Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 21
1.1 Современные представления о диффузной B-крупноклеточной лимфоме 21
1.1.1 Общие сведения о диффузной В-крупноклеточной лимфоме 21
1.1.2 Ритуксимаб и его место в терапии диффузной В-крупноклеточной лимфомы 26
1.1.3 Факторы прогноза при диффузной В-крупноклеточной лимфоме в
эру ритуксимаба 29
1.1.3.1 Клинические прогностические факторы 29
1.1.3.2 Лабораторно-инструментальные факторы прогноза 31
1.1.3.3 Биологические факторы прогноза 33
1.2 Современные представления о роли гена ТР53 в лимфоиднойткани... 36
1.2.1 Генетическая нестабильность, как часть нормального развития В-клеток 36
1.2.2 Структура гена ТР53 38
1.2.3 Структура и функции белка р53 в В-лимфоцитах 39
1.2.4 Значение нарушения функции ТР53 в лимфомогенезе 42
1.2.5 Возможные механизмы формирования дефицита функции гена ТР53 при неходжкинских лимфомах 44
1.2.6 Дисфункция гена ТР53, вызванная нарушениями на уровне ДНК 47
1.2.6.1 Мутантный статус гена ТР53 при диффузной В-крупноклеточной лимфоме 47
1.2.6.1.1 Последствия мутаций в кодирующей последовательности гена ТР53 47
1.2.6.1.2 Частота и значение мутаций в гене ТР53 при диффузной В-крупноклеточной лимфоме 49
1.2.6.1.3 Значение мутаций в интронных и нетранслируемых последовательностей гена ТР53 52
1.2.6.1.4 Методологические аспекты выявления мутаций в гене ТР53 54
1.2.6.2 Аллельный дисбаланс в гене ТР53 56
1.2.6.2.1 Значение потери гетерозиготности в гене ТР53 при неходжкинских лимфомах 56
1.2.6.2.2 Микросателлитная нестабильность и потеря гетерозиготности в гене ТР53 при неходжкинских лимфомах 60
1.2.6.2.3 Методологические аспекты анализа микросателлитных маркеров для выявления потери гетерозиготности в гене ТР53 66
1.2.6.3 Метилирование промотора гена ТР53 67
1.2.6.3.1 Значение метилирования промотора гена ТР53 при неходжкинских лимфомах 67
1.2.6.3.2 Методологические аспекты анализа статуса метилирования гена ТР53 69
1.2.6.4 Общая характеристика полиморфной структуры гена ТР53 70
1.2.6.4.1 Краткая характеристика rs1042522 гена ТР53 74
1.2.6.4.2 Предиктивное и прогностическое значение rs1042522 гена ТР53 при опухолях 77
1.2.6.4.3 Функционально-значимые интронные полиморфизмы гена ТР53 79
1.2.6.4.3.1 Значение rs17878362 гена ТР53 при новообразованиях человека 80
1.2.6.4.3.2 Значение rs1625895 гена ТР53 при злокачественных новообразованиях 82
1.2.6.4.4 Понятие о гаплотипной структуре гена ТР53 83
1.2.6.4.5 Значение гаплотипной структуры гена ТР53 в онкогенезе 86
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 90
2.1 Общая характеристика группы обследованных больных 90
2.2 Методы клинического, лабораторного и инструментального обследования 97
2.3 Специальные методы исследования 101
2.3.1 Выделение ДНК из лейкоцитов цельной венозной крови больных лимфомами 101
2.3.2 Выделение ДНК из парафинизированных блоков опухолевой ткани больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 101
2.3.3 Выявление мутаций в последовательности гена ТР53 методом прямого секвенирования по Сенгеру 103
2.3.4 Генотипирование rs78378222 в 3/-нетранслируемой последовательности гена TP53 104
2.3.5 Оценка потери гетерозиготности в гене ТР53 по микросателлитному локусу D17S796 105
2.3.6 Оценка метилирования промотора гена ТР53 методом метилспецифической полимеразной цепной реакции 107
2.3.6.1 Бисульфитная конверсия ДНК 107
2.3.6.2 Метил-специфическая полимеразная цепная реакция
2.3.7 Анализ функционально-значимых полиморфизмов гена ТР53 108
2.3.8 Анализ гаплотипов гена ТР53 112
2.4 Статистические методы исследования 113
ГЛАВА 3 Результаты собственного исследования. значение маркеров rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена тр53 при диффузной в-крупноклеточной лимфоме 116
3.1 Частота rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53 в обследованной группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 117
3.2 Структура неравновесия по сцеплению между rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53 118
3.3 Значение маркеров rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53 в предрасположенности к развитию диффузной В-крупноклеточной лимфомы 120
3.4 Маркеры гена ТР53 и особенности клинического течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы 124
3.5 Ассоциация маркеров гена ТР53 с эффективностью терапии первой линии больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 129
3.5.1 Непосредственные результаты терапии пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой группы исследования 129
3.5.2 Отдаленные результаты терапии в группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 132
3.5.3 Прогностическое значение Международного прогностического индекса в исследуемой группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 138
3.5.4 Эффективность терапии первой линии в группах больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой в зависимости от rs17878362,
rs1042522 и rs1625895 гена ТР53 146
3.5.5 Предикторы скорости ответа на терапию в группе исследования 148
3.5.6 Отдаленные результаты терапии в группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой в зависимости от rs17878362, rs1042522 и rs1625895 гена ТР53 154
3.5.7 Предикторы общей выживаемости в исследованной группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 162
3.5.8 Предикторы бессобытийной выживаемости и безрецидивной выживаемости в исследованной группе больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 169
3.5.9 Гаплотипы гена ТР53 и эффективность терапии больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой группы исследования 178
ГЛАВА 4 Анализ мутаций в гене тр53 в опухолевой ткани больных диффузной в-крупноклеточной лимфомой 186
4.1 Общая характеристика результатов секвенирования 186
4.2 Характеристика мутаций в кодирующей последовательности гена ТР53 188
4.3 Характеристика интронных мутаций в гене ТР53 200
4.4 Анализ биологической значимости выявленных в гене ТР53 мутаций 202
4.5 Сравнение выявленного спектра мутаций в гене ТР53 со спектром мутаций, представленных в информационных базах данных 206
ГЛАВА 5 Анализ аллельного дисбаланса и метилирования промотора гена тр53 у больных диффузной в-крупноклеточной лимфомой 212
5.1 Изучение статуса метилирования промотора гена ТР53 212
5.2 Анализ потери гетерозиготности в гене ТР53 213
ГЛАВА 6 Значение rs78378222 гена тр53 при диффузной в-крупноклеточной лимфоме 215
6.1 Выявление rs78378222 гена ТР53 в опухолевой ткани больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 216
6.2 Частота rs78378222 гена ТР53 в обследованной группе больных ДВККЛ и контрольной выборке 220
ГЛАВА 7 Комплексный анализ молекулярно-генетических нарушений в гене тр53 в опухолевой ткани диффузной в-крупноклеточной лимфомы 223
7.1 Статус гена ТР53 в опухолевой ткани больных диффузной
В-крупноклеточной лимфомой 223
ГЛАВА 8 Клиническое значение нарушений в гене тр53 в опухолевой ткани диффузной в-крупноклеточной лимфомы 229
8.1 Молекулярно-генетические нарушения в гене ТР53 в опухолевой ткани диффузной В-крупноклеточной лимфомы и особенности клинического течения заболевания 229
8.2 Нарушения в гене ТР53 в опухолевой ткани диффузной В-крупноклеточной лимфомы и эффективность терапии больных анализируемой группы 233
8.3 Значение нарушений в гене ТР53 в опухолевой ткани диффузной В-крупноклеточной лимфомы в группе, не включающей прогностически неблагоприятные клинические варианты заболевания 238
8.4 Клиническое значение сочетанных нарушений в гене ТР53 в опухолевой ткани больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой 252
ГЛАВА 9 Обсуждение результатов собственного исследования 261
Заключение 306
Выводы 307
Практические рекомендации 310
Список сокращений и условных
Обозначений 311
Список литературы
- Лабораторно-инструментальные факторы прогноза
- Специальные методы исследования
- Структура неравновесия по сцеплению между rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53
- Характеристика мутаций в кодирующей последовательности гена ТР53
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ) характеризуется высокой морфологической, клинической гетерогенностью и неоднородным ответом пациентов на современные протоколы лечения, включающие таргетный препарат моноклональных антител – ритуксимаб [Lenz G., 2008; Nogai Н., 2010; Поддубная И.В., 2014]. Несмотря на применение ритуксимаба, почти в трети случаев заболевания наблюдается рецидив или первичная резистентность опухоли к терапии [Gisselbrecht С., 2010; Yamaguchi Н., 2011; Тумян Г.С., 2014].
Недавние достижения в понимании молекулярных основ патогенеза ДВККЛ позволили выделить прогностически различные подтипы опухоли по профилю экспрессии генов (из активированных В-клеток, В-клеток зародышевого центра и подтипа с первичным поражением средостения) [Lenz G., 2008]. Однако чаще в рутинной клинической практике врач-онкогематолог использует Международный прогностический индекс (МПИ), в основу которого положены лабораторно-инструментальные и клинические факторы риска [Lu Т., 2016]. Остается открытым вопрос о том, что лежит в основе включенных в него параметров, а также каков будет ответ опухоли на терапию [Monti S., 2012].
В научной литературе описаны многочисленные механизмы, ассоциированные
с рефрактерностью к терапии больных ДВККЛ. Вместе с тем, цитотоксическое
действие большинства применяемых противоопухолевых препаратов, в том числе,
ритуксимаба, независимо от конкретных механизмов действия, в конечном итоге
реализуется путем индукции апоптоза [Meek D., 2009; Ozaki Т., 2011]. Нарушение
функции ТР53, как ключевого участника сложной регуляторной сети
программированной клеточной смерти, может являться одним из механизмов формирования резистентности ДВККЛ к лечению.
Аберрации гена TP53 играют ключевую роль в патогенезе многих
онкологических заболеваний человека [Ventura А., 2007], в том числе, в
возникновении, развитии и прогрессировании ДВККЛ, однако до настоящего
времени знания о конкретных механизмах формирования и значении нарушений в
гене ТР53 при данном варианте неходжкинских лимфом (НХЛ) носят ограниченный
характер [Hallek М., 2013; Wang Y., 2015; Lu Т., 2016]. Учитывая то, что
результирующее действие аномалий ТР53 во многом зависит от
тканеспецифического контекста и конкретного вида клеток, в которых проявляется его активность, невозможен механический перенос общих знаний об участии ТР53 в онкогенезе на ДВККЛ [Чумаков П., 2007].
Наиболее изученным аспектом изменчивости ТР53 при ДВККЛ являются мутационные события в гене [Jaffe E., 2008; Young К., 2007; Stefancikova L., 2011; Xu-Monette Z., 2012; Tamimi Y., 2014; Diederichs S., 2016]. Являющаяся наиболее полной базой мутаций в гене ТР53 при опухолях человека, IARC TP53 mutation database предназначена для сбора, структурирования и аннотирования данных, которые в последующем могут позволить точно интерпретировать значимость мутации TP53 при конкретной патологии и использовать их в стандартной клинической практике [Petitjean А, 2007]. Информации о российской популяции в текущей версии IARC TP53 mutation database не представлена. Вместе с тем, частота
и спектр мутаций в данном гене при одном и том же типе онкологической патологии может значительно меняться в зависимости от популяционной принадлежности изучаемой выборки [Tennis М., 2006].
До настоящего времени при секвенировании ТР53 в опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ практически все исследования были сосредоточены на поиске мутаций в 5–8-м экзонах. Однако, по мнению Li et al. (2013), с учетом мутаций в нетранслируемых участках и интронах гена, ТР53 является одним из самых часто мутирующих при ДВККЛ, что может свидетельствовать о недооценке частоты и функционального эффекта аберраций в ТР53 при данном заболевании.
Такие варианты повреждения гена ТР53 при ДВККЛ, как аллельный дисбаланс
и аномальное метилирование промотора менее освещены в литературе.
Немногочисленные опубликованные исследования, посвященные изучению
полиморфизмов зародышевой линии ТР53 при ДВККЛ, ограничивались анализом отдельных маркеров [Diederichs S., 2016], однако с учетом современных представлений о структурной организации ТР53 очевидно, что для уточнения влияния маркеров данного гена на его функцию необходимы знания о гаплотипе [Petitjean A., 2007].
В этой связи невозможно переоценить важность изучения конкретных механизмов инактивации ТР53 при ДВККЛ, а их комплексный анализ может дать более полное представление о возможных механизмах участия изменчивости данного гена в возникновении и опухолевой прогрессии заболевания.
Степень разработанности темы. Несмотря на большую научную и практическую ценность, изучение аномалий гена ТР53 не входит в обязательный спектр обследования при ДВККЛ, в этой связи отсутствуют сведения о частоте и спектре аберраций в гене ТР53 в Российской популяции [Petitjean А., 2007; Edlund K., 2012].
В подавляющем большинстве опубликованных зарубежных работ не уделяется
внимания генетическим нарушениям в некодирующих участках генома
(нетранслируемых областях, интронных сайтах сплайсинга) [Diederichs S., 2016]. Аспект нарушения функции гена ТР53 при ДВККЛ в результате метилирования промотора практически не освещен в литературе, а комплексный анализ изменчивости гена ТР53 отсутствует [Amara К., 2007].
Немногочисленные опубликованные исследования, посвященные изучению полиморфизмов зародышевой линии rs1042522, rs17878362, rs1625895 и rs78378222 гена ТР53 при ДВККЛ, ограничиваются анализом отдельных маркеров, без учета гаплотипной структуры гена, а также сосредоточены на анализе их ассоциации с предрасположенностью к развитию заболевания и не оценивают клинический эффект и предиктивное значение данных маркеров при терапии ДВККЛ ритуксимабом [Diederichs S., 2016; Petitjean А., 2007].
Все вышеперечисленное определяет недостаточную разработанность
выбранной темы, делая её областью интереса современной онкогематологии.
Цель исследования. На основе комплексного изучения изменчивости гена
ТР53, обусловленной соматическими мутациями, метилированием промотора,
аллельным дисбалансом, функционально значимыми полиморфизмами и
гаплотипной структурой, определить его роль в опухолевой прогрессии ДВККЛ.
Задачи исследования
1. Описать возможные механизмы формирования дефицита функции ТР53 на
уровне ДНК при ДВККЛ и оценить их вклад в опухолевую прогрессию заболевания.
2. Изучить распределение частот аллелей и генотипов функционально
значимых полиморфизмов rs1042522, rs17878362, rs1625895 и rs78378222 гена ТР53
и выявить их ассоциацию с предрасположенностью к развитию ДВККЛ.
3. Сравнить частоты тройных гаплотипов rs1042522–rs17878362–rs1625895
гена ТР53 и силу неравновесия по сцеплению между данными полиморфизмами в
группе больных ДВККЛ и группе популяционного контроля.
-
Определить частоту и спектр мутаций в 5–10-м экзонах и прилегающих участках интронов гена ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ г. Новосибирска и сравнить их с данными, представленными для ДВККЛ в IARC TP53 mutation database.
-
Оценить функциональную значимость всех выявленных мутаций в гене ТР53 с помощью анализа in silico и данных, описанных в литературе и представленных в специализированных базах.
-
Описать частоту потери гетерозиготности, метилирования промотора и rs78378222, а также сочетанных нарушений в гене ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ.
-
Оценить ассоциацию выявленных молекулярно-генетических изменений в гене ТР53 с особенностями клинического течения ДВККЛ.
8. Провести анализ влияния наследуемых маркеров гена ТР53, определяемых в
здоровой ткани, а также соматических аберраций ТР53 в опухолевой ткани на
непосредственные и отдаленные результаты терапии ДВККЛ. Выявить наиболее
прогностически значимые при ДВККЛ варианты изменений в гене ТР53 и сравнить
их ценность с общепринятым Международным прогностическим индексом.
Научная новизна работы. Показано, что дефицит функции гена ТР53 вовлечен во все этапы опухолевой прогрессии ДВККЛ, начиная от формирования предрасположенности к развитию, инициализации опухоли до определения темпов прогрессирования заболевания и ответа лимфомы на лечение.
Комплексный анализ позволил установить, что недостаточность функции ТР53 может участвовать в формировании ДВККЛ по «двух-ударному» механизму, для которого характерно выключение обеих аллелей гена, за счет последовательно возникающих аберраций в ТР53.
Впервые получены данные о конкретных типах повреждения гена ТР53 при ДВККЛ, частоте их возникновения и предиктивной значимости: к наиболее частым, прогностически и клинически важным аномалиям относятся мутации и потеря гетерозиготности у носителей rs78378222 гена ТР53, вместе с тем, метилирование промотора гена ТР53 при ДВККЛ имеет меньшее значение.
Также впервые показано наличие при ДВККЛ функционально значимых интронных и синонимичных замен в ТР53, а также вариантов мутаций (p.R213Х), которые могут быть конкретными мишенями для уже имеющихся подходов целевой терапии онкозаболеваний.
Впервые определен спектр и частота мутаций в гене ТР53 в Российской популяции больных ДВККЛ. Эти данные будут включены в IARC TP53 mutation database при последующем ее обновлении.
Доказано наличие популяционных особенностей в локализации «горячих точек» мутаций в ТР53 при ДВККЛ и гаплотипной структуре гена ТР53 в популяции Сибирского региона России, которые заключаются в отсутствии описанного в литературе для ряда выборок жесткого сцепления между rs1042522, rs1625895 и rs17878362.
Показано, что молекулярно-генетические нарушения в гене ТР53 при ДВККЛ могут определять биологические характеристики опухоли, лежащие в основе МПИ (параклиническую активность, объем и распространенность опухолевого процесса на момент диагностики).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты,
полученные в ходе исследования, углубляют и расширяют знания об участии аномалий гена ТР53 в опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы.
Данные о наличии тройного гомозиготного диплотипа wArgG/wArgG (rs1042522–rs1625895–rs17878362) гена ТР53 могут быть использованы в качестве дополнительного критерия при формировании групп высокого риска развития ДВККЛ, в частности, у лиц, имеющих длительный контакт с экзогенными канцерогенами.
Выявление функционально-значимых мутаций в последовательности 5–8-го экзонов и прилегающих участков интронов, а также минорного гомозиготного генотипа С/С rs78378222 гена ТР53 в опухолевой ткани ДВККЛ свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания, склонном к быстрому прогрессированию. Обнаружение данных молекулярно-генетических нарушений в гене ТР53 при ДВККЛ ассоциировано с неблагоприятным прогнозом и низкой эффективностью стандартных протоколов терапии заболевания, что необходимо учитывать при выборе программы лечения.
Знания о наличии или отсутствии мутантного статуса гена ТР53 и конкретных типах аберраций в каждом из случаев ДВККЛ могут быть использованы для персонализированного подбора новых видов терапии (например, индукции правильного чтения при образовании преждевременных стоп-кодонов в результате конкретных нонсенс мутаций) с целью преодоления резистентности опухоли и повышения эффективности лечения.
Методология и методы исследования. Настоящая работа выполнена
согласно принципам доказательной медицины. Для выполнения диссертационного
исследования применялись общенаучные методы (количественное и качественное
описание), общелогические методы (анализ и синтез), а также статистические
методы, соответствующие цели и задачам работы. Фрагмент диссертации,
посвященный изучению значения полиморфной и гаплотипной структуры гена ТР53,
имеет характер проспективного исследования, дизайн исследования
«случай контроль». Фрагмент, посвященный анализу роли соматических аберраций в опухолевой ткани при ДВККЛ, является ретроспективным исследованием (2010-2016-х гг.). В работе использованы современные специальные методы исследования: фенол-хлороформная экстракция ДНК, аллель-специфическая ПЦР, ПЦР с фланкирующими праймерами, ПЦР с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов, бисульфитная конверсия ДНК, метил-чувствительная ПЦР, метод прямого секвенирования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Дефицит функции гена ТР53, вызванный аберрациями на уровне ДНК, вовлечен во все этапы опухолевой прогрессии ДВККЛ, начиная от формирования предрасположенности к развитию, инициализации опухоли до определения темпов прогрессирования заболевания и ответа лимфомы на лечение; причем недостаточность функции гена ТР53 при ДВККЛ может формироваться по «двух-ударному» механизму, когда для развития опухоли необходимы последовательные изменения двух аллелей антионкогена: одного в зародышевой линии, а второго за счет соматических аберраций, или по аналогичному ему «двух-ударному» принципу с выключением двух аллелей антионкогена за счет последовательных соматических аберраций (мутаций, метилирования промотора или потери гетерозиготности в различных сочетаниях).
-
Тройные гаплотипы (rs17878362–rs1042522–rs1625895) гена ТР53 имеют большее значение в определении предрасположенности или устойчивости к развитию ДВККЛ, в сравнении с отдельными полиморфизмами, при этом эффект гаплотипа зависит от уровня гетерозиготности маркеров.
-
В трети случаев в опухолевой ткани больных ДВККЛ выявляются аберрации в ТР53 с доказанным онкогенным потенциалом, характеризующиеся низкой частотой метилирования промотора гена, популяционными особенностями локализации «горячих точек» мутаций, селекцией мутаций в участках гена, кодирующих ДНК-связывающий домен белка р53, возникновением патогенетически значимых интронных и сеймсенс мутаций и селекцией редкого аллеля С rs78378222.
-
Аберрации в гене ТР53 могут являться биологической основой клинических параметров, включенных в Международный прогностический индекс, который является универсальным предиктором ответа больных ДВККЛ на терапию с включением ритуксимаба: случаи заболевания с их обнаружением характеризуются исходно массивным специфическим поражением и быстро-прогрессирующим течением лимфомы, выраженными симптомами интоксикации и признаками параклинической активности опухоли.
5. Сохранная функция TP53 имеет решающее значение для достижения
благоприятного исхода заболевания при терапии ДВККЛ с включением
ритуксимаба; наиболее значимыми аберрациями в гене ТР53 в опухолевой ткани
больных ДВККЛ, ассоциированными со снижением как скорости и частоты ответа на
терапию, так и выживаемости больных ДВККЛ вне зависимости от других факторов,
являются мутации и потеря гетерозиготности в гене ТР53 у носителей rs78378222
(генотип С/С) в опухолевой ткани, а также генотип G/G rs1625895, выявляемый в
здоровой ткани.
Степень достоверности. Достоверность результатов диссертации обеспечена обоснованностью исходных теоретических позиций и основана на применении в ходе исследования комплекса современных методов клинического, биохимического и молекулярно-генетического исследования, а также общепринятых статистических методов, соответствующих цели и задачам работы. Исследование выполнено на крупнейшей отечественной выборке больных ДВККЛ (202 пациента), по размерам сопоставимой с выборками зарубежных исследований. Диагноз заболевания был верифицирован в соответствии с современной Классификацией опухолей гемопоэтической и лимфоидной ткани ВОЗ 2008 года [Jaffe E., 2008] и подтвержден
иммуногистохимически с применением широкой панели моноклональных антител к
кластерам дифференцировки опухолевых клеток. Забор биологического материала
выполнялся до начала терапии для исключения ее влияния на результаты
исследования. Контрольные группы формировались из популяционной выборки
жителей г. Новосибирска и были репрезентативны по полу и возрасту, тип выборки –
случайная. Методики обследования, использованные в работе, были
стандартизованы для всех участников. Использовались апробированные
лабораторно-инструментальные методы, сертифицированные наборы реагентов, приборы, компьютерные программы для анализа и обработки полученных данных.
Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения
диссертации представлены и обсуждены на Европейской конференции по генетике
человека (Глазго, 2015), на конгрессах Европейской гематологической ассоциации
(Вена, 2015; Стокгольм, 2013), на Евразийских гематологических форумах
(Новосибирск, 2012, 2014; Санкт-Петербург, 2016), на конгрессах гематологов
России (Москва, 2014, 2016), на международной конференции «Bioinformatics of
Genome Regulation and Structure/Systems Biology» (Новосибирск, 2014, 2016), на 7-м
съезде Российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015), на
Российском онкологическом научно-образовательном форуме с международным
участием «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2015), на 3-й Всероссийской конференции
с международным участием «Генетика опухолей кроветворной системы» (Санкт-
Петербург, 2015), на Всероссийском Съезде онкологов (Санкт-Петербург, 2013), на
Российской конференции с международным участием «Злокачественные лимфомы»
(Москва, 2013), на 9-м Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2016), на 6-й
Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в
гематологии» (Санкт-Петербург, 2012), на конференции «Молекулярно-генетические
методы исследования в гематологии» (Санкт Петербург, 2013), на Всероссийской
научной конференции молодых ученых-медиков (Москва, 2012), на конференции-
конкурсе молодых ученых НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова (Санкт-
Петербург, 2013), на конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и
клинической онкологии» (Томск, 2013, 2014, 2015), на 3-м Всероссийском съезде
геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012), на съездах терапевтов
Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2012, 2014, 2016), на Всероссийской
научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и
клинической медицины» (Киров, 2015).
Результаты исследования внедрены в практику гематологического отделения Городского гематологического центра г. Новосибирска, а также в учебный процесс кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ Новосибирского государственного медицинского университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, из них 16 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации. Получены 3 патента на изобретения РФ и 1 патент на изобретение Евразийского патентного ведомства.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 386 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», 6 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список цитируемой литературы
Лабораторно-инструментальные факторы прогноза
Появление в последние годы новых данных о генетических, иммуногистохимических и биологических характеристиках данной опухоли привело к улучшению критериев диагностики, значительному изменению представлений о прогнозе пациентов, улучшению эффективности терапии, а также открыло путь к подходам таргетной терапии ДВККЛ [401; 564].
Прогресс в понимании природы данной опухоли привел к признанию того, что ДВККЛ является гетерогенным по клиническим проявлениям, прогнозу, глубине и скорости ответа на терапию заболеванием [243]. По результатам морфологических, биологических и клинических исследований в текущей Классификации опухолей из кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2008 года, ДВККЛ была разделена на ряд морфологических, молекулярных и иммунофенотипических подтипов и клинических вариантов [292]. Подавляющее большинство случаев заболевания могут быть отнесены к группе ДВККЛ не классифицированной иным образом (NOS). Отдельными вариантами являются: богатая Т-клетками и гистиоцитами ДВККЛ, первичная ДВККЛ центральной нервной системы, первичная кожная ДВККЛ, первичная медиастинальная ДВККЛ и ВЭБ-позитивная ДККВЛ пожилых [243]. ДВККЛ неклассифицированная иным образом может быть разделена на центробластный, иммунобластный, анапластический и плазмобластный морфологические варианты [292]. ДВККЛ составляет около трети случаев НХЛ взрослых: до 25–30 % в развитых и 30–40 % в развивающихся странах, что делает этот вариант лимфом одним из самых частых в мире [166; 209]. С начала девяностых годов заболеваемость ДВККЛ имела прирост на 3–4 % в год, с 2006 года прирост стал более плавным – около 1 % в год [209]. Возрастающую заболеваемость ДВККЛ связывают как с улучшением диагностики, сбора статистических данных, изменением классификационных подходов, ухудшением экологии во всем мире, так и неблагоприятной эпидемиологической обстановкой по ВИЧ-инфекции [209; 218]. Описаны расовые, этнические и географические различия в распространенности ДВККЛ [483]. Заболевание встречается в любом возрасте, но наибольшее число случаев приходится на возраст около 70 лет. Мужчины болеют в 1,5 раза чаще женщин [218].
Этиология ДВККЛ остается точно неизвестной. Среди факторов риска, приводящих к заболеванию, обсуждаются генетические факторы (наследственность, полиморфизм генов), коморбидные состояния (иммуносупрессия, инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), инфекция вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), хроническое воспаление), неблагоприятные факторы внешней среды (ионизирующее излучение, солнечная радиация, пестициды) и ожирение [118; 128; 203; 232; 234; 283; 340; 468; 495; 504; 622]. У большинства пациентов проявление заболевания характеризуется наличием быстро увеличивающихся безболезненных лимфоузлов [166]. Около 40 % пациентов имеют экстранодальные очаги поражения в гастроинтестинальном тракте, центральной нервной системе, легких, мочевыводящем тракте и костях. Лишь 15 % пациентов имеют вовлечение в процесс костного мозга [218]. В трети случаев наблюдаются симптомы опухолевой интоксикации – В-симптомы, к которым относятся вечерняя лихорадка выше 38 С, снижение массы тела на 10 % за 6 месяцев, ночные профузные поты. Более половины пациентов имеют те или иные признаки параклинической активности опухоли в виде увеличения уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), а также острофазовые реакции: повышение уровня фибриногена (Фг), С-реативного белка (СРБ) в сыворотке крови, а также ускорение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) [218].
Чаще ДВККЛ верифицируется в продвинутых стадиях заболевания (III и IV). Определение стадии лимфомы проводится в соответствии с классификацией Ann Arbor [292]. Стадия I характеризуется поражением лимфоузлов одной анатомической области или локализованным поражением одного экстралимфатического органа; стадия II – поражением двух и более анатомических групп лимфатических узлов по одну сторону от диафрагмы или локализованное поражение одного экстралимфатического органа с или без поражения других лимфатических областей по ту же сторону от диафрагмы; стадия III – лимфатических узлов по обе стороны диафрагмы, которое может сочетаться с локализованным поражением одного экстралимфатического органа; стадия IV – диссеминированным поражением одного или нескольких экстралимфатических органов, поражение печени или костного мозга [292].
С 1993 года для прогнозирования течения заболевания и ответа его на терапию во всем мире применяется Международный прогностический индекс (МПИ), основанный на результатах многофакторного анализа клинических характеристик 4500 больных [53]. Неблагоприятными прогностическими факторами, согласно данному индексу, являются (таблица 1.1.1.1): III и IV стадия заболевания, повышение уровня ЛДГ, возраст пациента старше 60 лет, общесоматический статус по системе Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) [606] равный двум и выше, вовлечение в опухолевый процесс более одной экстранодальной области, а также наличие опухолевых поражений размером более 5 см. По сумме неблагоприятных факторов прогноза выделяются 4 группы пациентов, имеющих значимые различия в частоте достижения полной ремиссии (ЧР) и 5-летней общей выживаемости (ОВ): низкого (0–1 неблагоприятный фактор), промежуточного-низкого (2 неблагоприятных фактора), промежуточного-высокого (3 неблагопритяных фактора) и высокого риска (4 и более неблагопритяных факторов) [8].
Специальные методы исследования
При опухолях системы крови мутации в ТР53 встречаются реже, чем при других новообразованиях: лишь в 19,3 % случаев при лимфоидных и 11,1 % – миелоидных опухолях против 60 % – при эпителиальных новообразованиях [112; 268; 404; 512]. Несмотря на меньшую частоту мутаций в ТР53 при гемобластозах [252; 7; 31], верификация их свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения заболевания для пациента с опухолью крови. Показано, что онкогематологические пациенты с мутациями в ТР53 имеют худшую выживаемость, выше риск трансформации в более агрессивные варианты заболевания и большие темпы прогрессии опухоли [112; 182]. Кроме того, было показано, что предшествующая неэффективная терапия лимфопролиферативных заболеваний строго ассоциирована с наличием мутаций ТР53 и ответственна за развитие резистентности к терапии второй линии [295; 380].
В 1990 году был организован ресурс IARC TP53 mutation database для регистрации мутаций в ТР53. Текущая версия базы данных IARC TP53 mutation database 2012 года содержит информацию о более, чем 30 000 описанных при опухолях соматических мутациях ТР53, и более 700 мутациях зародышевой линии [150]. Анализ данной базы показывает, что при ДВККЛ было описано более 120 мутаций в гене. Из них 95 % составили однонуклеотидные замены: 88 % – миссенс, 7 % – нонсенс мутации, 5 % – мутации со сдвигом рамки считывания. Среди однонуклеотидных замен 26 % составили мутации типа GC AT в CpG островках, замены GC AT – 25 %, GC CG – 8 %, GC TA – 10 %, AT GC - 13 %, AT CG – 5 %, AT TA – 8 %.
Более 95 % мутаций было выявлено в экзонах 5–8-го гена ТР53, при этом мутации в экзонах 9–11-го не описаны. «Горячими точками» мутаций в гене ТР53 при ДВККЛ были следующие кодоны в порядке убывания частоты: 248-й, 273-й, 175-й, 245-й, 281-й, 244-й, 305-й, 249-й и 297-й [150].
По данным разных авторов частота мутации в гене ТР53 при ДВККЛ несколько колеблется, что может быть связано с ограничениями применяемых для обнаружения мутаций методов, неоднородностью самих мутаций в гене ТР53, неоднородностью выборок по размеру и этнической принадлежности, а также гетерогенностью самого заболевания [382]. Young K. et al. (2008) проанализировали частоты мутаций ТР53 в наиболее крупных выборках больных ДВККЛ (всего 477 случаев) из Японии, США, Германии, Испании, Франции и Бразилии. Средняя частота составила 21,4 % с колебаниями от 17,6 % до 23,2 % [306].
Большинство (более 95 %) описанных при ДВККЛ мутаций в гене ТР53 сосредоточены в высоко-консервативных участках ДНК-связывающего домена (5–8-й экзоны) [112]. Все они приводят к нарушению транскрипционнозависимых функций р53. В ряде случаев мутации в гене ТР53 могут приводить к дефициту его функции вне связи с транскрипцией. Так, на примере лечения лимфомных клеток было показано, что мутантный белок р53 может перемещаться в митохондрии, но не способен индуцировать апоптоз [374], либо наоборот, может сохранять способность запускать программируемую клеточную смерть, но утрачивает возможность перемещаться в митохондрии [599]. Согласно базе IARC TP53 mutation database [403], а также данных ретроспективных клинических исследований [182], мутации ТР53 коррелируют с плохой выживаемостью ДВККЛ. Показано, что мутации в гене TP53 являются независимым прогностическим показателем плохой выживаемости больных ДВККЛ, получавших терапию по протоколам CHOP, ACVBP, NCVBP и другим программам, не включающим ритуксимаб [141; 157; 384; 386; 422; 482; 555].
После добавления в программы терапии ДВККЛ ритуксимаба и значительного улучшения выживаемости пациентов с данным заболеванием потребовалась переоценка влияния мутационного статуса гена ТР53 на клинический исход заболевания. Для решения вопроса о прогностической значимости мутаций в TP53 при ДВККЛ в когорте пациентов, получающих терапию по протоколам, включающим ритуксимаб, было проведено относительно небольшое число работ (таблица 1.2.6.1.2.1).
Структура неравновесия по сцеплению между rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53
Определение сцепленных аллелей изучаемых маркеров гена ТР53 выполнялось по описанной ранее методике [431]. Проводилось попарное гаплотипирование (rs1042522/rs1625895, rs1042522/rs17878362 и rs1625895/rs17878362) методами ПЦР с фланкирующими праймерами и гнездовой ПЦР с аллель-специфичным праймером (см. таблицу 2.3.4.1), обеспечивающим наработку одного из редких аллелей в анализируемой паре маркеров. В последующем выполнялся анализ ПДРФ для выяснения сцепленного с ним аллеля второго маркера (рисунки 2.3.8.1–2.3.8.3).
Анализ гаплотипов rs1625895 и rs17878362 гена ТР53, результаты ПЦР с фланкирующими праймерами, электрофорез в 5 % полиакриламидном геле Для гаплотипирования отбирались пробы гетерозиготные минимум по двум маркерам, поскольку в противном случае гаплотип может быть расписан без дополнительного исследования.
Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета статистических программ STATISTICA, версия 7.0 и SPSS, версия 16.0. Анализ генетических маркеров гена ТР53 начинался с определения частоты встречаемости каждого из аллелей, генотипов и гаплотипов. Для всех изученных полиморфных вариантов генов в выборках популяционного контроля распределение генотипов проверялось на соблюдение равновесия ХардиВайнберга (р2АА + 2рqАа + q2аа = 1). Для оценки ассоциации между изучаемыми генетическими маркерами и риском развития заболевания было рассчитано отнение шансов с 95 %
доверительным интервалом (ДИ). Если все значения ДИ выше, либо ниже единицы, шанс (риск) развития заболевания считался статистически значимо выше (ниже) в группе с изучаемым генотипом или гаплотипом, в сравнении с популяцией.
При сравнении частот аллелей, генотипов и гаплотипов, а также для сравнения наблюдаемых и ожидаемых частот, использовался стандартный критерий 2 Пирсона. В случае, если абсолютные частоты более 20 % признаков в группе не превышали 5, использовали точный критерий Фишера.
Для обработки полученных материалов при оценке количественных признаков использовали вычисление средней арифметической (М) и ее ибки (m).
С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Коэффициент корреляции считали значимым, если вероятность ибки не превышала 0,05.
Анализ структуры неравновесия по сцеплению (LD) с определением коэффициентов D и r2 между rs1042522, rs1625895 и rs17878362 проводился с применением программы MIDAS [222] и онлайн-калькулятора CubeХ [221]. Визуальное представление блоков сцепления в гене ТР53 было получено с помощью программы Haploview [249].
Эффект противоопухолевой терапии оценивались по критериям: частота ремиссий (ЧР), скорость ответа на терапию (СО), 5-летняя общая (ОВ), 5-летняя бессобытийная (БСВ) и 5-летняя безрецидивная выживаемость (БРВ).
При расчете ОВ началом мониторинга считался момент постановки диагноза, событием – смерть от любой причины. При расчете БСВ началом мониторинга считался момент постановки диагноза, событием – рецидив, прогрессия либо летальный исход от любой причины. При расчете БРВ началом мониторинга являлся момент достижения ремиссии, событием – рецидив заболеания. При анализе СО на терапию началом мониторинга являлся момент начала лечения, событием – констатация полной ремиссии заболевания.
Пятилетнюю выживаемость пациентов и СО на терапию исследовали с помощью анализа цензурированных данных с использованием функции вероятности выживания Каплана-Майера. Дополнительно определялась медиана (Ме) выживаемость и СО на терапию с 95 % ДИ. Для сравнения кривых выживаемости и скорости ответа использовали непараметрический Log-rank критерий.
Для прогнозирования риска наступления события для пациентов с ДВККЛ и оценки влияния независимых предикторов на этот риск применялась модель пропорциональных рисков регрессии Кокса с определение 95 % ДИ. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р 0,05.
Характеристика мутаций в кодирующей последовательности гена ТР53
Однофакторный анализ методом регрессии Кокса в группе больных ДВККЛ в целом (таблица 3.5.8.1) показал неблагоприятное прогностическое значение на 5-летнюю БСВ пациентов группы 2–4-й общесоматического статуса по шкале ECOG (р 0,001, ОШ = 2,270, 95 % ДИ (1,5101–3,414)), III и IV стадии заболевания (р = 0,001, ОШ = 1,858, 95 % ДИ (1,269–2,721)), вовлечение в опухолевый процесс печени (р = 0,029, ОШ = 2,093, 95 % ДИ (1,081–4,055)) и селезенки (р = 0,027, ОШ = 1,807, 95 % ДИ (1,068–3,059)), наличие экстранодальных очагов поражения (р = 0,014, ОШ = 1,944, 95 % ДИ (1,431-3,304)), высокая и промежуточная\высокая группа риска по МПИ (р = 0,001, ОШ = 1,403, 95 % ДИ (1,147–1,716)), а также повышенный уровень СОЭ (р = 0,050, ОШ = 1,013, 95 % ДИ (1,000–1,026)).
Схожие неблагоприятные факторы прогноза выявлены в подгруппе пациентов, получающих ритуксимаб: группы 2–4-я общесоматического статуса по шкале ECOG (р = 0,003), III и IV стадии заболевания (р = 0,011), вовлечение в опухолевый процесс печени (р = 0,040) и селезенки (р = 0,008), наличие экстранодальных очагов поражения (р = 0,027), высокая и промежуточная/высокая группа риска по МПИ (р 0,001). При однофакторном анализе в подгруппе пациентов с ДВККЛ без включения в программу терапии первой линии ритуксимаба показано неблагоприятное прогностическое влияние на БСВ следующих факторов: группы 2–4-я общесоматического статуса по шкале ECOG (р = 0,015, ОШ = 2,016, 95 % ДИ (1,150–3,693)), а также генотип Arg/Arg rs1042522 (р = 0,009, ОШ = 2,512, 95 % ДИ (1,258–5,015)).
Экспрессия CD10 опухолевыми клетками, а также GCB-like подтип опухоли, определяемые иммуногистохимическим методом, являлись благоприятными факторами прогноза в группе пациентов с ДВККЛ в целом, а также подгруппе лиц, не получающих ритуксимаб (р 0,005 и р 0,05, соответственно).
При многофакторном анализе, включающем группу прогноза по МПИ и генотип rs1625895 было показано неблагопритяное прогностическое значение высокой и промежуточной\высокой группы риска по МПИ для ОВ в выборке пациентов с ДВККЛ в целом, а также подгруппе лиц, получающих ритуксимаб в терапии первой линии (р = 0,001 и р = 0,002, соответственно). В подгруппе лиц, получавших терапию с включением ритуксимаба, было показано, что при генотипе G/G rs1625895 пациент имеет в 1,8 раза ниже шансы достичь 5-летней БСВ, в сравнении с больными, имеющими генотипы G/A и А/А (р = 0,005, ОШ = 1,849, 95 % ДИ (1,208–2,830)).
При многофакторном анализе, включающем группу прогноза по МПИ, генотип rs1625895, а также иммуногистохимический подтип опухоли по классификации Ханса, помимо неблагоприятного прогностического влияния на БСВ высокой и промежуточной/высокой группы риска по МПИ в выборке пациентов с ДВККЛ в целом, а также подгруппе лиц, не получающих ритуксимаб в терапии первой линии терапии (р = 0,043 и р = 0,081, соответственно), показано благоприятное влияние на прогноз БСВ GCB-like подтипа опухоли в обеих группах (р = 0,007 и р = 0,020, соответственно).
Для БРВ в группе ДВККЛ в целом, а также подгруппе пациентов, получающих ритуксимаб, показано неблагоприятное прогностическое значение лишь анемии, как в ходе однофакторного анализа, так и в многофакторном анализе, включающем также группу прогноза по МПИ, генотип rs1625895 (таблица 3.5.8.2). Таблица 3.5.8.1 – Анализ предикторов бессобытийной выживаемости больных ДВККЛ методом регрессии Кокса
В ходе исследования была выявлена ассоциация гомозиготного генотипа Arg/Arg rs1042522 со снижением показателей непосредственных и отдаленных результатов терапии без включения ритуксимаба больных ДВККЛ, а также гомозиготного генотипа G/G rs1625895 с наихудшими показателями эффективности лечения пациентов, получающих ритуксимаб. Кроме того, проведенный анализ частоты тройных гаплотипов и диплотипов rs17878362–rs1042522–rs1625895 гена ТР53 в исследуемой группе пациентов и контрольной выборке показал, что гаплотип wArgG является самым распространенным и имеет различный эффект на риск развития ДВККЛ в зависимости от уровня гетерозиготности.
Учитывая эти данные, нами был выполнен анализ эффективности проводимого лечения в исследуемой группе больных ДВККЛ, имеющих гомозиготный диплотип wArgG/wArgG и гетерозиготный диплотип, сочетающией wArgG с любым другим гаплотипом.
При анализе группы пациентов с ДВККЛ в целом оказалось, что у носителей диплотипа wArgG/wArgG после проведения первой линии терапии частота ремиссий была значимо ниже (р = 0,017), чем у лиц, имеющих гаплотип wArgG в сочетании с любым другим гаплотипом (43,1 % против 67,4 %, соответственно). Анализ кривых выживаемости методом Каплана-Майера показал, что у носителей диплотипа wArgG/wArgG отмечалось также снижение показателей 5-летней ОВ (р = 0,037) и тенценция к снижению БСВ (р = 0,082) (таблица 3.5.4.1 и 3.5.6.1, рисунок 3.5.9.1 и 3.5.9.2).
Анализ по подгруппам выявил, что полученные различия были обусловлены пациентами, не получающими ритуксимаб в составе терапии первой линии. В данной подгруппе у носителей гаплотипа wArgG в гомозиготном состоянии частота ремиссий составила 29,2 % против 65,2 % (р = 0,013) при wArgG в гетерозиготном состоянии. ОВ находилась на уровне 20,8 % (с медианой выживаемости 13 месяцев) против 56,5 % (р = 0,007), в БСВ – 16,7 % (с медианой выживаемости 10 месяцев) против 52,2 % (р = 0,003), соответственно (рисунок 3.5.9.3 и 3.5.9.4).
Таким образом, риск не ответить на проводимую терапию без включения ритуксимаба в подгруппе больных ДВККЛ, являющихся носителями диплотипа wArgG/wArgG, был выше в 4,6 раза (ОШ = 4,6, 95 % ДИ (1,33-15,57)), риск не дожить до 5-летнего рубежа – в 4,9 раза (ОШ = 4,9, 95 % ДИ (1,37-17,85)), в том числе без прогрессии и рецидива – в 5,5 раз (ОШ = 5,5, 95 % ДИ (1,41-21,03)).
Данные показатели риска превосходили описанные показатели риска неудач терапии в данной подгруппе пациентов, полученные в зависимости только от генотипа rs1042522.
Неблагоприятное прогностическое значение диплотипа wArgG/wArgG в подгруппе пациентов с ДВККЛ, не получающих ритуксимаб, на отдаленные результаты лечения было подтверждено методом регрессии Кокса как при однофакторном (для ОВ – р = 0,010, ОШ = 1,403, 95 % ДИ (1,083-1,818); для БСВ - р = 0,006, ОШ = 1,421, 95 % ДИ (1,107–1,823)), так и при многофакторном анализе, включающем группу прогноза по МПИ (таблица 3.5.3.1 и 3.5.4.1): для ОВ – р = 0,018, ОШ = 1,374, 95 % ДИ (1,055–1,790); для БСВ – р = 0,012, ОШ = 1,387, 95 % ДИ (1,075–1,789).
Однако, было показано, что неблагоприятное прогностическое значение диплотипа wArgG/wArgG не превосходит неблагоприятного прогностического значения групп промежуточного и высокого/промежуточного риска по МПИ (рисунок 3.5.9.5).