Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Острые миелоидные лейкозы и диагностика МОБ. Клиническое значение МОБ 11
1.1. Методы диагностики минимальной остаточной болезни 22
1.2. Молекулярные методы детекции МОБ. Основные маркеры МОБ 23
1.3. Многоцветная проточная цитофлюориометрия 27
1.4. Количественный результат МОБ. Чувствительность метода 30
1.5. Подходы для определения МОБ 31
1.6. Лейкемическая стволовая клетка 36
1.7. ЛАИФ и иммунофенотипический «сдвиг» 38
1.8. Выбор материала для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитофлюориметрии больных ОМЛ 39
1.9. Корреляция основных методов определения МОБ 40
Глава 2. Материалы и методы. Демографическая характеристика больных и критерии включения 43
2.1. ВОЗ-классификация пациентов, включенных в исследование 44
2.2. Распределение больных по группам риска. Клинико-лабораторная характеристика больных 45
2.3. Мониторинг МОБ 46
2.4. Методы исследования. Принцип работы проточного цитометра 48
2.5. Временной регламент, количество событий и точки контроля 52
2.6. Описание метода исследования МОБ 53
2.7. Определение основных понятий, используемых в диссертации 65
2.8. Статистическая обработка данных 66
Глава 3. Результаты собственных исследований 69
3.1. Клинико-лабораторная характеристика больных в общей группе 69
3.2. Программы химиотерапии 70
3.3. Определение дебютного ЛАИФ у больных ОМЛ 71
3.4. Результаты лечения у всех больных ОМЛ 76
3.5. Оценка полноты достижения морфологической ремиссии 81
3.6. Оценка влияния различных АГ и их сочетаний на долгосрочные результаты терапии больных ОМЛ 82
3.7. Примеры выявления МОБ в ходе терапии 86
3.8. Детекция и оценка МОБ после первого курса индукции 90
3.9. Сравнение двух курсов консолидации с различной интенсивностью 98
3.10. Детекция МОБ после 2 курса и ее влияние на долгосрочный прогноз 102
3.11. Оптимальная точка определения МОБ у больных ОМЛ 103
3.12. Влияние МОБ-статуса после 1 и 2 курса химиотерапии на долгосрочные результаты больных ОМЛ 106
3.13. Корреляция МОБ с другими факторами риска. 107
Мультивариантный анализ 107
3.14. Клинические примеры пациентов со сменой аберрантного иммунофенотипа (ЛАИФ) при констатации рефрактерного течения ОМЛ и в момент рецидива заболевания 110
Обсуждение 119
Заключение 125
Выводы 126
Список используемых сокращений 129
Список литературы 132
Приложения 155
- Молекулярные методы детекции МОБ. Основные маркеры МОБ
- Методы исследования. Принцип работы проточного цитометра
- Детекция и оценка МОБ после первого курса индукции
- Клинические примеры пациентов со сменой аберрантного иммунофенотипа (ЛАИФ) при констатации рефрактерного течения ОМЛ и в момент рецидива заболевания
Молекулярные методы детекции МОБ. Основные маркеры МОБ
В настоящее время высокочувствительные методы на основе определения ДНК и РНК могут идентифицировать МОБ с высокой чувствительностью – одна опухолевая клетка на миллион нормальных клеток (10-6). Опухолевая клетка может быть обнаружена путем определения нуклеотидных последовательностей генов, специфичных для конкретной опухоли. Основным, часто применяющимся молекулярным методом определения МОБ является ПЦР, где в качестве мишени выступает ДНК. Если мишенью служит РНК, то требуется проведение дополнительного этапа - обратной транскрипции, когда на матрице РНК образуется комплементарная ей ДНК (кДНК). В дальнейшем с помощью ПЦР размножают область стыка слитых генов в химерной кДНК, используя праймеры, комплементарные последовательностям, лежащим по разные стороны от места стыка. Молекулярные мишени при ОМЛ подразделяют на следующие группы: химерные транскрипты, мутации в генах, гиперэкспрессия генов. Примеры использования различных молекулярных методов для определения МОБ приведены в приложении 3.
У больных ОМЛ наиболее часто встречаемыми хромосомными реаранжировками являются t(8;21) и inv(16)/t(16;16), которые ведут к появлению химерных генов RUNX1/RUNX1T1 - Runt related Transcription factor 1 (AML1-ETO) и CBF-MYH11 (core-binding factor, beta subunit), соответственно. Частота их обнаружения составляет около 15%, и все они ассоциированы с благоприятным прогнозом [30, 49, 57, 91]. В ходе исследований было показано, что высокие количества химерных транскриптов ассоциированы с низкими показателями безрецидивной выживаемости [76]. Химерные гены с участием гена KMT2A (MLL - myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia) возникают в результате реарранжировок региона 11q23, обнаруживаются в 10% случаев и ассоциированы с неблагоприятным прогнозом [133].
При остром промиелоцитарном лейкозе (ОПЛ) транслокация (15;17) приводит к образованию химерного гена PML-RAR (promyelocytic leukemia), что является характерным признаком ОПЛ и «золотым» стандартом определения МОБ при этом варианте лейкоза [37].
Наиболее известным и изученным белком с мутациями в его гене, который ассоциирован с ОМЛ, является рецепторная тирозинкиназа 3 (FLT3- fms related tyrosine kinase 3) [54]. Мутации этого гена выявляются в 30% случаев ОМЛ [63]. К наиболее часто встречающимся относятся внутренние тандемные дупликации (FLT3-internal tandem duplication (ITD)), которые ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. Мутации в киназном домене FLT3 (FLT3/TKD) встречаются в 6-7% случаев и прогностическая роль этих мутаций не доказана [82, 103].
Мутации в гене нуклеофосмина 1 (mNPM1 – mutant nucleophosmin 1) также относят к прогностически значимым у больных ОМЛ [101]. Нормальный кариотип ОМЛ, отсутствие мутации FLT3-ITD и наличие мутации NPM1 свидетельствуют о благоприятном прогнозе заболевания [1, 86, 110, 126, 132]. В сравнении с мутациями гена FLT3 мутации NPM1-гена стабильны и могут быть использованы для мониторинга МОБ [132]. Мутации гена C/EBP - CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha [118] встречаются у 25% пациентов ОМЛ. Мутация в этом гене ассоциирована с благоприятным прогнозом [51, 85, 140]. Существуют также герминальные (врожденные) мутации этого гена, которые не влияют на результаты терапии и прогноз. По настоящее время исследований по применению C/EBP для мониторинга МОБ описано не было[24].
Альтернативной мишенью для молекулярного мониторинга МОБ является исследование гиперэкспрессии генов, таких как WT1 (Wilms tumor), EVI1( Ecotropic Virus Integration site 1) и PRAME (Melanoma Antigen Preferentially Expressed in tumors). Эти гены экспрессируются в низких количествах и в нормальных гемопоэтических клетках [104]. В случаях, когда на фоне постоянной экспрессии WT1 в периоде ремиссии его экспрессия повышается, можно заподозрить надвигающееся развитие рецидива заболевания [59].
В настоящее время с помощью цифровой капельной ПЦР исследуют многочисленные генетические маркеры при ОМЛ (гиперэкспрессии генов STMN1, KITLG, CDK6, MCM5, ABL1, ANXA3, KRAS, CEBPA, MYC, ANGPT1, SRGN, RPLP0, ENO1, SET, STMN1, CAT) [57, 149]. Появление технологий секвенирования нового поколения (СНП) ускорило открытие новых генетических повреждений у больных ОМЛ и дало возможность идентифицировать полный диапазон геномных изменений: точечные мутации, изменения количества копий и структурные перестройки, включая транслокации, критические перестановки, инверсии и сложные перегруппировки во всем геноме. В случае нормального кариотипа СНП позволило обнаружить несколько новых мутаций в генах: DNMT3A, IDH1, IDH2, TET2, ASXL1 и др. Их прогностическое значение было недавно изучено как отдельно, так и в сочетании с другими известными молекулярными аномалиями [71]. Измерения МОБ методом СНП активно разрабатываются, но пока не применимы для рутинного использования вне клинических исследований [131, 158].
Молекулярные маркеры для мониторинга МОБ при ОМЛ встречаются у 40-60% пациентов [67]. ПЦР-диагностику МОБ нельзя применить для мониторинга лейкозов с числовыми аномалиями кариотипа, а также с некоторыми делециями и транслокациями без расшифрованных молекулярных перестроек. Генетические аномалии – сильный прогностический фактор. Данные ЦГ и мутационного статуса вышеперечисленных генов (NPM1, FLT3, CEBPA) используются в клинической практике для стратификации пациентов на группы риска [47]. Прогностическое значение многих маркеров и данной конкретной аномалии зависит напрямую от наличия/отсутствия другого молекулярного маркера [112], [53], [117], [130]. Яркий пример этому – «благоприятная» аномалия – mNPM1 считается благоприятной только при отсутствии FLT3-ITD или ее низкой аллельной нагрузке, а мутации в ASXL1 и RUNX1 подтверждают неблагоприятный прогноз [113]. Иногда генетический маркер не является прогностическим, но его наличие может обеспечить мишень для новых методов лечения (IDH1, IDH2 и KMT2A) [48]. Недавнее исследование выявило взаимосвязь биаллельных мутаций CEBPA и мутаций в гене рецептора фактора роста CSF3R (сигнализация через путь JAK-STAT), эти мутации в равной степени «отвечают» на ингибиторы JAK [97]. С появлением СНП оказалось, что молекулярные маркеры возможно определить у практически всех больных, однако необходимы исследования для определения из того множества только тех мутаций, которые ассоциированы с лейкозным клоном и связаны с развитием рецидива заболевания [71, 114]. Как видно из таблицы в приложении 4, RUNX1, ASXL1 и TP53 мутации, а также моносомный кариотип находятся в неблагоприятной группе риска как независимые факторы прогноза ОМЛ.
В консенсусе по рекомендациям ELN, опубликованном в 2018 году, установлены некоторые мутации, которые должны быть мониторированы только молекулярным методом: mNPM1, RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11 и PML-RARA [56, 66, 135]. Другие прелейкемические клоны и ассоциированные с ними мутации в генах DNMT3A, ASXL1и TET2 всегда могут присутствовать у пациентов ОМЛ, но также они определяются и у здоровых людей. Для многих других мутаций (RUNX1, GATA2, CEBPA, DDX41, ANKRD26) не получено достоверных данных о том, могут ли они быть надежным фактором прогноза заболевания, так же как и для экспрессии гена WT1. В связи с неустойчивойстью некоторых мутаций (FLT3-ITD, FLT3KD, NRAS, KRAS, IDH1, IDH2, MLL-PTD) и уровне экспрессии EVI1, их также не рекомендуется использовать как самостоятельные маркеры МОБ. Однако в комбинации с другими маркерами, их прогностическая ценность становится статистически значимой [135].
Для оценки МОБ молекулярным методом на фоне ХТ рекомендуется оценивать аномалию в дебюте заболевания, после 2 циклов индукции и на момент окончания лечения в КМ и периферической крови (ПК). Чтобы выделить ПР с МОБ-отрицательным статусом, у пациента должна быть подтверждена морфологическая ПР. МОБ-негативность – это два негативных образца с интервалом в 1 или более месяцев с чувствительностью не менее 0,1% (1 аномальная клетка на 1000). МОБ «-» при наличии бластных клеток в КМ означает потерю молекулярного маркера. Существует несколько определений понятия молекулярной МОБ: некоторые транскрипты могут персистировать на низком уровне у больного длительное время и не влиять на возникновение рецидива – это 100-200 копий/104 копий ABL, а также относительное увеличение копий 1 логарифма между любыми двумя положительными образцами, проанализированными после окончания лечения [89, 136]. Молекулярная прогрессия – это нарастание у пациентов в ПР с низкими значениями персистирующей МОБ количества копий более 1 логарифма между любыми двумя положительными образцами. Молекулярный рецидив - увеличение значений МОБ 1 логарифма между двумя положительными образцами у пациента, у которого ранее МОБ была отрицательной. Рекомендации по исследованию МОБ представлены в приложении 6-8.
Методы исследования. Принцип работы проточного цитометра
Проточный цитофлуориметр имеет 6 детекторов флюоресценции, а стандартная его конфигурация поддерживает регистрацию 6-ти цветной комбинации флюорохромов: FITC, PE, PerCP/PerCP Cy5.5, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 (APC-H7). Суспензия окрашенных клеток по системе трубок проходит к проточной камере и пропускается через лазерные лучи. Когда клетка пересекается с лучами, они рассеиваются. Если на поверхности клетки экспрессирован фактор, к которому при окрашивании было добавлено антитело с флюорохромом, то излучается свет в виде флюоресценции, который соответствует длине волны испускания флюорохрома. После этого световой сигнал проходит через систему линз, оптические фильтры и попадает на ФЭУ. Таким образом определяется поверхностный иммунофенотип. Световое рассеяние, которое измеряется в передне-боковом (FSC) и перпендикулярном направлениях (SSC) характеризует физические параметры клетки (размер, гранулярность).
Антигенный профиль бластных клеток определяли после изолирования этих клеток при помощи «гейта» (электронного окна). Результаты иммунофенотипирования оценивали при помощи программного обеспечения BD FACSDiva Software 6.1.
Панель моноклональных антител и выделение клеток для окрашивания
Методы выделения клеток и их окрашивания МАТ проводили согласно протоколам EuroFlow [77] по использованию МАТ Becton Dickinson (BD, USA). Ниже приведена панель МАТ, используемая нами в работе на этапах мониторинга МОБ.
Окрашенные клетки в дальнейшем анализировали на 6-цветном проточном цитофлюориметре модели BD FACS Canto II с 2 лазерами: лазером Coherent Sapphire, 488 нм, 20мВт и системой детекторов Octagon c 5 фотоэлектронными умножителями (ФЭУ), а также лазером гелий-неоновым JDS Uniphase, 633 нм, 17 мВт, с системой детекторов Trigon c 2 ФЭУ.
Метод выделения ядросодержащих клеток для исследования
1. 1 мл костного мозга переливали в чистую сухую полипропиленовую пробирку, разводили 10 мл лизирующего раствора Pharm Lyse в рабочей концентрации (BD, USA) (0,83% NH4Cl) и оставляли на 10 минут.
2. Центрифугировали пробирки в течение 3 мин 30 секунд при 400 g при температуре +15С.
3. Сливали всю жидкость из пробирки, добавляли 2 мл раствора Cell Wash (BD, USA) и вновь центрифугировали в течение 3 минут 30 секунд (400 g) при температуре +15С.
4. Сливали надосадочную жидкость из пробирки, добавляли фосфатный буфер (500 мкл), перемешивали пробирку на автоматическом встряхивателе (vortex).
5. В каждую из подписанных и пронумерованных цитометрических пробирок (в дебюте – 6, в остальных точках исследования – 4) добавляли необходимое количество отмытых клеток КМ: если клеточный осадок был большим, добавляли 1 мл раствора Cell Wash, затем подсчитывали количество лейкоцитов на гематологическом анализаторе Abacus Junior 300 N (Венгрия) для расчета объема материала, содержащего 1,5 млн клеток. Отобранный для покраски материал доводили до 100 мкл раствором Cell Wash. При необходимости клетки еще раз центрифугировали в тех же условиях и ресуспендировали в необходимом объеме.
Метод окрашивания клеток моноклональными антителами
1. В каждую из пробирок для исследования МОБ с ядросодержащими клетками (в каждой из которых по 100 мкл) вносили в требуемом объеме МАТ (по 6 МАТ в каждую пробирку). окрашивали МАТ 1,5 млн клеток в 100 мкл Cell Wash. Если клеточный осадок был скудным, то материал разделяли поровну между 4-6 пробирками для окрашивания МАТ.
2. После инкубации (15 минут в темноте при комнатной температуре) клетки для определения МОБ отмывали раствором Cell Wash (2 мл), центрифугировали в течение 3 мин 30 секунд при 400 g и температуре +15С и затем сливали надосадочную жидкость.
3. Окрашенные и отмытые клетки ресуспензировали в 100 мкл раствора Cell Wash, перемешивали на автоматическом встряхивателе пробирок и анализировали на проточном цитофлюориметре.
Детекция и оценка МОБ после первого курса индукции
Как было представлено ранее, у больных общей группы ПР была достигнута в 82% случаев, причем после первого курса – у большинства из них (69%). При оценке достижения ПР у больных, включенных в исследование МОБ, были получены схожие данные. ПР у больных в возрасте моложе 60 лет составила 93%: 80% после 1 курса и 13% - после 2 курса.
У больных ОМЛ, вошедших в исследование по мониторингу МОБ, ОВ и БРВ были ассоциированы с временем достижения ПР: при достижении ПР после 1 курса ОВ и БРВ составили 88% и 60% в сравнении с 37% и 25% (p = 0,0001 и р = 0,0114, соответственно) у больных в ПР после 2 курса (рис. 29).
Ниже представлена терапевтическая карта больных, вошедших в исследование по сравнению двух курсов химиотерапии и точки контроля МОБ (рисунок 30).
Для оценки влияния интенсивности второго курса индукции/консолидации на значения МОБ и долгосрочный прогноз больных ОМЛ были сформированы 2 группы больных моложе 60 лет: (1) больные, которым проведен 2 курс «7+3» (n = 25) и (2) – которым выполнен курс «FLARIDA» (n = 17). Характеристика этих больных представлена в таблице 11.
После 1 курса в группе по исследованию МОБ ПР получена у 36 больных, у 6 - не достигнута. Полная ремиссия после 2 курса достигнута еще у 6 больных. Исходя из данных таблицы, обе группы сравнения не отличались значимо по группам риска, а также доле больных в ПР после 2 курсов химиотерапии.
Для определения порогового значения МОБ применялся статистический метод, а для дальнейшего анализа использовался порог 0,01% (соответствующий чувствительности метода проточной цитофлюориметрии). После 1 курса индукции МОБ-негативность выявлена у 21 пациента из 36 в ПР (58%), МОБ-позитивными оказались 15 пациентов из 36 в ПР (42%) – таблица 12.
Как видно из таблицы 12, наиболее благоприятной группой были пациенты, достигшие МОБ-негативности после 1 курса: 1 поздний рецидив заболевания. Девять больных из группы «МОБ+» после 2 курса стали «МОБ-», однако риск развития рецидива у этих больных оставался достаточно высоким (21%).
Значения МОБ были различны и варьировали от 0,028% до 8% у некоторых пациентов (таблица 13).
Необходимо отметить, что вероятность детекции МОБ-негативного статуса при достижении ПР после 1 курса «7+3» была одинакова в разных группах риска по ELN 2017 (p = 0,52), хотя доля больных в ПР после 1 курса в разных группах риска существенно отличалась (р = 0,002), (рис. 19). То есть, доля больных с отсутствием МОБ при достижении ПР после 1 курса индукции не зависит от молекулярно-генетических характеристик больных (рис. 31).
При анализе БРВ после 1 курса химиотерапии получены достоверные различия (р = 0,0016) у больных ОМЛ в зависимости от МОБ-статуса. У тех пациентов, у кого при достижении ПР после первого курса МОБ определялась, БРВ была значимо хуже (23%) в сравнении с больными, которые сразу достигали «МОБ-» (87%) (рис.32). Вероятность развития рецидива также была достоверно выше у пациентов с определяемой МОБ (72% vs 10%, р = 0,0009) – рисунок 33. Наши данные сопоставимы с исследованием Lacombe F. и соавт. от 2017 г., где у 148 пациентов ОМЛ выявляемая МОБ после 1 курса индукции была ассоциирована с худшими долгосрочными результатами трехлетней БРВ и ОВ – 76% vs 17% и 82% vs 42%, соответственно (р 0,0001). При этом пороговым уровнем в исследовании принято значение 0,005%, а для диагностики МОБ оценивали не менее 250 000 событий у каждого пациента [94].
В течение года в 70% случаев с МОБ «+» статусом после 1 курса в этом исследовании был констатирован рецидив заболевания. Из группы МОБ-негативных больных лишь у одной пациентки с отрицательными значениями МОБ на протяжении всего периода лечения (во всех точках контроля) констатирован поздний рецидив ОМЛ. В исследовании F. Lacombe и соавт. ВРР у МОБ-негативных пациентов составила 21% в течение 3 лет наблюдения.
При анализе влияния результата МОБ-статуса больных после 1 курса ХТ на ОВ достоверных отличий получено не было, поскольку многим больным выполнили алло-ТГСКК, и сроки наблюдения крайне малы (рис.34). Таким образом, можно заключить, что МОБ, измеренная после 1 курса индукции химиотерапии является маркером химиочувствительности и помогает выявить больных с высоким риском развития рецидива заболевания.
Клинические примеры пациентов со сменой аберрантного иммунофенотипа (ЛАИФ) при констатации рефрактерного течения ОМЛ и в момент рецидива заболевания
Смена антигенного профиля на бластных клетках больных ОМЛ в период рецидива и констатации рефрактерности – распространенное явление [152]. До 70% пациентов «теряют» или «приобретают» тот или иной маркер, однако полная смена первичного ЛАИФ встречается нечасто (25%). Лишь 9-30% больных в рецидиве ОМЛ сохраняют исходный иммунофенотип. В ходе исследования по изучению МОБ в период рецидива и рефрактерных ОМЛ, мы выявили 3/10 (30%) полного изменения основного дебютного ЛАИФ, у остальных пациентов изменения в ИФТ были минимальны и основной ЛАИФ оставался прежним.
Клинический пример 1.
Больная К.А.В., 41 год, диагноз ОМЛ. Поступила в отделение химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения 09.09.2016, в миелограмме было обнаружено 82% бластных клеток, цитохимически подтвержден М2 вариант. При цитогенетическом исследовании методом FISH выявлено del 7q31 в 95% ядер. Иммунофенотип бластных клеток был: CD34+CD117+CD38+CD11c+CD13+. В дебюте заболевания определен лейкоз-ассоциированный иммунофенотип: CD34+HLA-DR-+CD13+CD33-+CD99+CD117+ (частичное отсутствие HLA-DR и CD33 на клетках CD34+).
Пациентке проведен 1-й курс «7+3» с даунорубицином. После курса в период восстановления показателей гемограммы при морфологическом исследовании определялось 9% бластных клеток, моноцитоидных 11,6%, расширение красного ростка до 51%. Методом FISH в 51% ядер выявлена 7q31.
Констатировано первично-резистентное течение заболевания. При исследовании МОБ определялась полная смена ЛАИФ, который соответствовал клеткам большей степени зрелости, чем бластные клетки в дебюте заболевания: CD34 HLA-DR-CD33-CD117-CD99highCD45highCD65+CD66b+CD15+ (аберрантная популяция составила 25,5%). Пациентке с учетом тяжелых инфекционных осложнений, а также наличия del 7, следующий курс ХТ проведен в объеме Aza Ida-Ara-C. При морфологическом исследовании костного мозга после 2-го курса бластные клетки составили 2%, моноцитоидные 4%. Методом FISH делеция регионов 7q22, 7q31 не выявлены. При стандартном цитогенетическом исследовании хромосомные перестройки не обнаружены. МОБ методом проточной цитометрии не определялась. Ремиссия заболевания констатирована 12.12.2016. В дальнейшем пациентка исключена из исследования по мониторингу МОБ, ей продолжали выполнять курсы химиотерапии Aza-Ida-Ara-C. Суммарно выполнено 13 курсов, сохранялась ремиссия заболевания (морфологическая и цитогенетическая). Перед 13-м курсом ХТ 19.03.2018г. при морфологическом исследовании выявлено от 4 до 7% бластных клеток, при цитогенетическом исследовании хромосомные аберрации не выявлялись. Пациентке продолжалась прежняя схема ХТ, увеличение количества бластных клеток расценивалось как восстановление кроветворения. 03.05.2018г. перед 14 курсом ХТ морфологически выявлено 3,6% бластных клеток, увеличение количества моноцитов (до 10,4%) с омоложенным хроматином ядра. Моносомия 7 и делеция регионов 7q22, 7q31 не выявлены, по результатам проточной цитофлюориметрии выявлено две популяции клеток: 1,2% CD34+HLA-DR+CD33+CD117+CD45+ CD15+CD38+CD11b+CD11c+CD13+, соответствующая бластным клеткам миелоидной направленности; а также популяция 9%: CD33+CD45+ CD15+CD38+CD11b+CD11c+CD13+CD16+MPO+Lysozyme+CD10+.
С диагностической целью выполнено исследование МОБ, при котором обнаружена популяция аномальных клеток, ранее не выявляемых: CD34-HLA-DR-CD33high CD117-CD99+CD13+CD14+CD11b+CD66b+CD38+ - 7,17%, а также еще одна популяция аномальных клеток - 0,975% с экспрессией более ранних маркеров: CD34+HLA-DRlowCD33lowCD117+CD99+CD38+CD13+. Таким образом, у пациентки диагностирован поздний (1,5 года после констатации ПР) иммунофенотипический рецидив заболевания при сохранении ЦГ и морфологической ПР. Пациентке в связи с отсутствием развернутого рецидива заболевания продолжены курсы ХТ по прежней схеме. Ниже графически представлены основные иммунофенотипические аберрации пациентки на различных этапах химиотерапии (рис.48).
Клинический пример 2.
Больная П.Е.В., 32 года, диагноз ОМЛ. Поступила в отделение химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения 03.10.2017. В миелограмме - 74,4% бластных клеток, цитохимически подтвержден миелобластный лейкоз с созреванием (М2). При цитогенетическом исследовании – нормальный кариотип, 46ХХ. У пациентки также выявлена мутация гена NPM1. Иммунофенотипически бластные клетки характеризовались экспрессией: CD45+CD117+CD11c+CD13+CD33+MPO+. В дебюте заболевания определен ЛАИФ: основной клон – CD33+/CD34-/HLA-DRneg/CD117+/CD99high (79%), и минорный – CD45high/CD33high/CD34-/CD66b+/CD11b+ (0,8%). C 05.10.17-11.10.17 проведен унифицированный курс «7+3», а 8.11.17 констатирована ремиссия заболевания. Методом иммунофенотипирования после 1 курса определялось наличие минорного клона в количестве 0,35%. С 08.11.17-12.11.17 пациентке проведен 2 курс ХТ по программе «FLARIDA», осложнившийся длительным периодом цитопении (64 дня). При обследовании 15.01.18г. при морфологическом исследовании выявлено 17,2% бластных клеток. При исследовании костного мозга методом проточной цитофлюориметрии определялась популяция с аномальным иммунофенотипом: CD45+/CD33+/CD34-/66b+/11b+/HLA-DR-40%, соответствующая минорной субпопуляции бластных клеток в дебюте заболевания. При цитогенетическом исследовании хромосомные аберрации не обнаружены, при молекулярном анализе мутации в генах NPM1, CEBPA, FLT3 не обнаружены. Таким образом, у пациентки развился ранний рецидив заболевания со сменой основного ЛАИФ (рис.49). В дальнейшем выполнена программа низкодозной ХТ без эффекта, затем проведена высокодозная ХТ с последующей алло-ТГСКК. Пациентка находится в ремиссии.
Клинический пример 3.
Больной М.В.А., 68 лет, диагноз ОМЛ. Поступил в отделение 12.08.2016г. При морфологическом исследовании выявлено 32% бластных клеток. Цитохимически подтвержден миеломонобластный лейкоз. При иммунофенотипировании выявлено 2 субпопуляции бластных клеток: с иммунофенотипом CD45high/ CD117+-/CD33+/CD34+/HLA-DR+/CD13+/CD7+ -(3,1%), а также CD45+/CD117+/CD33-/CD34-/HLA-DRneg – (26%). При цитогенетическом анализе выявлена трисомия 8 и отсутствие мутаций NPM1, CEBPA, FLT3. С 17.08.16-23.08.16 проведен курс «7+3». В пунктате от 20.09.2016 бластные клетки составляли 9,6%. При цитогенетическом исследовании сохранялась трисомия 8. МОБ методом проточной цитофлуориметрии выявила 0,84% , иммунофенотип бластной популяции определялся как: CD45low/ CD117-/CD33-/CD34+/HLA-DRneg/CD13- , которой не было в дебюте заболевания (рис.50). Пациенту в дальнейшем проведены курсы низкодозной ХТ, констатировано резистентное течение заболевания. Пациент погиб от прогрессии заболевания.