 11-м интронах, последний является наиболее частой локализацией при ОЛЛ у детей первого года жизни [289, 433].
Транслокация t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT Транслокация t(10;11)(p12;q23) и/или химерный ген MLL-MLLT10 были выявлены у 18 пациентов, в том числе, в 5 случаях ОЛЛ, 12 случаях ОМЛ и 1 случае ОНдЛ. Их этого числа цитогенетическое исследование было проведено 11 пациентам (1 случай ОЛЛ и 10 случаев ОМЛ). При этом у трех пациентов (все ОМЛ) были найдены только клетки с нормальным кариотипом. В то же время исследование методом ОТ-ПЦР позволило выявить химерный транскрипт MLL-MLLT10.
В силу высокой вариабельности точек зон слияния как в гене MLL, так и MLLT10 всем пациентам на первом этапе проводился мультиплексный вариант ОТ-ПЦР с использованием всех праймеров, указанных в таблице 9. При получении позитивного результата на втором этапе ставилось 6 моноплексных реакций. Данная стратегия позволила обнаружить химерный транскрипт MLL-MLLT10 в 16 случаях. Методом секвенирования было выявлено 4 типа химерных транскриптов (Рисунок 19). ДИ-ПЦР подтвердила, что механизмом образования данного химерного гена во всех случаях являлась инсерция.
Несмотря на то, что транслокация t(10;11)(p12;q23) выявляется как при ОЛЛ, так и при ОМЛ, зоны разрыва при различных типах ОЛ в ДНК отличаются: при ОЛЛ преобладает 11-й интрон, в то время как для ОМЛ более характерна локализация в 9-м интроне [433].
Транслокация t(1;11)(q21;q23) / MLL-MLLT Транслокация t(1;11)(q21;q23) с образованием химерного гена MLL-MLLT11 была выявлена нами у двух пациентов с диагнозом ОМЛ, данные о которых приведены в таблице 33 Использование метода ОТ-ПЦР в обоих случаях позволило выявить идентичный тип химерного транскрипта e9e2, что нашло свое подтверждение и при проведении ДИ-ПЦР. Данный химерный ген образовался вследствие реципрокной транслокации. Проведенный мониторинг МОБ показал, что у обоих пациентов длительное время сохранялся химерный транскрипт MLL-MLLT11, а молекулярная ремиссия достигнутая пациентом №2 была кратковременной ( 5 мес.) (Рисунок 32), что в дальнейшем привело к развитию гематологического рецидива.