Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время энтерококки занимают одну из лидирующих позиций среди возбудителей госпитальных инфекций. Особую опасность для пациентов с иммуносупрессией представляют Enterococcus faecium устойчивые к ванкомицину (Сидоренко СВ., 2002). Частота инфекций, вызванных этими микроорганизмами, возрастает в последние годы. Описано шесть фенотипов устойчивости к ванкомицину (VanA, VanB, VanC, VanD, VanE и VanG). Наибольшее клиническое значение отводится фенотипу VanA, который определяется преимущественно у штаммов Enterococcus faecium (Coque Т.М. et al., 1995). Для этого фенотипа характерен высокий уровень резистентности к ванкомицину. Определено, что гены, кодирующие устойчивость у энтерококков с фенотипом VanA, входят в состав транспозона Тг\1546. Этот транспозон может перемещаться из хромосомной ДНК бактерий в плазмиды, которые передаются от устойчивых к ванкомицину энтерококков к чувствительным штаммам (Weaver К.Е. et al., 2002). Благодаря такому обмену происходит быстрое распространение в стационаре резистентных к ванкомицину штаммов энтерококков. Полагают, что мутации в составе транспозона Тп 1546 влияют на уровень резистентности энтерококков к ванкомицину, а также на способность Тп 1546 перемещаться из хромосомной ДНК в плазмидную (Park I.J. et al., 2007). До сих пор значение структурных изменений в эволюции генов резистентности энтерококков к ванкомицину окончательно не выяснено.
При распространении энтерококков в стационаре немалое значение имеют и факторы вирулентности, которые могут индуцировать инфекционный процесс у человека. Факторы вирулентности изучены недостаточно. В то же время известно, что некоторые гены, кодирующие факторы вирулентности, объединены в кластер - островок патогенности, который может передаваться от более вирулентных менее вирулентным штаммам энтерококков (Leavis Н. et al., 2004).
В последние годы выявлено, что большинство изолятов Enterococcus faecium, вызывающих госпитальные вспышки инфекций, относятся к клональному комплексу штаммов Enterococcus faecium 17 (clonal complex 17 - CC17). Существование клонального комплекса СС17 было доказано при мультилокусном секвенировании (Multilocus Sequence Typing - MLST) фрагментов генов клеточного метаболизма и транспорта ванкомицин-устойчивых энтерококков. Штаммы Enterococcus faecium, входящие в клональный комплекс СС17, характеризуются особой структурой этих генов и более высокой вирулентностью (Hendrickx A.A. et al., 2007). В связи с этим исследование молекулярной изменчивости транспозонов Тп 1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, выявление генов вирулентности, а также определение принадлежности энтерококков к клональному комплексу госпитальных штаммов СС17 является актуальным и необходимым в изучении ванкомицин-устойчивых штаммов энтерококков, выделенных от больных в отделениях гематологии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярных особенностей ванкомицин-устоичивых штаммов Enterococcus faecium, выделенных от гематологических больных. В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:
Провести генотипирование госпитальных штаммов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium, выделенных от больных опухолями системы крови, и определить клональный состав популяции этих микроорганизмов.
Исследовать молекулярную структуру транспозонов Тп 1546, кодирующих резистентность энтерококков к ванкомицину, и их эволюцию в процессе циркуляции штаммов в стационаре.
Изучить гены вирулентности у ванкомицин-устоичивых штаммов Enterococcus faecium и провести сравнение с ванкомицин-чувствительными Enterococcus faecium.
Выявить принадлежность эпидемических изолятов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium к госпитальной популяции штаммов клональному комплексу СС17.
Научная новизна исследования. Впервые в России проведено исследование по изучению молекулярных особенностей госпитальных штаммов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium. При исследовании энтерококков методом пульс-электрофореза выявлено преобладание в стационаре двух эпидемических клонов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium, содержащих 74% штаммов.
При изучении молекулярной структуры транспозонов Тг\1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, зарегистрировано преобладание транспозонов консервативной структуры (тип 1), содержащих полный набор генов резистентности к ванкомицину. Определены также транспозоны Тп 1546, содержащие структурные изменения (тип 2, тип 3, тип 4), которые возникли при циркуляции штаммов в стационаре. Выявлены такие мутации, как делеция фрагмента гена orfl, инсерция в области orfl, а также инсерция IS 1251 между генами vanS и vanH транспозона Тп 1546. Установлено, что транспозоны одного типа распространяются между генетически неродственными штаммами Enterococcus faecium.
Исследование генов вирулентности доказало, что у ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium по сравнению с чувствительными к ванкомицину штаммами достоверно чаще преобладают гены вирулентности esp (92% против 6%) и gelE (67% против 22%). Частота выявления гена hyl, напротив, значимо ниже для устойчивых штаммов по сравнению с чувствительными к ванкомицину изолятами (27% против 66%). Показано, что наличие гена вирулентности esp является характерным для эпидемических штаммов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium и обеспечивает эволюционные преимущества микроорганизмам при распространении в стационаре.
Мультилокусное секвенирование эпидемических изолятов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium доказало, что в России циркулируют изоляты, которые относятся к популяции штаммов Enterococcus faecium, вызывающих госпитальные вспышки
энтерококковых инфекций в разных странах мира - клональному комплексу СС17. Впервые в международный банк данных по эпидемиологии и эволюции энтерококков (MLST enterococci) включены результаты исследований структуры генов резистентности к ванкомицину, генов вирулентности, а также данные мультилокусного секвенирования эпидемических штаммов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium из России.
Научно-практическая ценность работы. Определено, что эволюционное превосходство при распространении от пациента к пациенту имеют изоляты ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium, относящиеся к популяции эпидемических штаммов клональному комплексу СС17, а также обладающие генами вирулентности esp. В этой связи необходимо изолировать больных, которые являются носителями ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium. Принадлежность этих микроорганизмов к эпидемическим штаммам достоверно определяется на основании мультилокусного секвенирования; косвенной характеристикой является присутствие генов вирулентности esp, а также консервативной структуры транспозонов Тг\1546.
Положения, выносимые на защиту.
Преобладает клональный механизм распространения госпитальных штаммов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium в гематологии.
Большинство госпитальных штаммов ванкомицин-устоичивых Enterococcus faecium имеет транспозоны Тг\1546 консервативной структуры без каких-либо мутаций. В процессе циркуляции штаммов в стационаре выявлены структурные изменения транспозонов Тп1546.
Основным геном вирулентности у штаммов Enterococcus faecium устойчивых к ванкомицину является ген esp, чувствительных к ванкомицину - ген hyl.
Ванкомицин-устойчивые Enterococcus faecium, выделенные от больных опухолями системы крови, принадлежат к клональному комплексу штаммов СС17, вызывающих вспышки госпитальных инфекций в разных странах мира.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи и 9 тезисов (2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК).
Апробация диссертации. Основные положения работы доложены на 16 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Ницца, 2006), 17 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Мюнхен, 2007), Международной гематологической школе "Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования" (Москва, 2008), 18 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона, 2008), на 48 Межнаучной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Вашингтон, 2008), Всероссийском декаднике по гематологии (Москва, 2009), 19 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 124 зарубежных литературных источника.
