Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы 13
2.1 Кроветворное стромальное микроокружение в костном мозге мыши и человека 13
2.2 Системная регуляция стромальных предшественников 19
2.3 Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения 25
Глава 3. Материалы и методы 39
3.1 Источники стромальных клеток костного мозга 39
3.2. Методы выделения стромальных клеток костного мозга 41
3.3 Методы исследования стромальных клеток костного мозга 46
3.4 Статистическая обработка данных 68
Глава 4. Результаты 70
4.1 Стромальные предшественники кроветворного микроокружения в костном мозге мыши 70
4.2 Системная регуляция стромальных предшественников: роль паратиреоидного гормона 80
4.3 Стромальные предшественники кроветворного микроокружения в костном мозге человека: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки и колониеобразующие единицы фибробластов 94
4.4 Системная регуляция стромальных предшественников: влияние гидрокортизона на мультипотентные мезенхимные стромальные клетки 113
4.5 Системная регуляция стромальных предшественников: отличия стромальных предшественников из костного мозга людей разных возрастных групп 118
4.6 Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения 124
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 162
5.1 Иерархия стромальных предшественников 162
5.2 Системная регуляция стромальных предшественников: роль паратиреоидного гормона 176
5.3 Системная регуляция стромальных клеток: роль гидрокортизона 180
5.4 Системная регуляция стромальных клеток: отличия стромальных предшественников из костного мозга людей разных возрастных групп 181
5.5 Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения 183
Заключение 197
Выводы 201
Список сокращений и условных обозначений 203
Список литературы 206
Приложение А 250
Приложение Б 265
Приложение В 269
- Системная регуляция стромальных предшественников
- Стромальные предшественники кроветворного микроокружения в костном мозге мыши
- Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения
- Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения
Системная регуляция стромальных предшественников
Ниша для любых стволовых клеток включает в себя клеточные и неклеточные компоненты, продуцируемые локально или системно, которые регулируют самоподдержание, пролиферацию, дифференцировку, выживание и локализацию данного типа предшественников [196]. Стволовые клетки поддерживаются окружающим их микроокружением многими путями, включая физические, структурные, нервные, гуморальные, паракринные, аутокринные и метаболические взаимодействия [335]. Таким образом, комбинация различных сигналов от микроокружения, которые оно производит в процессе развития организма, поддержания гомеостаза, компенсации повреждений или во время различных заболеваний, способна обеспечить регулирование процессов регенерации, сопровождаемых пролиферацией, дифференцировкой или удержанием в состоянии покоя стволовых клеток [257]. Ниже будут рассмотрены некоторые факторы, оказывающие влияние на клетки стромального микроокружения.
Влияние паратиреоидного гормона на клетки стромального микроокружения
Паратиреоидный гормон (ПТГ) – это полипептидный гормон, регулирующий кальциевый гомеостаз и ремоделирование кости [370]. ПТГ используется в настоящее время для стимуляции роста кости у больных остеопорозом [132].
ПТГ был первым описанным системным регулятором кроветворных ниш [73]. Было показано, что ПТГ вызывает активацию и усиливает пролиферацию остеобластов в стромальных культурах [377]. В экспериментах in vivo было продемонстрировано, что через 4 недели введений небольших количеств ПТГ, сходных с теми, что используются для лечения остеопороза [132], число Lin-c-kit+Sca-1+ СКК увеличивалось в 2 раза, а мыши, кроветворение которых после летального облучения было восстановлено КМ, обработанным ПТГ, лучше выживали. Было предположено, что ПТГ может являться физиологическим регулятором, действующим через остеобласты, с помощью которого можно увеличить число длительно репопулирующих КМ СКК in vivo. Известно, что веретеновидные остеобласты несут на поверхности рецептор к ПТГ [21; 73], в связи с чем и был сделан вывод о существовании специализированных остеобластных ниш для СКК. Однако, как было описано выше, в настоящее время существование прямых регуляторных взаимодействий между СКК и остеобластами является спорным. В то же время известно, что существует два типа рецепторов ПТГ: рецептор 1 и 2. Рецепторы 1 типа принадлежат к семейству G-протеинсвязанных рецепторов и способствуют реализации большинства традиционных эффектов, вызываемых ПТГ [198]. Они обнаружены на поверхности клеток почечной и костной тканей, а также на гладкомышечных клетках сосудов. Рецепторы 2 типа были открыты существенно позже, они обнаружены в тканях головного мозга, яичек, поджелудочной железы, в плаценте и гладкомышечных клетках [173]. Скорее всего, описанные изменения концентрации кроветворных предшественников являются следствием воздействия ПТГ на клетки кровеносных сосудов, или вызваны опосредованными эффектами стимуляции остеобластов. Так, например, показано, что ПТГ вызывает повышение экспрессии IL6 в остеобластах [108]. А IL6, в свою очередь, участвует в регуляции количества СКК во время эмбриогенеза [239] и во взрослом организме [398]. Кроме того, ПТГ является одним из регуляторов взаимного соотношения количества остеобластов и остеокластов в кости. В зависимости от дозы и условий введения он может вызывать как увеличение массы кости через активацию остеобластов, так и ее резорбцию, активируя остеокласты [377]. Активация остеобластов сопровождается экспрессией в них генов, необходимых для деградации внеклеточного матрикса, например, коллагеназы 3 [346] и тканевых ингибиторов металлопротеаз [100]. ПТГ снижает экспрессию коллагена I типа [303], щелочной фосфатазы [250] и остеопонтина [286]. Увеличивается экспрессия тканевого активатора плазминогена [161], IL6 и LIF [155], а также IGF1 [260]. Последний принимает участие в регуляции формирования кости в ответ на ее резобцию и важен для гомеостаза костной ткани [164]. Способность ПТГ вызывать изменения в экспрессии генов во многом опосредована циклическим аденозин монофосфатом. Повышение его концентрации, вызванное ПТГ, приводит к активации таких транскрипционных факторов, как факторы семейства AP-1, RUNX2 и CREB. Регуляция большинства этих процессов паратгормоном зависит от протеинкиназы А. Однако известно, что активация данного фермента ингибирует митоген-активируемую протеинкиназу и пролиферацию остеобластов. Но затем кажущееся противоречие было устранено: выяснили, что низкие концентрации ПТГ стимулируют митоген-активируемую протеинкиназу и пролиферацию остеобластов через протеинкиназу К [38]. Активация протеинкиназы К, сопровождаемая повышением уровня 1,4,5-инозитол трифосфата, приводит к увеличению концентрации ионов кальция во внеклеточном пространстве [319]. Резорбция кости остеокластами также приводит к выбросу ионов кальция. Повышение концентрации свободных ионов кальция способствует удержанию СКК в состоянии покоя и локализации их в области эндоста благодаря наличию на поверхности этих клеток кальциевых рецепторов [31]. Кроме того, вызванная ПТГ резорбция кости сопровождается высвобождением большого количества разнообразных эффекторных молекул, ростовых факторов, например, из семейства TGF, и цитокинов, которые также влияют на клетки стромы [102].
Таким образом, ПТГ является системным регулятором стромального микроокружения. При этом его воздействие не ограничено только остеобластами, очевидно, что и другие клетки отвечают на повышение его концентрации. Исследования в культуре продемонстрировали, что ПТГ оказывает влияние и на человеческие ММСК. Так, было показано, что ПТГ вызывает костную дифференцировку ММСК как в сочетании с витамином Д [330], так и без него [432]. Другие исследователи показали, что в зависимости от режима введения ПТГ in vivo, он может как стимулировать остеогенную дифференцировку, так и удерживать ММСК в недифференцированном состоянии [426]. Однако, с другой стороны, есть данные, что ПТГ не влияет на способность ММСК к остеогенной дифференцировке [233]. Очевидно, что влияние ПТГ на истинные МСК, ММСК и их потомки разнообразно и охарактеризовано неполностью.
Влияние гидрокортизона на клетки стромального микроокружения
Глюкокортикоиды также являются системными регуляторами стромального микроокружения [109]. Глюкокортикоиды – это стероидные гормоны из группы кортикостероидов, которые вырабатываются корой надпочечников и выполняют различные регуляторные функции в организме, среди которых основные – это регуляция углеводного обмена и ответ на стрессовые воздействия [127]. Однако также известно, что они участвуют в индукции стромального микроокружения к поддержанию кроветворения. Показано, что для функционирования стромального микроокружения в ДККМ необходим природный глюкокортикоид – гидрокортизон (ГК) [113]. Известны случаи тяжелой анемии, связанные с недостаточностью глюкокортикоидов [185]. Показано, что глюкокортикоиды необходимы для нормальной дифференцировки эритроидного и моноцитарно-макрофагального ростков [167; 401]. Действие глюкокортикоидов на стромальные предшественники неоднозначно. С одной стороны, было показано, что глюкокортикоиды стимулируют дифференцировку ММСК [111], и ингибируют пролиферацию [354]. Известно, что высокие дозы дексаметазона стимулируют экспрессию регулятора жировой дифференцировки, лептина, и при этом подавляют экспрессию остеокальцина, маркера костной дифференцировки [87]. Эндогенное повышение уровня глюкокортикоидов, наблюдаемое с увеличением возраста, вероятно, отвечает за уменьшение популяции и «старение» ММСК [396]. С другой стороны, стромальное микроокружение активируется после экзогенного действия глюкокортикоидов, причем стромальные клетки мыши и человека по-разному отвечают на добавление в культуру гидрокортизона: ниши для СКК, сформированные мышиными стромальными клетками, повреждаются при воздействии гидрокортизона, тогда как человеческие стромальные клетки продолжают полноценно поддерживать СКК [104]. Более активные синтетические глюкокортикоиды, такие как дексаметазон, оказывают более выраженное действие на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз ММСК, в сравнении с натуральными глюкокортикоидами [210; 403]. О влиянии гидрокортизона и других кортикостероидов на более дифференцированные стромальные предшественники известно очень мало. Имеются данные, что он вызывает остеогенную дифференцировку КОЕф [295]. Также было показано снижение концентрации и размера колоний КОЕф в присутствии дексаметазона [348]. Очевидно, что системные изменения, происходящие в организме во время кортикостероидной терапии или же в процессе старения, не проходят бесследно для стромальных предшественников разной степени зрелости и требуют более детального изучения.
Стромальные предшественники кроветворного микроокружения в костном мозге мыши
В отличие от кроветворной системы, в которой иерархия кроветворных предшественников детально охарактеризована, в отделе стромальных клеток иерархическое расположение предшественников установлено приблизительно. Поэтому были проведены исследования для того, чтобы дополнительно охарактеризовать известные предшественники и подтвердить или же установить впервые взаимное расположение известных стромальных клеток-предшественниц.
Взаимное расположение мезенхимных стволовых клеток и колониеобразующих единиц фибробластов
Известно, что СКК пролиферируют крайне редко, поэтому не чувствительны к действию препаратов, ориентированных на делящиеся клетки. Полагали, что это свойство является универсальным для всех стволовых клеток. С целью проверки этого предположения исследовали влияние цитостатических препаратов на два известных стромальных типа предшественников – МСК и КОЕф. В настоящей работе изучали действие различных препаратов, используемых при лечении больных гемобластозами в схемах химиотерапии и режимах кондиционирования перед трансплантацией КМ, на стромальные клетки-предшественницы в КМ мыши. Были использованы методы формирования очага эктопического кроветворения и образования колоний фибробластов в культуре. Схема эксперимента представлена на Рисунке 1.
В костном мозге животных через 3 дня и 6 недель после окончания курса цитостатических препаратов определяли концентрацию КОЕф. Оказалось, что малые дозы цитарабина индуцировали повышение концентрации КОЕф, бортезомиб не оказывал влияния на концентрацию КОЕф в костном мозге, тогда как бусульфан, циклофосфан и метотрексат в использованных дозах снижали концентрацию этих стромальных предшественников в 2 раза (p 0,05) (Рисунок 2). Необходимо отметить, что через 6 недель концентрация КОЕф в костном мозге мышей, получивших курсы цитостатических препаратов, не восстанавливалась.
В отличие от КОЕф МСК оказались нечувствительными к действию использованных препаратов. Размер очага эктопического кроветворения не изменялся через 3 дня и 6 недель после прекращения курсов цитостатических препаратов (Рисунок 3). Исключение составила группа мышей, получавших циклофосфан, – через 1,5 месяца после окончания курса препарата в этой группе размер очага, и, следовательно, количество МСК увеличилось.
Очаги у вторичных реципиентов не отличались по размеру от исходных, что говорит о сохранении способности МСК к самоподдержанию после воздействия вышеуказанных цитостатических препаратов.
Для анализа способности МСК к остеогенной дифференцировке во всех очагах был измерен вес образующейся костной раковины. Так как все раковины в группе взвешивались вместе, определить стандартное отклонение не представлялось возможным. При анализе средних значений видно, что ни один из использованных препаратов не изменял способности МСК к дифференцировке в этом направлении (Таблица 3).
Только в случае ретрансплантации очагов, образовавшихся из костного мозга мышей, получивших курс цитарабина, вес костной раковины заметно уменьшался, однако в этом случае и размер очага был почти в 4 раза меньше, чем в контроле (Рисунок 4).
Для изучения последствий воздействия цитостатических препаратов на регуляцию гомеостаза стромальных клеток-предшественниц на уровне организма костномозговой цилиндр от интактных мышей трансплантировали под капсулу почки мышам через 3 дня после проведенного им курса. Таким образом, имплантированные стромальные предшественники оказывались в организме, только что перенесшем курс химиотерапии. Схема эксперимента приведена на рисунке 5.
Однако, при последующей ретрансплантации очагов, сформировавшихся у мышей, получивших курсы цитостатических препаратов, к интактным вторичным реципиентам размер очагов достоверно не отличался от очагов, ретрансплантированных от контрольных мышей (Рисунок 6). Исключение составили очаги, образовавшиеся у мышей, получивших курсы цитарабина и бусульфана. При их ретрансплантации вновь образовавшиеся очаги в случае воздействия цитарабина были достоверно меньше, а в случае воздействия бусульфана – больше, чем контрольные. Размер очага, образовавшегося под капсулой почки вторичного реципиента, указывает на количество МСК в исходном очаге. Следовательно, тот факт, что у вторичных реципиентов ретрансплантированные очаги не отличались от контрольных, говорит о том, что в исходных очагах количество МСК также не отличалось от такового в контрольных очагах. Таким образом, наблюдаемое увеличение размера очага из КМ, имплантированного мышам, обработанным цитостатическими препаратами (за исключением цитарабина и бусульфана), не связано с увеличением количества МСК.
Итого, показано, что МСК нечувствительны к цитостатическим препаратам, а КОЕф, наоборот, обладают высокой чувствительностью к такого рода воздействиям. Это позволяет предположить, что МСК, как и СКК, в организме находятся в большей степени в состоянии покоя и не пролиферируют, тогда как КОЕф являются более дифференцированными, активно пролиферирующими стромальными предшественниками.
Для того, чтобы выяснить, способны ли КОЕф к самоподдержанию и переносу кроветворного микроокружения, были поставлены следующие эксперименты. Путем культивирования индивидуальных колоний КОЕф был оценен их пролиферативный потенциал. Способность к формированию полноценного кроветворного микроокружения оценивали, имплантируя полученные подслои клеток под капсулу почки сингенных реципиентов.
При анализе пролиферативного потенциала КОЕф была выявлена гетерогенность данных предшественников. Только 45% клонов фибробластных колоний оказались способны проделать 6 и более митозов. После облучения только 6,25% клонов сохранили эту способность.
Трансплантация полученных подслоев клонов, доросших до конфлуентности во флаконе Т25, под капсулу почки не привела к образованию очага эктопического кроветворения ни в одном из случаев (данные по 5 трансплантациям необлученным и 4 – облученным реципиентам), что говорит о том, что эти клетки из клонов КОЕф не способны переносить кроветворное микроокружение. Таким образом, КОЕф, проделавшие более 6 митозов в культуре, не обладают неограниченным пролиферативным потенциалом и способностью к мультилинейной дифференцировке in vivo. Следовательно, эти клетки не идентичны МСК и находятся в иерархическом древе ниже.
Взаимное расположение КОЕф и индуцибельных предшественников
Ранее было показано, что у облученных реципиентов очаг эктопического кроветворения, в 2-3 раза больше по размеру, чем у необлученных. Если ретрансплантировать очаги от облученных реципиентов к необлученным, то формируются очаги нормального размера [27]. Это говорит о том, что за увеличение размера очага, сформированного в облученном реципиенте, ответственны не МСК, а другие стромальные клетки-предшественницы, не обладающие способностью к переносу кроветворного микроокружения. Такие предшественники были названы «индуцибельными». Иерархические взаимоотношения «индуцибельных» предшественников и КОЕф были неизвестны. Для того, чтобы это выяснить, была исследована концентрация и количество КОЕф в очагах эктопического кроветворения, образованных у нормальных и облученных мышей. Схема эксперимента приведена на Рисунке 7.
Предполагались три варианта результатов: в увеличенных очагах, образованных в облученных реципиентах, концентрация КОЕф может быть увеличенной, уменьшенной или такой же, как в контрольных очагах. Если концентрация КОЕф увеличивается, то наиболее вероятно, что КОЕф являются потомками «индуцибельных» предшественников. В случае уменьшения концентрации КОЕф в эктопическом очаге, сформировавшемся в облученном организме, можно предполагать, что КОЕф, не обладая способностью к самоподдержанию, необратимо «израсходовались» на образование повышенного количества «индуцибельных» предшественников. Тогда КОЕф занимают позицию вслед за МСК и находятся выше «индуцибельных» предшественников в родоначальном древе стромальных клеток-предшественниц. Если же количество КОЕф в облученном очаге не изменится, то, видимо, эти предшественники не участвуют в процессе построения кроветворного микроокружения.
Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения
Были изучены изменения стромального микроокружения, возникающие при АА, ОМЛ и ОЛЛ. Исследования проводили в случае АА в момент постановки диагноза и в некоторых случаях в процессе лечения, в случае ОМЛ, ОЛЛ и АА – до и после проведения алло-ТКМ. Ниже приведены результаты исследований стромальных предшественников у больных каждой из перечисленных нозологических форм.
Изменения стромального микроокружения у больных апластической анемией
Стромальное микроокружениев костном мозге больных, находившихся на лечении в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Были получены образцы КМ 45 больных АА (подробные характеристики больных изложены в Таблице А.2 Приложения А). Из них в момент получения образцов КМ 26 человек не получали медикаментозной терапии АА. Из них первичных больных, то есть, не получавших ранее никакого лечения, было 11 человек. Во всех полученных образцах КМ была определена концентрация КОЕф, получены культуры ММСК, охарактеризована их пролиферативная активность, способность к дифференцировкам, экспрессия некоторых генов.
Пролиферация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток
Эффективность получения культур ММСК не отличалась у больных АА и доноров и была равна 100%. Суммарная клеточная продукция была сходной в культурах больных и доноров в течение первых 6 пассажей (Рисунок 36а), затем рост культур от доноров практически прекращался, тогда как ММСК от больных продолжали пролиферировать и были способны проделать еще, по крайней мере, 6 пассажей, удвоив тем самым суммарную клеточную продукцию. В данной серии экспериментов, направленных на выяснение максимально возможного количества пассажей ММСК, в качестве контроля использовали культуры от 8 здоровых доноров КМ и 19 больных АА.
Анализ культур ММСК от больных АА, находившихся в момент взятия КМ в дебюте и на первом этапе течения болезни (до начала комбинированной ИСТ) не выявил отличий в суммарной клеточной продукции от таковой в донорских культурах. При сравнении ММСК от пациентов в дебюте выяснилось, что при ТАА ММСК пролиферируют активнее, чем при НАА, а для ММСК пациентов в ремиссии наблюдается обратная ситуация. ММСК больных РАА (отсутствие ответа на лечение в течение 6 месяцев) пролиферировали менее интенсивно и достоверно отличались от других подгрупп (Рисунок 36б).
Время, необходимое для достижения конфлуентности после исходной посадки (время до П0) не отличалось в культурах ММСК больных АА и здоровых доноров (15,3±0,9 дней в культурах больных против 14,2±0,6 дней в культурах доноров, р 0,05).
Необходимо отметить, что не все культуры ММСК пролиферировали одинаково долго (Таблица 16).
Необходимо признать, что больные, включенные в исследование, распределились неравномерно между подгруппами, что не позволяет делать однозначных выводов. Очевидно, что среди ММСК, полученных от больных АА в дебюте заболевания, на 1 этапе лечения болезни или находившихся в ремиссии, больше культур, способных к длительной пролиферации, чем среди донорских. ММСК больных РАА не способны к длительной пролиферации.
Способность к дифференцировкам мультипотентных мезенхимных стромальных клеток
Для того, чтобы охарактеризовать способность ММСК больных АА формировать функциональное кроветворное микроокружение, необходимо было выяснить, способны ли ММСК больных АА к индукции жировой и костной дифференцировок в культуре.
Оценка качества дифференцировки осуществлялась двумя методами: гистохимически – по характеру специфического окрашивания (краситель Oil Red O для выявления жировой и ализариновый красный для выявления костной дифференцировок), а также путем полуколичественного анализа относительного уровня экспрессии соответствующих маркерных генов. Относительный уровень экспрессии данных генов оценивали с помощью метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией. Полученные результаты обрабатывали в программе Gel-Pro.
Оценка жировой дифференцировки мультипотентных мезенхимных стромальных клеток по гистохимическому окрашиванию
В 17,5% культур донорских ММСК и 20% больных АА индуцировать жировую дифференцировку не удалось. Возможно, это отражает индивидуальные отличия ММСК или исходных образцов КМ.
Полноценная жировая дифференцировка, сопровождающаяся такими морфологическими изменениями, как появление округлых клеток, содержащих большие липидные капли, проходила в культурах ММСК больных АА в несколько меньшем количестве случаев, чем в культурах ММСК доноров (Таблица 17).
В ММСК больных НАА нормальная жировая дифференцировка проходила в сравнимой с ММСК больных ТАА пропорции, тогда как неполная жировая дифференцировка выявлялась в 3 раза чаще. При этом все случаи неудачной индукции дифференцировки относились к ММСК больных ТАА. Если говорить об этапе течения болезни, то отсутствие дифференцировки наблюдалось только в дебюте заболевания; доля успешно продифференцировавшихся культур была сравнима между клетками больных в дебюте и в ремиссии, при этом ММСК больных в ремиссии в 2 раза чаще демонстрировали неполную дифференцировку, чем ММСК больных в дебюте. ММСК всех 2 больных, проанализированных в рецидиве, продифференцировались полностью.
Оценка жировой дифференцировки мультипотентных мезенхимных стромальных клеток по анализу экспрессии генов
Наиболее часто используемым молекулярным маркером успешной жировой дифференцировки является экспрессия гена PPARG. Оказалось, что в ММСК доноров женщин до индукции дифференцировки относительный уровень экспрессии этого гена незначительно выше, чем у больных АА, а в ММСК доноров мужчин сравним с таковым у больных АА. В данных экспериментах все больные АА были мужчины. После индукции дифференцировки в ММСК доноров уровень экспрессии PPARG увеличивался примерно в 3 раза, а в ММСК больных АА результат зависел от статуса больного (Таблица 19).
Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения
Строма КМ участвует в процессах кроветворения (локально, в кроветворных нишах, и дистантно, секретируя ростовые факторы и цитокины) в норме и при различных патологических изменениях кроветворной системы. Изменения в сигнальных путях в стромальных клетках могут влиять на количество СКК и вызывать линия-специфичные изменения в продукции кроветворных клеток [337]. Вместе с тем, не исключено, что нарушения регуляции кроветворного микроокружения могут участвовать в процессе развития лейкозов и других заболеваний кроветворной системы. Так, например, при АА снижена продукция клеточных элементов крови за счет хронической недостаточности гемопоэза в костном мозге. Патофизиология АА разнообразна и до сих пор полностью не ясна. Возможно, отсутствие адекватного взаимодействия СКК со стромой кроветворных органов, необходимого для нормального кроветворения [270], может приводить к нарушению гемопоэза [43; 178; 196; 256].
Само кроветворение в свою очередь также влияет на функционирование стромального микроокружения [27; 90; 197]. При апластической анемии в КМ наблюдаются морфологические изменения, выражающиеся в увеличении жировой и уменьшении кроветворной ткани [413]. На основании приведенных выше фактов было высказано предположение, что дефицит кроветворения в КМ больных АА способен индуцировать нарушения свойств ММСК.
В настоящей работе культуры ММСК из КМ больных АА и доноров были получены с одинаковой 100% эффективностью. Данные мировой литературы по изучаемой теме противоречивы. В разных исследованиях было показано, что эффективность получения культур ММСК из КМ больных АА не отличалась от таковой из КМ доноров [393], либо отличия выявлялись только после длительного культивирования [192], или же успешно получить культуры ММСК из КМ больных АА оказалось возможным только в 50-55% случаев [162; 182]. В этих же работах было отмечено снижение клеточной продукции и пролиферативной активности таких клеток. В нашей работе суммарная клеточная продукция и время до П0 были сходны в культурах больных и доноров в течение первых 6 пассажей. Однако оказалось, что в одинаковых с ММСК доноров условиях культивирования ММСК больных способны пролиферировать дольше. Это противоречит единственным имеющимся в литературе данным о длительном культивировании ММСК от больных АА [192]. Однозначного объяснения полученным отличиям дать невозможно. В одной из процитированных работ [182] ММСК были получены из КМ детей, больных АА, во второй работе [162] использовали КМ взрослых больных. Нашей работе были проанализированы образцы КМ взрослых больных в возрасте от 16 до 60 лет (средний возраст 24,8±3,7 лет, медиана 22 года). Больные находились на разных стадиях лечения, также были пациенты до начала терапии. Среди больных были пациенты с заболеванием различной степени тяжести, а также РАА. Эффективность получения ММСК не зависела от вышеперечисленных факторов. Более того, анализ культур ММСК от больных АА, находившихся в момент взятия КМ на первом этапе течения болезни (до начала комбинированной ИСТ) и в период ремиссии не выявил отличий в суммарной клеточной продукции; ММСК больных РАА пролиферировали менее интенсивно. Также не было выявлено различий в суммарной клеточной продукции ММСК, полученных из КМ больных АА разной степени тяжести. Следовательно, тяжесть АА не влияет на физиологический статус ММСК больных АА. По всей вероятности, некоторую роль в повышении доли длительно пролиферирующих ММСК играет тот факт, что у больных АА снижена общая клеточность КМ за счет снижения количества кроветворных клеток [40; 117], в результате чего среди ядросодержащих клеток КМ, получаемых при пункции, возрастает доля стромальных клеток. Однако это не может быть единственным объяснением, так как ММСК, полученные из КМ больных, находящихся в ремиссии, также отличаются повышенной пролиферативной активностью. Более того, время до П0 также не отличается у культур, полученных из КМ больных АА, и у донорских. Время до П0 является косвенным показателем исходного количества ММСК, присутствовавших в образце КМ. Отсутствие отличий по данному показателю указывает на то, что количество ММСК в исходных образцах КМ не отличалось у доноров и больных АА. Итак, ММСК из КМ больных АА способны к более длительной пролиферации в культуре, по сравнению с ММСК, полученных от доноров КМ. Среди всех форм апластической анемии, исследованных в нашей работе, только ММСК больных РАА оказались не способны к длительной пролиферации.
Тот факт, что доля способных к длительному пассированию культур ММСК, полученных от больных, находящихся как в периоде ремиссии, так и в дебюте заболевания была сравнима, указывает на то, что изменения в строме связаны непосредственно с патогенезом заболевания, а также на то, что строма медленнее отвечает на успешную терапию, чем кроветворная ткань. Это согласуется с имеющимися представлениями о строме как медленно обновляющейся соединительной ткани [56].
При анализе способности ММСК больных АА к дифференцировке в жировом направлении было установлено, что не все полученные культуры ММСК способны к полноценной жировой дифференцировке. При этом тяжесть аплазии не влияет на способность ММСК к дифференцировке, а проведенная ИСТ, напротив, угнетает адипогенез. Уровень экспрессии IGF1 в недифференцированных ММСК не является прогностическим фактором успешности дифференцировки. Относительный уровень экспрессии гена PPARG в ММСК больных до индукции дифференцировки был недостоверно ниже, чем в донорских, и после индукции дифференцировки, в отличие от ММСК доноров, экспрессия этого гена также не повышалась. В мировой литературе имеются данные, что ММСК больных АА не отличаются от донорских по своему дифференцировочному потенциалу [72]. Вместе с тем показано, что дифференцированные ММСК больных АА имеют более крупные жировые капли, и их количество на клетку выше, чем в дифференцированных ММСК доноров; это сопровождается повышением относительного уровня экспрессии адипонектина и FAPB4 [393]. FAPB4 регулируется продуктом гена PPARG на ранних стадиях жировой дифференцировки [322]. Другие группы исследователей также указывает на повышенную способность к адипогенной дифференцировке в ММСК больных АА [89; 393], сопровождающуюся повышением экспрессии PPARG [422]. В целом, эти данные согласуются с многократно показанным повышением в КМ больных АА количества адипоцитов за счет угнетения остеогенеза [2; 89; 201; 280; 334]. Мы не обнаружили статистически достоверных отличий в уровне экспрессии гена PPARG ни при сравнении ММСК всей группы больных в целом, ни при раздельном сравнении в зависимости от тяжести заболевания или от его стадии. Выборка больных, проанализированная в нашем исследовании, отличалась от других исследований заметно большим размером и доминированием среди пациентов мужчин.
При анализе способности ММСК больных АА к остеогенной дифференцировке были выявлены отличия от доноров. Успешную дифференцировку удалось получить в сравнимом с донорскими количестве культур. Среди тех пациентов, чьи ММСК не ответили на индукцию дифференцировки, у 80% была диагностирована ТАА. В отличие от других авторов [89; 334; 393], в наших экспериментах не было отмечено затруднений в дифференцировке ММСК больных АА в остеогенном направлении (по окрашиванию ализариновым красным). В ММСК больных АА (в нашем исследовании это были мужчины) относительный уровень экспрессии щелочной фосфатазы оказался аналогичен таковому у доноров-женщин и был статистически достоверно выше, чем в ММСК доноров-мужчин как до, так и после индукции костной дифференцировки. В мировой литературе не удалось найти данных об экспрессии этого гена в ММСК больных АА. В любом случае, очевидно, что ММСК больных АА отвечают на индукцию костной дифференцировки заметным повышением экспрессии этого гена. Относительный уровень экспрессии другого индикатора остеогенной дифференцировки, гена PTHR, повышен в ММСК больных АА так же, как и в ММСК доноров-мужчин. Таким образом, при анализе экспрессии маркерных генов в ММСК больных АА не было выявлено снижения способности к костной дифференцировке. Это противоречит данным других исследователей [89; 201; 334]. В нашем исследовании, в отличие от большинства процитированных работ, анализировали ММСК от довольно большого числа больных с разной тяжестью заболевания и этапом лечения. При этом изменений, описанных другими авторами (снижение способности к костной дифференцировке за счет увеличения жировой), не было выявлено ни при анализе всей группы больных в целом, ни при разделении на подгруппы по тяжести заболевания или его стадии. Однако было выявлено ухудшение ответа ММСК от больных в период ремиссии на индукторы дифференцировки, что может являться побочным эффектом терапии, применявшейся для лечения АА.