Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности течения скрытой вирусной инфекции гепатита В (обзор литературы) 10-24
Глава 2. Материал и методы исследования 25-30
2.1. Характеристика обследованных лиц из группы высокого риска инфицирования (I группа). 25
2.2. Характеристика обследованных больных хроническим гепатитом и циррозом печени с латентной HBV-инфекцией (II группа) 26
2.3. Методы обследования больных 28
2.3.1. Клинические методы исследования. 28
2.3.2. Биохимические методы исследования. 28
2.3.3. Вирусологические методы исследования. 28
2.3.4. Инструментальные методы исследования 29
2.3.5. Иммунологические методы исследования 29
2.3.6. Пункционная биопсия. 29
2.3.7. Статистическая обработка. 30
Глава 3. Диагностическое значение igm анти-hbс при латентной вирусной инфекции в 31-36
Глава 4. Распространенность и особенности клинического значения латентной HBV-инфекции среди лиц из группы высокого риска инфицирования . 37-45
4.1. Распространенность латентной HBV-инфекции среди доноров крови. 37
4.2. Распространенность латентной HBV-инфекции среди медицинских работников 38
39 40
4.3. Распространенность латентной HBV-инфекции среди наркоманов .
4.4. Распространенность латентной HBV-инфекции среди беременных женщин.
4.5. Распространенность латентной HBV-инфекции среди лиц с ВИЧ инфекцией.
4.6. Современные возможности диагностики скрытой вирусной инфекции В у больных хроническими диффузными поражениями печени неизвестной этиологии
Глава 5. Особенности клинико–вирусологического, иммунологического и морфологического течения хронического гепатита со скрытой вирусной инфекцией в 46-54
5.1. Клинико-биохимическая характеристика латентной формы хронического гепатита В.
5.2. Морфологическая характеристика больных латентной формы хронического гепатита В.
5.3. Иммунологические особенности латентной HBV инфекции
5.4. Некоторые аспекты противовирусной терапии латентного (HBs-негативного) варианта хронического гепатита В
Глава 6. Заключение.
Выводы. 71
Практические рекомендации
- Методы обследования больных
- Инструментальные методы исследования
- Распространенность латентной HBV-инфекции среди медицинских работников
- Морфологическая характеристика больных латентной формы хронического гепатита В.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус гепатита В остается одним из основных этиологических факторов хронических диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Данная инфекция имеет широкое распространение по всему миру и является важнейшей проблемой современной ге-патологии. По данным ВОЗ, в мире число хронически инфицированных вирусом гепатита В (HBV) в 2000 г. достигло 400 млн человек, и ежегодно от хронических заболеваний печени, вызванных этим вирусом, умирает более 1 млн. человек. Распространенность HBV-инфекции в различных регионах мира варьирует от 2% до 8%. Россия относится к региону со средней степенью распространенности HBV (7%), в северной части России, особенно в Якутии и Тыве она достигает 10%, в Центрально-Азиатских странах - самая высокая (более 10%), например, в Таджикистане среди взрослого населения она составляет 13%. Самая низкая частота распространения этой инфекции наблюдается в Северной Америке и Западной Европе (до 1%).
До настоящего времени единственным антигеном вируса гепатита В, который служит маркером его диагностики, остается HBsAg. По этому антигену изучается распространенность вируса, проводятся скрининг доноров крови, судят об очищении организма от вируса и на его основе созданы современные вакцины против него.
В последние годы появился ряд научных сообщений, где подчеркивается, что иногда при отсутствии HBsAg в периферической крови возможно присутствие ДНК вируса в сыворотке крови и в ткани печени. Подобное состояние именуются как латентная (HBsAg-негативная), или скрытая, вирусная инфекция В.
По данным академика В.Т. Ивашкина и соавт. (2008), профессора Д.Т. Абдурахманова (2002), Г.К. Мироджов и соав. (2014) и наших исследований, наличие IgM анти-HBcAg в сыворотке крови свидетельствует не только о скрытой вирусной инфекции В, но и может служить показателем наличия ДНК вируса.
Использование современных высокочувствительных методов ПЦР-диагностики позволило идентифицировать репликативные формы вируса В и доказать размножение его в периферических мононуклеарных клетках, т.е.
возможность внепеченочной его репликации.
Несмотря на наличие небольшого количества исследований, посвященных скрытой (HBsAg-негативной) вирусной инфекции В, ее роль в развитии хронических диффузных поражений печени и гепатоцеллюлярной карциномы, вопросы ранней диагностики остаются еще недостаточно неизученными.
Целью работы является улучшение возможности диагностики и выявления роли латентной (HBsAg-негативной) инфекции в развитии хронических диффузных поражений печени (ХДПП) неизвестной этиологии.
Задачи исследования
-
Изучить диагностическое значение IgM-анти HBcAg при латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В.
-
Выявить частоту латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В среди лиц с высоким риском инфицирования в Таджикистане (доноры крови, наркоманы, медицинские работники, беременные женщины и лица с ВИЧ-инфекцией).
-
Изучить клинико-биохимические, вирусологические, иммунологические и морфологические особенности течения хронического гепатита и цирроза печени у больных с латентной (HBsAg-негативной) инфекцией.
-
Разработать алгоритм диагностики и лечения латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В у больных хроническими заболеваниями печени неизвестной этиологии.
Научная новизна
Впервые показано, что вирус гепатита В протекает латентно, при отсутствии основных его антигенов – HBsAg, HBeAg в периферической крови. Установлено, что в диагностике латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В важное значение имеет определение IgM анти-HBcAg (60%), которые появляются при локализации HВcAg в мембранах гепатоци-тов.
Впервые установлено, что латентная (HBsAg-негативная) вирусная инфекция гепатита В имеет внепеченочную локализацию – в периферических мононуклеарных клетках крови.
Установлено частое выявление латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В у лиц с высоким риском инфицирования.
Впервые разработан алгоритм диагностики и лечения хронического ге-4
патита латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В, предусматривающий определение IgM-анти HBcAg в периферической крови, ДНК вируса B в сыворотке крови, в периферических мононуклеарных клетках и в ткани печени.
Показано, что выявление латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В у больных хроническим гепатитом и циррозом печени вируса С и неизвестной этиологии позволяет значительно сократить количество подобных больных.
Практическая значимость работы
Установлено, что для диагностики латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В важное значение играет определение IgM-анти HВcAg в сыворотке крови у лиц с высоким риском инфицирования (доноры крови, медицинские работники, беременные женщины, наркоманы и ВИЧ-инфицированные), а также больные хроническими диффузными поражениями печени неизвестной этиологии.
Впервые разработан алгоритм диагностики латентной (HBsAg - негативной) вирусной инфекции гепатита В методом ПЦР. При отсутствии ДНК вируса в сыворотке крови необходимо ее определение в мононуклеарных клетках периферической крови, а при отрицательном результате - в биопта-тах печени.
Положения выносимые на защиту
-
Латентная (HBsAg-негативная) вирусная инфекция гепатита В протекает без наличия HBsAg в периферической крови.
-
В диагностике латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В важную роль играет определение IgM-анти HBcAg.
-
Важную диагностическую ценность в установлении латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В играет метод полиме-разной цепной реакции (ПЦР).
-
При отсутствии ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови необходимо провести исследование ПЦР в периферических мононуклеарных клеток крови, а при отрицательном результате - в пунктатах печени.
-
Латентная (HBsAg-негативная) вирусная инфекция широко распространена среди доноров крови, медицинских работников, наркоманов, ВИЧ – инфицированных, беременных женщин, а также больных хроническими
диффузными поражениями печени неизвестной этиологии.
-
Латентная форма (HBsAg-негативной) инфекции гепатита B у большинства больных характеризуется бессимптомным течением, иногда наблюдается незначительное увеличение размеров печени, цитолиз гепатоцитов, дисбаланс в цитокиновой регуляции иммунного ответа и минимальные морфологические изменения в ткани печени.
-
При хроническом латентном (HBsAg-негативном) гепатите наиболее эффективным противовирусным действием обладает сочетание энтекавира с пегилированным интерфероном.
Внедрение результатов исследования в практику
Важнейшие результаты диссертации по диагностике латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции гепатита В внедрены в работу клиники Института гастроэнтерологии Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан и в Научном центре крови Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканской научно-практической конференции Института гастроэнтерологии АН Республики Таджикистан (2009 г.), годичной конференции Таджикского Государственного медицинского института им. Абуали ибн Сино (2011 г.), Российских гастроэнтерологических неделях (2010–2014гг.), на Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Достижения современной гастроэнтерологии» ГУ «Институт гастроэнтерологии МЗ и СЗН Республики Таджикистан (2012, 2014 гг.) и на заседании Ученого совета ГУ «Институт гастроэнтерологии» Министерства здравоохранении и социальной защиты населения Республики Таджикистан (2015 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 3 – в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах и содержит 16 таблиц, 10 рисунков. Состоит из введения, главы обзора литературы, 4 глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 317 наименований, из них 94 на русском и 223 на иностранных языках.
Методы обследования больных
В настоящее время для выяснения механизма развития скрытой вирусной инфекции гепатита В широко используется данная экспериментальная модель [235]. При заражении вирусом лесных североамериканских сурков в минимальной дозе (103 вириона) вирус первоначально накапливается в лим-фоидных органах и длительное время может персистировать, затем в процесс вовлекается печень. Однако, при этом антигены вируса в периферическую кровь не поступают. Данная экспериментальная модель показывает возможную роль уровня виремии и иммунной системы в развитии латентной вирусной инфекции гепатита В.
Скрытая вирусная инфекция гепатита В имеет широкое распространение в различных регионах мира. При использовании ПЦР в реальном времени в Канаде частота скрытой вирусной инфекцией В среди больных, нуждающихся в гемодиализе, составила 3,8%. В Турции при использовании «гнездной ПЦР» число данных пациентов составило 36,4%. Среди наркоманов латентная вирусная инфекция гепатита В встречается у 45% больных, в то же время у пациентов с гемофилией достигает 51%. Подобное несоответствие зависит от многих причин, но главным является использование различных высокочувствительных методов выявления данной инфекции.
Естественно, латентная инфекция вируса гепатита В может быть источником развития трансфузионного гепатита у реципиентов [81]. Возникновение острого вирусного гепатита у лиц с пересадкой печени связано с реактивацией латентной инфекции гепатита В. Ряд авторов [191, 205] считают, что трансплантационный гепатит в основном развивается у лиц у которых в периферической крови обнаруживались антитела против HBcAg типа IgM. У больных с HBV-серонегативностью развития острого гепатита нужно скорее всего связать с другими причинами, может, со скрытой инфекцией гепатита В. Реактивация латентной вирусной инфекции гепатита В имеет множественные причины, которые главным образом подавляют иммунную систему. В настоящее время к группам риска относятся заболевания, при которых используется химиотерапия (онкологические) или антицитокиновые препараты (Инфлексимаб, Алемтузумаб, Ритуксимаб), либо сами вовлекают в процесс иммунную систему – патология костного мозга и печени [171, 185, 191]. В иммунной системе здорового организма существует механизм, контролирующий латентное течение HBV-инфекции. Данная гипотеза основана на двух главных аргументах. Во-первых, есть сведения, подтверждающие существование иммунологической памяти Т-лимфоцитов против антигенов HBV спустя многие годы после клинического разрешения острого гепатита B. Вероятно, это связано с тем, что при длительном течении латентной инфекции постоянно образуется некое неопределяемое количество антигенов, способных поддерживать эффективную антивирусную Т-лимфоцитарную реакцию [1, 40, 42, 185]. Во-вторых, в условиях иммуносупрессии может произойти реактивация скрытой HBV-инфекции с появлением типичного серологического профиля активной инфекции [37, 38]. Иными словами, при латентном течении инфекции существует своего рода баланс между вирусом и иммунной системой макроорганизма, и помимо цитотоксических T-лимфоцитов существенно ингибировать экспрессию HBV антигенов на посттранскрипционном уровне могут цитокины, синтезируемые в печени, например фактор некроза опухоли б (ФНОб) [40, 51, 78, 141, 185, 214].
Как дополнительный фактор, который мог бы отрицательно повлиять на репликацию HBV и экспрессию вирусных антигенов, рассматривают вмешательство других вирусов. Самая высокая распространенность латентной HBV-инфекции была обнаружена среди больных с HCV-инфекцией, и исследования in vitro ясно продемонстрировали, что HCV-инфекция существенно ингибирует репликацию HBV [236]. Кроме того, нельзя исключить, что невирусные инфекционные агенты также могли бы потенциально вызвать супрессию активности HBV. Недавние работы показали значительное ингиби-18 рование репликации HBV на модели трансгенных мышей, инфицированных Schistosoma mansoni [203, 257]. Так как в регулирование транскрипционной программы HBV вовлечено несколько специфических («печеночных») и неспецифических (общих) факторов организма, можно выдвинуть гипотезу, что супрессия HBV – потенциально обратимый результат внутриклеточных изменений, которые могут произойти благодаря коинфекции другими инфекционными агентами или цитокинам [48]. Важное значение в регулировании репликации и транскрипции HBV имеют эпигенетические механизмы. Рассмотрим механизм изменения структуры хроматина в связи с метилированием ДНК и деацетилированием гистонов. Тканеспецифичное метилирование цитозиновых остатков ДНК у млекопитающих осуществляется с помощью четырех ДНК-метилтрансфераз (Dnmts) – Dnmtl, Dnmt2, Dnmt3A и Dnmt3B. Dnmtl поддерживает специфический рисунок метилирования в митотически размножающихся клетках. После репликации две полуметилированные дочерние молекулы ДНК распознаются этим ферментом и конвертируются в полностью метилированные. Поддержка нужного статуса метилирования генома служит непременным условием нормального развития у мышей, а аберрантное метилирование связано с возникновением опухолей и аномалий развития у человека. В последние годы стало ясно, что механизм компактиза-ции-декомпактизации хроматина напрямую связан с репрессией-дерепрессией локализованных в нем генов. Показано, что к метилированной ДНК присоединяются белки, распознающие метилированные основания благодаря наличию в них особых метил-СрО-связывающихся доменов. Известны четыре вида таких белков – МеСР2, MBD1, MBD2 и MBD3. В частности, белок МеСР2 содержит домен, репрессирующий транскрипцию, который ассоциирует корепрессорный комплекс, содержащий репрессор транскрипции (mSin3 А) и деацетилазу гистонов (HDAC1). Деацетилирование гистонов, в частности Н4, является важным компонентом механизма репрессии. Оно ре-моделирует структуру хроматина, повышая степень его компактизации, что приводит к репрессии транскрипции [154].
Инструментальные методы исследования
Состояние клеточного звена иммунитета исследовали непрямым им-мунофлюоресцентным методом с использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам лимфоцитов человека – CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-супрессоры/цитотоксические), CD20 (В-лимфоциты), CD16 (NK-натуральные киллеры), CD95 (рецептор апоптоза), CD25 (рецептор к IL-2) под руководством заведующей лабораторией Рамаза-новой З.Д.
Гуморальное звено иммунитета - иммуноглобулины А, М, G в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Manchini. Использовали моноспецифические антисыворотки, изготовленные в Научно-исследовательском институте эпидемиологии им. Гамалея.
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) определяли с помощью ПЭГ-теста по методу V.Haskova (под руководством заведующей лабораторией к.м.н. Саттаровой М.И.). Метод основан на селективной преципитации комплексов антиген-антитело в растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ)-6000.
Морфологические методы исследования проводились в лаборатории морфологии ГУ «Институт гастроэнтерологии» под руководством заведующего лабораторией к.м.н. Одинаева Р.И.
Их проводили 48 больным по методу Х.Х. Мансурова и С.И. Кутчака (1964) иглой Вим Сильвермана. Биоптаты печени фиксировали в нейтральном формалине по Лили и проводили по спиртам возрастающей концентрации с последующей заливкой в парафин. Срезы печени окрашивали гематоксилин-эозином, пикофусцином по Ван Гизону, трихромом по Масону, орсеином по Шиката.
Для полуколичественной оценки гистологических изменений печени использовали гистологический индекс активности (ГИА) по методу Knodell et al. (1981) и гистологический индекс склероза (ГИС) по Desmet et al. (1980).
Цифровой материал полученных результатов обрабатывали стандартными методами вариационной статистики, включая корреляционный анализ, с помощью статистических пакетов программы Microsoft Excel 7. Данные представлены в виде M±m, где M - среднее значение величины, m - ее стандартные отклонения. Для достоверности различий между значениями использовали t-критерий Стьюдента (с использованием формул для сравнения двух групп с попарно-независимыми или попарно-зависимыми вариантами). ГЛАВА 3
Вирус гепатита B занимает доминирующее место среди всех заболеваний печени вирусной этиологии, является одной из наиболее важных проблем современной гепатологии. В настоящее время в мире насчитывается около 350 млн. носителей вируса гепатита В (ВГВ). В Таджикистане распространенность HBV-инфекции составляет 14% и имеет тенденцию к непрерывному росту.
По данному антигену проводились широкомасштабные исследования по распространенности неактивных носителей. На его основе создана вакцина против этого вируса. Все названное стало основанием для того, чтобы в 1976 году Блюмберг стал лауреатом Нобелевской премии.
Однако, в последние годы появились отдельные сообщения о том, что нередко у лиц с высоким риском инфицирования вирусом B и больных хроническими диффузными поражениями печени, у которых в периферической крови отсутствует HBsAg, выявляются анти-IgM HBcor и ДНК вируса. Эти пациенты рассматриваются, как лица с латентной HBV-инфекцией. Актуальность данной проблемы невозможно переоценить, так как латентная HBV-инфекция в значительной степени меняет наше представление о диагностике и профилактике вируса гепатита В. Более того, еще отсутствуют четкие критерии для проведения противовирусной терапии латентной инфекции. Данную проблему без преувеличения можно назвать проблемой века.
Нами проводились клинико-инструментальные, функциональные и морфологические исследования 38 больных хроническим гепатитом (ХГ) и 54 больных циррозом печени (ЦП) неизвестной этиологии. Наряду с определением HBsAg, HBeAg, анти-НСV всем больным с помощью метода ИФА определяли уровень IgM анти-HBc. Одновременно с этим у всех пациентов в периферической крови определяли уровень ДНК вируса В с помощью ПЦР.
У всех больных в периферической крови отсутствовали маркеры вирусов гепатита В и С, а в анамнезе отсутствовали факторы, указывающие на развитие ХГ и ЦП (алкоголь, лекарственные поражения и др.). В связи с этим данные пациенты были оценены, как больные ХГ и ЦП неизвестной этиологии. Для исключения латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции все больные были обследованы на наличие IgM анти-HBc. Из 38 больных ХГ у 16 в периферической крови обнаруживался IgM анти-HBc. Одновременно с этим у всех 16 пациентов в периферической крови выявлялся ДНК вируса В, что указывает на наличие латентной вирусной инфекции у этих пациентов. Из 54 больных ЦП, которые были обследованы на IgM анти-HBc, у 23 обнаруживались эти антитела в высоком титре. При проведении ПЦР у 14 больных ЦП была выявлена высокая, а у 9 – средняя виремия.
Диагностика латентной (HBsAg-негативной) вирусной инфекции В представляет большие трудности. В связи с этим для диагностики вируса гепатита В были использованы практически все известные его антигены и антитела в периферической крови – HBsAg, HBeAg, анти-HBsAg, анти-HBeAg, анти-HBcAg, а также в биоптатах печени - HBsAg, HBcAg (рис. 3). Антигенный состав вируса гепатита В
Одновременно с этим ДНК вируса гепатита В изучали методом ПЦР в сыворотке крови, в лимфоцитах и биоптатах печени.
У всех пациентов, которые были подвергнуты исследованию, в периферической крови отсутствовали не только HBsAg и антитела к нему, но и HBeAg и анти-HBeAg. Следует подчеркнуть тот факт, что в Республике Таджикистан преобладают HBeAg –негативные варианты хронических диффузных поражений печени, то есть преимущественно встречаются мутантные варианты вируса В.
Рис. 4. Вирус гепатита В в гепатоците. Вирус избегает иммунный надзор Единственным антигеном вируса гепатита В, который персистирует только в ядре печеночной клетки и нередко выходит в цитоплазму и располагается по ходу цитоплазматической мембраны, является HBcAg. В результате не только сенсибилизируются цитопатические лимфоциты, но и В-лимфоциты, которые синтезируют не только антитела типа IgG антиHBcAg , но и антитела IgM-антиHBcAg, которые свидетельствуют о наличии активной вирусной инфекции (рис. 4).
Распространенность латентной HBV-инфекции среди медицинских работников
Вирус гепатита В остается одним из основных этиологических факторов хронических диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Данная инфекция имеет широкое распространение по всему миру и является важнейшей проблемой современной гепатологии. По данным ВОЗ, в мире число хронически инфицированных вирусом гепатита В (HBV) в 2000 г. достигло 400 млн человек [1], и ежегодно от хронических заболеваний печени, вызванных этим вирусом, умирает более 1 млн. человек. Распространенность HBV-инфекции в различных регионах мира варьирует от 2% до 8%. Россия относится к региону со средней степенью распространенности HBV (7%), в северной части России, особенно в Якутии и Тыве она достигает 10%, в Центрально-Азиатских странах - самая высокая (более 10%), например, в Таджикистане среди взрослого населения она составляет 13%. Самая низкая частота распространения этой инфекции наблюдается в Северной Америке и Западной Европе (до 1%). До настоящего времени единственным антигеном вируса гепатита В, который служит маркером его диагностики, остается HBsAg. По этому антигену изучается распространенность вируса, проводится скрининг доноров крови, судят об очищении организма от вируса и на его основе созданы современные вакцины против него.
В последние годы появился ряд научных сообщений, где подчеркивается, что иногда при отсутствии HBsAg в периферической крови возможно присутствие ДНК вируса в сыворотке крови и в ткани печени. Подобное состояние именуются как латентная, или скрытая, вирусная инфекция В.
По данным академика В.Т. Ивашкина (2008), профессора Д.Т. Абдурах-манова (2002) и наших исследований, наличие IgM анти-HBcAg в сыворотке крови свидетельствует не только о скрытой вирусной инфекции В, но и может служить показателем наличия ДНК вируса.
Использование современных высокочувствительных методов ПЦР позволило идентифицировать репликативные формы вируса В и доказать размножение его в периферических мононуклеарных клетках, т.е. возможность внепеченочной его репликации.
Несмотря на достаточно большое количество исследований, посвященных скрытой вирусной инфекции В и ее роли в развитии хронических диффузных поражений печени и гепатоцеллюлярной карциномы, вопросы ранней диагностики остаются все еще недостаточно изученными.
На рисунке представлены результаты изучения IgM анти-HBc в сыворотке крови и ПЦР-диагностики ДНК вируса В в сыворотке крови, в периферических мононуклеарных клетках и биоптатах печени. Как видно, из 140 больных хроническим гепатитом неизвестной этиологии у 64 (45,7%) обнаруживались IgM анти-HBc, у 76 (54,2%) ДНК вируса В выявлялась в сыворотке крови, у 42 (30%) - в периферических мононуклеарных лимфоцитах у 15 (10,7%) - в биптатах печени. Из 170 больных циррозом печени неизвестной этиологии в стадии В по Чайлд-Пью IgM антиHBc наблюдались у 36 (21,7%). У 52 больных (30,5%) ДНК вируса идентифицировалась в сыворотке крови, у 14 (8,2%) - в периферических мононуклеарных клетках и у 8 (4,7%) -в биоптатах печени.
Следует отметить, что в биоптатах печени больных хроническим гепатитом умеренной активности со скрытой вирусной инфекцией В в основном преобладает особый вариант некроза гепатоцитов - апоптоз. Причем апоптоз гепатоцитов осуществляется цитотоксическими Т-лимфоцитами (Т-киллерами). При хроническом активном гепатите латентной вирусной инфекции В в основном преобладают ступенчатые некрозы, разрушающие пограничную пластинку.
Нами проводилось исследование цитокинов у больных хроническим гепатитом со скрытой вирусной инфекцией В. Было выяснено, что как при хроническом гепатите умеренной, так и выраженной активности наблюдается повышение всех интерлейкинов. Однако, наиболее достоверно повышается уровень интерлейкина-10, который может в определенной степени способствовать подавлению эндогенного интерферона и развитию скрытой инфекции В.
Снижение репликации вируса В может развиваться в результате суперинфекции вируса D, C или ВИЧ, эпигенетических механизмов, цитоки-нов, шистомы Манноза и злоупотребления алкогольными напитками.
Использование глюкокортикоидных гормонов в острой стадии вирусного гепатита может также способствовать развитию латентной вирусной инфекции В, а также активизировать репликацию этой инфекции.
Латентная вирусная инфекция В может стать причиной посттрансфузи-онного гепатита, инфицирования реципиентов донорских органов, особенно печени, и развития хронического гепатита, цирроза печени и гепатоцеллю-лярной карциномы.
Опасность HВsAg-негативного мутантного штамма латентной вирусной инфекции В заключается в том, что он может стать потенциальным источником заражения реципиентов крови и донорских органов, а также вакцина против HВsAg не обеспечивает иммунитет от HBsAg-негативного мутантного штамма (вакцин-ускользающий штамм).
В заключении необходимо отметить, что переливание крови и трансплантация органов от доноров с латентной вирусной инфекцией В может привести к инфицированию реципиентов. При скрининге доноров крови на вирус гепатита В следует исследовать наличие IgM анти-HBc, ДНК HBV в сыворотке крови, в периферических мононуклеарных клетках.
У больных с ВИЧ инфекцией в силу сходных с гепатитом В путей передачи часто определяются антитела anti-HBc класса IgM. В отсутствии поверхностного антигена (HВsAg), обычно считают, что у такого больного инфекция разрешилась, и вируса гепатита В (ВГВ) в крови нет. Это не всегда так. Современные молекулярные методики позволяют выявить ДНК ВГВ у некоторых таких пациентов. Подобную скрытую инфекцию ВГВ среди пациентов с ВИЧ изучала группа ученых из США. Результаты исследования опубликованы в Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome за 1 марта 2007 г.
У больных хроническим гепатитом и циррозом печени неизвестной этиологии необходимо провести исследование IgM анти-HBc, ДНК HBV в сыворотке крови, в периферических мононуклеарных клетках и даже в биоп-татах печени.
Морфологическая характеристика больных латентной формы хронического гепатита В.
Существенное значение имели результаты, полученные при одновременном исследовании крови и биоптатов печени методом ПЦР у 28 доноров с наличием анти-HCV. При этом в 46,4% случаев РНК HCV определялась и в крови, и в гепатобиоптатах; в 21,4% -только в крови; в 32,2% - только в гепатобиоптатах. Однако, между обнаружением РНК в крови и печеночной ткани не наблюдалось никакой взаимосвязи (r=-0,13; p=0,502). Необходимо отметить, что из 28 больных не было ни одного человека, у которого и в крови, и в ткани печени отсутствовала бы ДНК HВV. Анализируя представленные данные, можно заключить, что практически все лица с наличием НBсAg IgM и отсутствием жалоб являются инфицированными вирусом ГB и следует вести разговор о настоящей латентной HBV-инфекции. Кроме того, нужно отметить, что для вируса ГВ (в отличие от вируса ГС) существуют фазы интеграции, а возбудитель не всегда находится в состоянии репликации. При этом выполненная у 25 человек с латентной HCV-инфекцией в крови количественная ПЦР установила относительно низкую "вирусную нагрузку", которая колебалась в пределах от 214710 до 578000 копий ДНК в 1 мл, что свидетельствовало о невысокой ре-пликативной активности возбудителя. Необходимо отметить обнаруженную прямую достоверную корреляцию между наличием в крови анти-HBcore IgM и ДНК HВV (r=0,31; p 0,05). Это доказывало, что выявление в крови анти-HВcore IgM можно расценивать, как маркер вирусной репликации НBV. При изучении основных иммунологических показателей при латентной HBV-инфекции не было выявлено каких-либо изменений, за исключением повышения уровней неспецифических иммуноглобулинов, особенно IgM (2,12±0,12 г/л и 1,42±0,12 г/л, p 0,01 - при сравнении с группой здоровых лиц). При сравнительном анализе с группой здоровых лиц были выявлены статистически значимые различия по спонтанной продукции клетками крови ИЛ-8 (1818,5±299,2 пг/мл и 124,1±33,2 пг/мл; p 0,01), индуцированной про- дукции клетками крови ИЛ-1b (4201,5±607,7 пг/мл и 3055,9±363,5 пг/мл; p 0,05) и ИЛ-8 (6507,7±962,8 пг/мл и 2760,0±222,8 пг/мл; p 0,001), содержанию в сыворотке крови ИФН-a (38,8±9,5 МЕ/мл и 7,9±2,2 МЕ/мл; p 0,05). Эти результаты могли свидетельствовать о наличии антигенемии при латентной HВV-инфекции, процессинга антигена антиген-представляющими клетками, активации и стимуляции пролиферации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, моноцитов и дисбалансе в цитокиновой регуляции иммунного ответа. При морфологическом исследовании биоптатов печени признаки гепатита со слабо выраженной активностью были установлены в 42,0%, с минимальной активностью - в 43,8%, незначительные проявления вирусной инфекции (можно отнести к гепатиту с минимальной активностью) - в 11,8%. Лишь в 2,4% случаев не обнаруживались воспалительные изменения в ткани печени (компенсаторно-приспособительные и дистрофические процессы). Полученные данные еще в большей степени, чем при HBV-инфекции, ставят под сомнение такое заключение, как "носительство" HBV, доказывая, что у лиц с анти-HвсAG Ig M и отсутствием жалоб имеет место скрыто протекающий вирусный гепатит В. Необходимо отметить, что в 65,2% случаев выявлялся фиброз, как правило, слабо выраженный (портальный). Это подтверждало тот факт, что выявленный латентный гепатит имеет хроническое течение. В целом, с позиции морфолога и согласно составляющим ИГА Кноделя пациентов с латентной HBV-инфекцией можно было охарактеризовать, как больных хроническим гепатитом с минимальной или слабо выраженной активностью (2,45+0,18 балла) и слабым фиброзом (1,08±0,06 балла).
В процессе углубленного клинико-морфологического обследования пациентов с латентным течением ГВ в подавляющем большинстве случаев устанавливалось хроническое течение (92,3%). Проведенный корреляционный анализ не выявил никакой взаимосвязи между активностью вирусной репликации при количественном ПЦР-анализе, с одной стороны, и выраженностью цитолитического синдрома по уровню АлАТ (r=0,20; p 0,1), степенью активности патологического процесса в печени по ИГА Кноделя (r=0,23; p 0,1) и всем его составляющим, с другой стороны. Также не было установлено зависимости клинико-лабораторных и морфологических проявлений от генотипа вируса ГС. С одной стороны, это соответствует данным ряда исследований, а, с другой стороны, не согласуется с некоторыми из них [Silini E. и соавт., 1995; Zanella A. и соавт., 1995; Booth J.C. и соавт., 1997]. Однако, были установлены прямые достоверные корреляции между обнаружением ДНК HВV в крови и ткани печени, а также биохимическими и морфологическими изменениями. Ранее было отмечено отсутствие зависимости между выявлением ДНК в крови и печени, что не исключает возможности внепеченочной репликации вируса и подтверждается рядом публикаций [Фридлянд И.Ф. и соавт., 1999]. В этой связи важно отметить, что наличие ДНК в крови достоверно коррелировало с активностью патологического процесса за счет пери-портальных некрозов (r=0,25; p 0,05) и портальной инфильтрации (r=0,34; p 0,05), главным образом обусловливая иммуноопосредованный (аутоиммунный) механизм воспаления, и не было связано с внутридольковыми некрозами (r=0,05; p=0,51). В свою очередь, обнаружение ДНК в ткани печени значимо определяло появление внутридольковых некрозов (r=0,39; p 0,05), реализуя тем самым цитопатический механизм поражения, и не влияло на портальный компонент воспаления (r=0,06; p=0,792; r=0,07; p=0,734). Кроме того, повышение активности АлАТ в большей степени было обусловлено обнаружением ДНК в печени (r=0,58; p 0,001), чем в крови (r=0,36; p 0,05). В подтверждение зависимости цитолиза гепатоцитов от активности патологического процесса в печени сравнительный анализ у больных с нормальной и повышенной активностью АлАТ выявил достоверные различия по основным морфологическим параметрам, характеризующим активность воспаления в печени, в том числе и по ИГА Кноделя (0,9±0,21 балла и 2,3±0,19 балла, p 0,001) и всем его составляющим. Причем, в первую очередь, повышенная активность АлАТ определялась внутридольковым компонентом воспаления, что подтверждалось достоверной взаимосвязью с выраженностью внутридольковых некрозов (r=0,26; p 0,05). Несколько в меньшей степени цитолитический синдром зависел от портального компонента воспаления за счет перипортальных некрозов (r=0,21; p 0,05). Полученная зависимость цитолиза гепатоцитов от выраженности морфологических изменений не соответствует результатам некоторых исследований [Stanley A.J. и соавт., 1996; Puoti C. и соавт., 1997]. Вероятно, это связано с небольшой длительностью инфекционного процесса (иммуноопосредованные процессы не успевают развиться в должной степени).