Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы по теме исследования 14
1.1. Общее понятие о множественной миеломе. Эпидемиология. Этиология 14
1.2. Современный подход к диагностике множественной миеломы 17
1.2.1. Диагностика множественной миеломы .17
1.3. Иммунофенотипическая характеристика плазматических клеток
1.3.1. Нормальные плазматические клетки .18
1.3.2. Патологические плазматические клетки .21
1.4. Основные принципы лечения множественной миеломы 24
1.4.1. Иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга и его роль в оценке эффективности лечения .26
1.5. Характеристика и спецификация антигенов, встречающихся на плазматических клетках .28
1.6. Исследование иммунофенотипа плазматических клеток лейкоконцентрата 31
1.7. Значение маркеров миеломных клеток в определении прогноза заболевания 35
1.8. Значение иммунофенотипирования для детекции и мониторинга минимальной резидуальной болезни .40
Глава 2. Характеристика больных и методы исследования 44
2.1. Характеристика пациентов 45
2.2. Иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга
2.2.1. Процесс пробоподготовки 51
2.2.2. Окрашивание исследуемого образца .52
2.3. Статистическая обработка результатов 55
Глава 3. Иммунофенотипическая характеристика плазматических клеток костного мозга первичных больных множественной миеломой 56
3.1. Иммунофенотип плазматических клеток костного мозга здоровых доноров 57
3.2. Иммунофенотип плазматических клеток костного мозга первичных больных множественной миеломой . Клинический пример 1 .65
3.3. Сопоставление результатов иммунофенотипического и морфологического методов исследования плазматических клеток костного мозга 70
Глава 4. Иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга в процессе лечения 73
4.1. Изменение иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга до и после мобилизации 76
4.2. Изменение иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга до и после трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток 81
Клинический пример 2 .85
4.3. Характеристика иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга после завершения трансплантационного лечения .93 Клинический пример 3 94
4.4. Изменение частоты экспрессии аберрантных маркеров плазматических клеток костного мозга в процессе лечения .106
4.5. Оценка эффективности трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с множественной миеломой .107
4.6. Исследование методом проточной цитофлюориметрии общего количества плазматических клеток и плазматических клеток
с аберрантной экспрессией в костном мозге до и после ауто-ТГСК 112
Глава 5. Иммунофенотипирование плазматических клеток в лейкоконцентрате, собранном в результате мобилизации ГСК .115
5.1. Исследование общего количества плазматических клеток с аберрантной экспрессией в костном мозге и в лейкоконцентрате, собранном за первую процедуру лейкафереза 116
5.2. Оценка выживаемости без прогрессии после ауто-ТГСК пациентов с ММ в зависимости от количества аберрантных плазматических клеток в лейкоконцентрате 119
Заключение 123
Выводы 135
Список литературы
- Основные принципы лечения множественной миеломы
- Иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга
- Сопоставление результатов иммунофенотипического и морфологического методов исследования плазматических клеток костного мозга
- Изменение частоты экспрессии аберрантных маркеров плазматических клеток костного мозга в процессе лечения
Введение к работе
Актуальность исследования. Современные программы терапии симптоматической формы множественной миеломы (ММ) основаны на принципе ранней интенсификации и высокодозной консолидации с применением трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток. Аутоло-гичная трансплантация в настоящее время рассматривается в качестве «стандарта» при лечении больных множественной миеломой моложе 60–65 лет.
Интенсивное лечение ММ предполагает максимальное подавление опухолевого клона. Внедрение в клиническую практику трансплантационных методик позволило существенно повысить результаты лечения множественной миеломы, для оценки которых исследовательская группа EBMT разработала такие понятия, как полная и частичная ремиссия, выживаемость без прогрессии и без признаков заболевания [Blade J. et al, 1998].
В последнее десятилетие в схемы терапии ММ были включены новые препараты, обладающие направленным механизмом действия. Это ингибитор протеасом (бортезомиб) и иммуномодулирующие препараты (талидомид и леналидомид). Применение новых препаратов на этапе индукции позволило у 25–35% больных ММ получать строгий полный ответ. Дальнейшее выполнение высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией аутоло-гичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) увеличило частоту полных иммунохимических ремиссий до 45–50% [Bensinger W. et al., 2008].
В связи с возможностью существенной редукции опухолевой массы после аутологичной трансплантации чувствительность стандартных методов оценки эффективности лечения ММ (морфологическое исследование аспирата костного мозга и иммунохимический контроль М-градиента) оказалась недостаточной. Появилась необходимость в дополнительном применении более чувствительных методик детекции минимальной резидуальной болезни (МРБ).
К дополнительным методам исследования костного мозга относятся иммунофенотипирование методом проточной цитофлюориметрии (ПЦ) и молекулярно-биологические исследования, которые постепенно становятся обязательными при многих гематологических заболеваниях. С помощью данных методов удается получить больше информации о биологии заболевания, определить остаточные опухолевые клетки, оценить эффективность лечения [Lima M. et al., 2000], а также выявить ранние признаки рецидива заболевания, тем самым предопределить прогноз заболевания.
Актуальность нашего исследования заключается в том, что иммунофе-нотипирование плазматических клеток (ПК) костного мозга методом проточ-3
ной цитофлюориметрии является одним из наиболее современных методов диагностики гемобластозов. Так, при моноклональной гаммапатии неясного генеза (МГНГ) на этапе диагностики с помощью проточной цитофлюоримет-рии появилась возможность выявления клональных ПК, что позволяет своевременно диагностировать данную нозологию [Rajkumar S.V. et al., 2014]. При тлеющей миеломе (ТМ) с помощью проточной цитофлюориметрии удается выявить более 60% клональных ПК в костном мозге больных, что диктует необходимость немедленного начала специфической терапии. При соли-тарной плазмоцитоме (СП) на основе данного метода была пересмотрена и сформулирована новая классификация, основанная на содержании опухолевых клеток в костном мозге: СП без вовлечения костного мозга и СП с минимальным вовлечением костного мозга. При таких заболеваниях, как амилоидоз и макроглобулинемия Вальденстрема, проточная цитометрия, выявляющая клональные ПК в костном мозге, обеспечивает дополнительную информацию, способствующую быстрой и четкой диагностике. И наконец, при ММ проточная цитометрия, не являющаяся стандартным методом диагностики, используется в основном при трудных диагностических ситуациях, а также при оценке и мониторинге МРБ на фоне лечения и для подтверждения строгого полного ответа после проведенной терапии [Rajkumar S.V. et al., 2014].
При исследовании образца костного мозга больного ММ оценка одновременной экспрессии CD138/CD38 представляет собой оптимальную комбинацию маркеров для идентификации ПК костного мозга и их отличия от других клеточных популяций и гемопоэтических стволовых клеток.
Наиболее важными маркерами, благодаря которым опухолевые мие-ломные клетки можно отличить от нормальных плазматических клеток костного мозга, являются: CD45, CD19, CD117, CD56 в популяции CD138+/CD38+ плазматических клеток.
Исследование остаточной опухолевой популяции плазматических клеток костного мозга после завершения высокодозной программы лечения ММ будет способствовать оценке результативности терапии.
В нашем исследовании был подробно изучен иммунофенотип ПК костного мозга у больных ММ, как на момент диагностики заболевания, так и в процессе лечения, включавшего высокодозную химиотерапию с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК). При изучении публикаций отечественных и зарубежных авторов нами не обнаружено сообщений, указывающих на возможность изменения иммунофенотипа миеломных клеток или сочетания аберрантных маркеров в процессе трансплантационного лечения, что дает основание считать данную проблему актуальной.
Цель исследования – изучить иммунофенотипические характеристики плазматических клеток костного мозга больных множественной миеломой до и после трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток крови.
Задачи исследования:
-
Исследовать иммунофенотип плазматических клеток костного мозга первичных больных ММ методом проточной цитофлюориметрии.
-
Исследовать иммунофенотип плазматических клеток костного мозга здоровых доноров и сопоставить его с иммунофенотипом первичных больных ММ.
-
Определить изменение иммунофенотипических характеристик плазматических клеток костного мозга у больных ММ в процессе лечения: после индукционной терапии, до и после трансплантации аутологичных ге-мопоэтических стволовых клеток.
-
Изучить качественный и количественный состав плазматических клеток в лейкоконцентрате, собранном за первую процедуру лейкафереза, и оценить выживаемость без прогрессии после трансплантации в зависимости от количества перелитых плазматических клеток.
Научная новизна заключается в следующем:
-
Впервые описана иммунофенотипическая характеристика плазматических клеток костного мозга, исследованная на различных этапах лечения ММ.
-
Определена гетерогенность иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга больных ММ и здоровых доноров.
3. На основании иммунофенотипических маркеров плазматических
клеток было определено общее количество плазматических клеток и плазма
тических клеток с аберрантной экспрессией в лейкоконцентрате, заготовлен
ном за первую процедуру лейкафереза.
4. Анализ показателей безрецидивной выживаемости больных ММ по
сле трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток крови
позволил выявить отсутствие зависимости сроков развития рециди
ва/прогрессии от количества трансплантированных плазматических клеток с
аберрантной экспрессией.
Практическое значение работы. Методика иммунофенотипирования с использованием 4-цветной проточной цитофлюориметрии включала в себя исследование плазматических клеток костного мозга у больных ММ с применением 6 маркеров (CD138, CD38, CD45, CD19, CD117, CD56). Данная ме-
тодика была адаптирована как для применения в диагностике ММ, так и в процессе мониторинга минимальной остаточной болезни.
Положения, выносимые на защиту:
-
На момент диагностики множественной миеломы наиболее часто встречающимся иммунофенотипом был CD19-/CD117-/CD56+, характеризующийся отсутствием экспрессии CD19, CD117 и наличием экспрессии CD56 аберрантных маркеров в популяции плазматических клеток CD138+/CD38+ костного мозга.
-
При исследовании иммунофенотипа плазматических клеток первичных больных множественной миеломой и здоровых доноров костного мозга была выявлена гетерогенность экспрессии аберрантных маркеров.
-
При исследовании иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга в процессе лечения наблюдалось изменение соотношения разных популяций плазматических клеток с различным аберрантным иммунофеноти-пом как до, так и после трансплантации ГСК.
-
После применения высокодозного мелфалана с последующей трансплантацией аутологичных ГСК было выявлено достоверное снижение содержания как общего количества плазматических клеток, так и количества аберрантных плазматических клеток в костном мозге больных множественной миеломой.
-
Результаты исследования плазматических клеток в лейкоконцентра-те, заготовленном за первую процедуру лейкафереза, подтвердили отсутствие зависимости сроков развития рецидива/прогрессии заболевания от количества перелитых плазматических клеток с аберрантной экспрессией.
Внедрение результатов исследования. Разработанный алгоритм исследования плазматических клеток костного мозга у больных ММ методом проточной цитофлюориметрии как на этапе диагностики, так и в процессе трансплантационного лечения внедрен в работу научно-клинических отделений ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Апробация и реализация работы
Основные положения диссертации представлены в постерных докладах:
на XXXVIII ежегодном собрании Европейской группы по трансплантации костного мозга (Женева, 2012 г.);
на Европейской школе по гематологии «Учебно-практический семинар по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток» (Малага, 2015 г.).
Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии «Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии), трансфузиологии, патологии гемостаза, хирургической гематологии, анестезиологии и интенсивной терапии» ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации 19 июня 2017 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе: 2 – в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 печатные работы – в журналах ВАК Министерства образования и науки Азербайджанской Республики (на русском языке) и 1 абстракт в зарубежном журнале (на английском языке).
Объем и структура работы. Диссертация представлена на 162 страницах и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 10 отечественных и 151 иностранный источник, и приложения. В тексте работы содержится 18 таблиц, 27 рисунков.
Основные принципы лечения множественной миеломы
Патологические ПК, претерпевшие опухолевую трансформацию, наряду с нормальными мигрируют обратно в костный мозг, где под влиянием микроокружения костного мозга формируют опухолевый клон, впоследствии приводящий к остеодеструкциям.
Цитокины, секретируемые стромальными элементами костного мозга, играют важную роль для вновь прибывших в костный мозг ПК. Как известно, интерлейкин-6 является фактором роста для миеломных ПК. В результате ряда активационных процессов миеломные ПК приобретают высокую пролиферативную активность одновременно со снижением их способности к апоптотической гибели [98]. Маркер адгезии CD56 отсутствует на поверхности ПК в норме, в то же время экспрессируется миеломными ПК в начале заболевания, однако исчезает на этапе прогрессии заболевания [6, 39]. Приобретение молекул адгезии связано с возвращением миеломных ПК обратно в КМ после завершения изотипического синтеза иммуноглобулинов в лимфатическом узле.
По ряду морфологических особенностей миеломные ПК могут быть идентифицированы в мазке костного мозга. В зависимости от степени анаплазии и опухолевой прогрессии трансформированные ПК имеют различные структурные и морфологические характеристики [132].
Так, Greipp et al. выделили четыре основных морфологических подтипа миеломных ПК: зрелые, промежуточные, незрелые, плазмобласты [117]. Наличие большого количества опухолевых клеток и плазмобластная морфология в мазке костного мозга являются доказательными критериями неблагоприяного прогноза [122]. Анализ мазка костного мозга является одним из важнейших исследований с целью оценки успешно проведенного лечения, а также для подтверждения рецидива или прогрессии заболевания.
Субстратом ММ являются не полностью дифференцированные ПК, а так называемые миеломные ПК. Созревание ПК является достаточно сложным и многоступенчатым процессом [34], что создает трудности при дифференциальной диагностике между миеломными ПК и нормальными ПК методом световой микроскопии. Исследование мазка не подразумевает анализа значительного количества клеток, но является одним из обязательных исследований при диагностике минимальной резидуальной болезни (МРБ). Таким образом, анализ мазка костного мозга для диагностики МРБ обладает наименьшей чувствительностью по сравнению с более чувствительными методами, такими как электрофорез, иммунофиксация, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и проточная цитофлюориметрия (ПЦ) [6]. Иммунофенотипирование (ИФ) ПК костного мозга методом проточной цитофлюориметрии позволяет проводить единовременный анализ большого количества клеток, учитывая интенсивность флюоресценции, проводить исследование экспрессии одновременно нескольких маркеров, а также обладает высокой чувствительностью для диагностики минимальной резидуальной болезни [59].
Иммунофенотипирование позволяет четко дифференцировать нормальные ПК от миеломных ПК в костном мозге больного, единовременно определяя иммунофенотип злокачественного клона.
Особенно важно при проведении данного исследования обращать внимание на следующие аспекты:
o аспираты костного мозга достаточно часто бывают контаминированы периферической кровью, что занижает содержание ПК при анализе образца; o проведение мониторинга минимальной резидуальной болезни включает в себя количественный учет миеломных ПК и нормальных ПК в костном мозге; o при мобилизации и сборе гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) возможно проведение ИФ-анализа полученного продукта афереза, для выявления в нем содержания смешанной популяции нормальных и миеломных ПК; o на различных этапах лечения возможно изменение количественной экспрессии антигенов CD138/CD38/CD45/CD19/CD117/CD56 на ПК, а также изменение иммунофенотипа ПК костного мозга [59, 62]. Как известно, при созревании нормальных ПК перестают экспрессировать на поверхности В-клеточные маркеры, такие как CD19, CD20, одновременно отмечается экспрессия маркеров CD38, CD138. Во всех проанализированных нами источниках иммунофенотип опухолевых ПК представлен следующим сочетанием маркеров: CD45dim/CD38bright/CD138++/CD19-/CD20-/CD56+/CD117+ или CD45-/CD38+/CD138bright [62, 69, 85]. Яркая экспрессия CD56 (N-CAM, молекулы клеточной адгезии семейства иммуноглобулинов), которая обеспечивает интеграцию миеломных ПК в строму костного мозга на поверхности опухолевых клеток, экспрессируется в 55–78% случаев, являясь благоприятным прогностическим фактором [88].
В редких случаях на поверхности опухолевых клеток выявляется аберрантная экспрессия CD10, CD28, CD40 и CD117 (c-kit), а также слабая экспрессия CD45, причем наличие последнего маркера является фактором благоприятного прогноза [74, 93, 142].
Таким образом, можно прийти к заключению, что результаты иммунофенотипирования ПК костного мозга методом проточной цитофлюориметрии могут быть использованы не только для детекции минимальной резидуальной болезни, но и для определения прогноза заболевания у больных ММ.
Иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга
Количество материала (l), взятого для исследования той или иной пробы на ПЦ, вычислялось по формуле, в зависимости от числа лейкоцитов: Необходимый объем пробы (l) = 1000/количество лейкоцитов (109/l). При исследовании иммунофенотипа у первичных больных с ММ количество исходного материала (аспирата КМ) составляло 100 мкл. При исследовании лейкоконцентрата во время мобилизации и сбора ГСК количество исследуемого образца составляло 50 мкл и процедура с лизисом эритроцитов не проводилась, в остальном все было идентично методике, описанной выше.
Подсчет количества ПК CD138+/CD38+ от общего числа ядросодержащих клеток 104 клеток производился по формуле: [ЯСК 109 х количество ПК CD138+/CD38+ от общего числа ядросодержащих клеток в ЛК в шт.]/количество подсчитанных событий методом проточной цитометрии.
Аналогично было подсчитано количество ПК с аберрантной экспрессией от общего числа ядросодержащих клеток в ЛК х 104 по формуле: [ЯСК 109 х количество ПК с аберрантной экспрессией от общего числа ядросодержащих клеток в ЛК (шт.)]/количество подсчитанных событий методом проточной цитометрии.
Исследование популяции плазматических клеток костного мозга было основано на последовательном гейтировании (гейт – от английского «gate» – ворота) – установке мультипараметрического дискриминационного окна, то есть введении логических ограничений в протокол исследования.
Иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга выполнялось после завершения индукционной терапии (перед 1-й ауто-ТГСК), через 2-8 месяцев после 1-й ауто-ТГСК и через 12-18 месяцев после 2-й трансплантации. Подбор необходимой панели моноклональных антител для выявления миеломных ПК методом проточной цитофлюориметрии позволило наиболее тщательно выделить целевую клеточную популяцию.
Для выделения популяции плазматических клеток и исследования МРБ был взят за основу протокол A. Rawstron [127]. Необходимое количество событий при исследовании в гейте CD138/CD38 составляло не менее 50 клеток, а в случае оценки МРБ было собрано до 500 000 событий. Для диагностических целей на момент постановки диагноза было достаточно 50 000 событий.
Рисунок 4 иллюстрирует последовательное гейтирование плазматических клеток. Так, в первом гейте выделяли все ядросодержащие клетки костного мозга по характеристикам бокового светорассеяния (SSC) и экспрессии CD45 (1 гейт, рисунок 4(А)), затем устанавливали гейт ПК по коэкспрессии CD138+/CD38+ (2 гейт, рисунок 4(Б)), заключительным был гейт ПК по прямому (FSC) и боковому светорассеянию (SSC), в котором еще раз очищали популяцию от дебриса (3 гейт, рисунок 4(В)). Далее представлены гистограммы CD38 против каждого из аберрантных маркеров, в которых оценивалась экспрессия или отсутствие маркеров CD19, CD117, CD56. На рисунке 4(Г) представлена популяция ПК CD38+/CD19-, характеризующаяся экспрессией маркера CD38 и отсутствием экспрессии CD19; на рисунке 4(Д) представлена популяция ПК CD38+/CD117+, характеризующаяся экспрессией маркеров CD38 и CD117; на рисунке 4(Е) представлена популяция ПК CD38+/CD56+, характеризующаяся экспрессией маркеров CD38 и CD56.
Проанализировав клетки образца, представляющие собой такой негативный контроль, обозначали пороговые уровни флюоресценции (границы между так называемыми «антиген-позитивными» и «антиген-негативными» объектами) на логарифмической шкале интенсивности флюоресценции, разбивая таким образом каждую диаграмму на четыре квадранта (см. рисунок 4).
Для анализа собранной информации использовались классические методы описательной статистики, частотного, дисперсионного, регрессионного анализа и анализа выживаемости. Для связанных выборок использовали Т-критерий, для подсчета медианы – критерий Вилкоксона. При подсчете величины Р ( 0,05) использовали тест хи-квадрат по методу Макнемара, а также поправку Бонферрони. Преобразование и анализ данных проводили с помощью аналитического пакета SAS 9.4 и программы Dell Statistica 13.1. Работа выполнена совместно с сотрудниками лаборатории биостатистики ФГБУ НМИЦГ Минздрава России (зав. лабораторией – к.т.н. С. М. Куликов) и с сотрудником компании «StatSoft Russia» П. Боровиковым (info@statsoft.ru).
Сопоставление результатов иммунофенотипического и морфологического методов исследования плазматических клеток костного мозга
При проведении иммунофенотипирования костного мозга у пациентки Б.В.В., 53 лет, на момент диагностики заболевания (28.11.2011) было выявлено: 45% плазматических клеток в гейте CD138+/CD38+, среди которых выявлялась экспрессия каждого из аберрантных маркеров: CD19+; CD117+; CD56+. Количественнаяя экспрессия каждого из перечисленных маркеров в указанном выше гейте составила: CD19 (40%); CD117 (65%); CD56 (74%).
После завершения индукционной терапии или перед мобилизацией и сбором ГСК в очередном иммунофенотипическом исследовании костного мозга (26.04.12) было выявлено 0,4% плазматических клеток в гейте CD138+/CD38+. В гейте плазматических клеток CD138+/CD38+ не выявлялась экспрессия ни одного из аберрантных маркеров: CD19-, CD117-, CD56-.
При иммунофенотипировании костного мозга данной пациентки перед 1-й ауто-ТГСК (14.06.2012) было выявлено: 0,1% плазматических клеток CD138+/CD38+. Экспрессия аберрантных маркеров в данном гейте не определялась: CD19-, CD117- , CD56-.
Таким образом, на основании проведенных иммунофенотипических исследований плазматических клеток костного мозга пациентки Б.В.В., 53 лет, в процессе лечения, можно сделать вывод об эффективности высокодозного мелфалана с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, вследствие чего количество опухолевых клеток было сведено к минимуму.
Контрольное исследование иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга через 12-18 месяцев после завершения трансплантационного лечения было выполнено 4 пациентам. У 3 из них не было выявлено экспрессии ни одного из аберрантных маркеров (CD117-/CD56-), также отмечалось отсутствие экспрессии маркера CD19. Однако следует отметить, что при исследовании перечисленных маркеров ПК на предыдущих этапах лечения наблюдалась экспрессия одного или двух аберрантных маркеров (у каждого из пациентов или в иммунофенотипе каждого пациента). И только у одной пациентки из 4 после второй трансплантации продолжала сохраняться экспрессия аберрантного маркера CD56, при отсутствии CD117 и CD19, хотя на предыдущих этапах лечения (до и после 1-й ауто-ТГСК) наблюдалась экспрессия всех трех маркеров (см. таблицу 9).
Результаты нашего исследования, полученные с помощью метода иммунофенотипирования, показали, что после высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток у 3 пациентов в полной ремиссии (на основании результатов иммунохимического исследования сыворотки крови и суточной мочи) с иммунофенотипом CD138+/CD38+/CD19-/CD45dim/CD117-/CD56-, не выявлялись аберрантные маркеры, т.е. можно предположить вероятное достижение строгого полного ответа в результате проведенной терапии. В качестве иллюстрации иммунофенотипирования костного мозга пациента с множественной миеломой от момента диагностики заболевания до завершения лечения приводим описание клинического случая. Клинический пример 3 Больной Г.В.В., 49 лет, наблюдался в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ФГБУ НМИЦГ Минздрава России с января 2011 г., где был установлен диагноз: Множественная миелома, протекающая с парапротеинемией G и протеинурией BJ, II А стадия, множественно-очаговая форма. Патологические переломы Th 3, Th 8, Th 9 позвонков.
В 2008 г. у больного появились боли в поясничном отделе позвоночника. При рентгенологическом исследовании были выявлены протрузии L4-5 позвонков. В 2009 г. после силовых упражнений возникла интенсивная боль в левой половине грудной клетки, была диагностирована трещина реберной дуги слева. Летом 2010 г. возобновился болевой синдром в грудной клетке. В НИИ им. Склифосовского «Клиника боли» получал терапию нестероидными противовоспалительными препаратами – с частичным эффектом.
В ноябре 2010 г., после ДТП, в РНЦ рентгенорадиологии было выполнено рентгенологическое исследование костей грудной клетки, при котором были обнаружены множественные очаги остеодеструкций (наиболее крупный – в акромиальном отрезке левой ключицы), компрессионные переломы Th 3, Th 8, Th 9 позвонков. В связи с подозрением на множественную миелому у больного был взят материал и направлен на иммунохимическое исследование сыворотки крови и мочи в лабораторию НМИЦГ. По результатам иммунохимического исследования от 23.12.10 в сыворотке крови был выявлен М-градиент, образованный парапротеином G – 57,7г/л, и протеинурия Бенс-Джонса – 0,56г/л; все классы нормальных иммуноглобулинов были снижены в 2-3 раза; выявлялся повышенный уровень 2-микроглобулина – 4,0 мг/л; значение СРБ не превышало нормальные значения. Уровень общего белка составлял 112 г/л.
Дообследование (28.12.2010) было проведено в гематологическом отделении УКБ № 1 ПМГМУ им. И. М. Сеченова. В пунктате костного мозга было выявлено 60,5% плазматических клеток. На рентгенограммах костей черепа и таза также были выявлены множественные очаги остеодеструкций. В общем анализе крови (14.01.11) была выявлена умеренная анемия: Нв – 101 г/л; увеличение СОЭ – до 69 мм/ч. В биохимическом анализе крови выявлялся повышенный уровень мочевой кислоты – 443 мкмоль/л; общий белок составлял 118 г/л.
Изменение частоты экспрессии аберрантных маркеров плазматических клеток костного мозга в процессе лечения
Многоцентровые проспективные рандомизированные клинические исследования представили убедительные данные, подтверждающие возможность получения глубокого и длительного противоопухолевого ответа у больных ММ при использовании современных инновационных методов лечения.
У большинства пациентов, которым была выполнена трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, была достигнута полная ремиссия. Несмотря на это, рецидив заболевания, как правило, наступал в течение 3-5 лет после трансплантации и до сих пор является основной причиной смертности этих пациентов [89]. Немаловажная роль в рецидиве заболевания после трансплантации принадлежит персистирующим в костном мозге резидуальным опухолевым клеткам, названным минимальной резидуальной болезнью [29, 89]. Исследования, в которых полная ремиссия у пациентов с ММ была достигнута на основании критериев Blade [29], отмечали также преимущественную ВБП и высокую ОВ [13, 19, 74, 150].
До сих пор оценка эффективности лечения включала только морфологическое исследование пунктата костного мозга и исследование патологического парапротеина методом иммуноэлектрофореза. Однако на сегодняшний день актуально исследование плазматических клеток костного мозга методом проточной цитофлюориметрии наряду с перечисленными исследованиями.
В своей работе P. Kapoor с соавторами [65] оценили влияние строгой ПР на показатели времени до прогрессии и ОВ у больных ММ после ауто-ТГСК. Оказалось, что вероятность 5-летней ОВ больных, достигших строгой ПР, составила 91% по сравнению с 53% у больных без строгой ПР. Поскольку определение «строгая ПР» подразумевало, помимо стандартных критериев ПР, отсутствие клональных клеток в костном мозге, подтвержденное иммуногистохимическим или иммунофлюоресцентным методами [79], можно считать, что авторы определяли значение и влияние минимальной резидуальной болезни на результаты лечения ММ.
В задачи настоящего исследования входило: исследование иммунофенотипа плазматических клеток костного мозга методом проточной цитофлюориметрии больных множественной миеломой на момент диагностики заболевания и сопоставление полученных результатов с иммунофенотипом здоровых доноров костного мозга; определение частоты встречаемости различных иммунофенотипических характеристик плазматических клеток костного мозга перед мобилизацией ГСК, до и после трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток; изучение изменения иммунофенотипических характеристик плазматических клеток костного мозга у больных ММ в процессе лечения; исследование количества плазматических клеток и плазматических клеток с аберрантной экспрессией в лейкоконцентрате, собранном за первую процедуру лейкафереза, а также оценка выживаемости без прогрессии после трансплантации в зависимости от количества перелитых плазматических клеток в лейкоконцентрате.
В исследование было включено 54 больных, из них 24 пациента в момент диагностики заболевания и 30 пациентов в процессе лечения, а также контрольная группа из 7 здоровых доноров костного мозга. 20 пациентам на момент сбора и заготовки ГСК было проведено иммунофенотипирование плазматических клеток лейкоконцентрата. Основными маркерами ПК костного мозга, исследованными в работе, были: CD138, CD38, CD45, CD19, CD117, CD56, которые прослеживались в динамике и в процессе трансплантационного лечения, включающего мобилизацию ГСК, 1-ю ауто-ТГСК и 2-ю ТГСК. Всем пациентам наряду с иммунофенотипированием выполнялось морфологическое исследование аспирата костного мозга, общий и биохимический анализы крови, а также иммунохимическое исследование сыворотки крови и суточной мочи. Результаты перечисленных исследований сопоставлялись с результатами иммунофенотипирования костного мозга методом проточной цитофлюориметрии.
При сопоставлении морфологического и иммунофенотипического исследований костного мозга отмечались значимые расхождения в количестве плазматических клеток, что подробно описано в разделе 3.3 и обобщено в таблице 8.
При иммунофенотипическом исследовании костного мозга здоровых доноров было выявлено 0,07-0,72% (медиана – 0,39%) плазматических клеток CD138+/CD38+. Поскольку экспрессия CD138+/CD38+ определялась в костном мозге как больных, так и здоровых доноров, эти данные не были включены в анализ. Было выявлено 4 разновидности сочетания экспрессии аберрантных маркеров на плазматических клетках в костном мозге здоровых доноров: CD45+/CD19-/CD117-/CD56+ (3), CD45-/CD19-/CD117-/CD56+ (2), CD45-/CD19+/CD117-/CD56+ (1), CD45+/CD19-/CD117-/CD56- (1). В момент диагностики ММ при исследовании плазматических клеток костного мозга с аберрантной экспрессией маркеров было выявлено 5 разновидностей иммунофенотипа: CD45dim/-/CD19-/CD117-/CD56+ (9); CD45dim/ /CD19+/CD117+/CD56+ (6); CD45dim/-/CD19-/CD117+/CD56+ (4); CD45dim/-/CD19 /117-/CD56- (4); CD45dim/-/CD19+/117-/CD56+ (1). Так, на момент диагностики наиболее часто встречавшимся иммунофенотипом ПК стал CD138+/CD38+/CD45dim/-/CD19-/CD117-/CD56+, выявленный у 9 больных