Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16-45
Глава 2. Материал и методы исследования 46-72
2.1. Методики обследования и обзор клинических наблюдений 46-50
2.2. Материал и методы экспериментальных исследований 50-72
Глава 3. Туберкулёз лёгких с устойчивостью МБТ кизониазиду в сравнении с лекарственно-чувствительным и МЛУ туберкулёзом 73-90
Глава 4. Сравнительная эффективность лечения туберкулёза лёгких при устойчивости МБТ к изониазиду в сравнении с лекарственно-чувствительным и МЛУ туберкулёзом 91-101
Глава 5. Подавление роста изолятов возбудителя наночастицами серебра in vitro 102-131
5.1. Подавляющая активность изолированных наночастиц 102-110
5.2. Подавляющая активность нанокомпозита 110-116
5.3. Минимальная подавляющая и бактерицидная концентрации 116-126
5.4. Противотуберкулёзная активность наночастиц в обратных мицеллах 126-128
5.5. Атомно-силовая микроскопия МБТ при воздействии наночастиц 128-131
Глава 6. Безопасность применения наночастиц серебра 132-165
6.1. Токсичность наночастиц серебра 132-145
6.2. Токсичность нанокомпозита 146-158
6.3. Гистологическая оценка токсичности нанокомпозита 159-165
Глава 7. Химиотерапевтическая эффективность наночастиц серебра на модели туберкулёза у животных 166-189
7.1. Группы экспериментальных животных 166
7.2. Выживаемость животных 166-169
7.3. Динамика биометрических показателей 169-175
7.4. Бактериологическая оценка эффективности 175-182
7.5. Патоморфологичекие исследования 182-189
Заключение 190-202
Выводы 203-204
Практические рекомендации 205
Список литературы 206-255
- Методики обследования и обзор клинических наблюдений
- Сравнительная эффективность лечения туберкулёза лёгких при устойчивости МБТ к изониазиду в сравнении с лекарственно-чувствительным и МЛУ туберкулёзом
- Токсичность наночастиц серебра
- Патоморфологичекие исследования
Методики обследования и обзор клинических наблюдений
Ретроспективно изучено 650 историй болезни ВИЧ-отрицательных больных с деструктивным туберкулёзом лёгких и бактериовыделением. Все пациенты проходили лечение в 2009-2015 г.г. в ГБУЗ ЯО «ОКТБ». В зависимости от спектра ЛУ возбудителя больных разделили на три группы. Первую группу составили 214 больных с устойчивостью МБТ к изониазиду и другим препаратам при сохранённой чувствительности к рифампицину, вторую – 221 человек с МЛУ-ТБ, третью – 215 больных с сохранённой чувствительностью возбудителя ко всем химиопрепаратам. Возраст и пол больных во всех группах были сопоставимы.
Протоколы клинического, рентгенологического и лабораторного обследования соответствовали требованиям Федеральных клинических рекомендаций по диагностике и лечению туберкулёза органов дыхания. Лекарственную устойчивость возбудителя определяли с использованием плотных сред Ливенштейна-Йенсена и Финна методом абсолютных концентраций, в жидкой среде методом пропорций на автоматическом анализаторе «Bactec MGIT 960», а также методом ПЦР-диагностики в анализаторе «GeneXpert».
Выделяли следующие категории больных: 1) новые случаи химиотерапии у впервые выявленных больных или больных, получавших химиотерапию менее одного месяца; 2) случаи повторного лечения, включающие повторное лечение у хронических больных, после неэффективного курса химиотерапии или после прерывания лечения; 3) лечение по поводу рецидива заболевания. Впервые выявленных мужчин было 83,5%, женщин –16,5%, мужчин, получавших курсы повторной химиотерапии – 81,3%, женщин – 18,7%, лечившихся по поводу рецидива – мужчин 77,0%, женщин – 23,0%. В структуре наблюдаемых больных преобладали пациенты с инфильтративным (38,0%), диссеминированным (26,0%) и фиброзно-кавернозным туберкулёзом лёгких (21,4%).
Более чем у 70% пациентов интоксикационный и бронхопульмональный синдромы носили значительную и умеренную степень выраженности, что свидетельствует о тяжести клинической картины заболевания.
У 29,4% туберкулёзные изменения локализовались в обоих лёгких, у 19,5% – наблюдалось поражение целого лёгкого. Количество больных с поражением 1-2 долей составило 28,3%, у 22,8% процесс локализовался в пределах 1-2 сегментов. Большая доля обширных двухсторонних поражениях лёгких принадлежала фиброзно-кавернозному (46,6%) и диссеминированному туберкулёзу лёгких (31,4%). Множественные деструкции наблюдались у 64,6%, единичные у – 35,4%. Полости до 2 см отмечались у 19,5%, от 2 до 4 см – у 44,5%, более 4 см – у 36,0%.
Типы полостных образований лёгочной ткани представлены на рис. 2.1.1 – 1) начинающаяся деструкция – просветление в зоне инфильтративных изменений; 2) пневмониогенная каверна – отчётливое полостное образование в зоне инфильтрации, с размытым наружным и бугристым внутренним контуром; 3) эластическая каверны – полости с тонкими стенками и невыраженным перикавитарным фиброзом; 4) ригидная каверна – умеренное развитие фиброза в прилежащей к полости лёгочной ткани; 5) фиброзная полость – развитие выраженных фиброзных изменений в стенке деструкции и окружающей лёгочной ткани.
Оценка бактериовыделения проводилась по двум методам – люминесцентной микроскопии и посеву. Культура МБТ считалась чувствительной к критическим концентрациям химиопрепаратов, если в пробирке вырастало менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Оценка массивности бактериовыделения по методу посева соответствовала следующим градациям: скудное – рост от 1 до 20 колониеобразующих единиц (КОЕ), умеренное – рост от 21 до 100 КОЕ, обильное – рост более 100 КОЕ. Результаты люминесцентной микроскопии оценивали следующим образом: скудное – 10-99 кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в 100 полях зрения, умеренное – 1-10 КУМ в 1 поле зрения, обильное – более 10 КУМ в 1 поле зрения. При расхождении результатов микроскопии и посева учитывался максимальный результат.
Скудное бактериовыделение по данным люминесцентной микроскопии наблюдалось у 13,1%, умеренное – у 33,7%, обильное – у 53,2% больных. По данным метода посева скудное бактериовыделение наблюдалось лишь у 6,0%, умеренное – у 24,0%, обильное – у 70,0% больных.
Изучены спектры лекарственной устойчивости МБТ в группах больных, выделяющих резистентного возбудителя. В 1 группе спектры ЛУ МБТ были представлены 15 вариантами сочетаний химиопрепаратов, во 2 – они состояли из 45 сочетаний препаратов. Всего было изучено 537 ЛУ клинических изолятов возбудителя, полученных от больных 1 группы и 1291 изолят от больных 2-й группы.
Всем больным проводилась постановка пробы с аллергеном туберкулёзным рекомбинантным в стандартном разведении (Диаскинтест). У 8,2% больных в начале лечения проба имела гиперергический характер, у 59,4% - положительный, у 16,3% – была сомнительная, у 16,2%– отрицательная.
Все наблюдаемые больные были консультированы терапевтом.
Установлена следующая сопутствующая патология: хроническая обструктивная болезнь лёгких (56,8%), сахарный диабет (4,0%), заболевания сердечно-сосудистой системы (39,7%), гепатиты В и С (14,8%), заболевания желудочно-кишечного тракта (22,2%), патология гепатобиллиарной системы (19,8%), патология мочевыделительной системы (21,2%). Более 50% больных имели алкогольную зависимость, более 80% - никотиновую.
Лечение больных проводилось в соответствии с принятыми в РФ Федеральными клиническими рекомендациями и методическими рекомендациями по совершенствованию диагностики и лечения туберкулёза органов дыхания, утверждёнными приказом МЗ РФ № 951 от 29 декабря 2014 года. Коллапсотерапия применялась менее чем у 20% больных. Оценка эффективности лечения проводилась у тех больных, которые в соответствии с Федеральными клиническими рекомендациями и выбранным режимом химиотерапии получили необходимое количество суточных доз химиопрепаратов. Основными критериями эффективности лечения являлись прекращение бактериовыделения (абациллирование) и заживление деструктивных изменений в лёгких (закрытие каверны). Из 214 больных 1 группы для оценки эффективности лечения были отобраны 149 больных, в том числе, впервые выявленных – 52, с повторным лечением – 82 и с рецидивом – 15 больных. Из 221 больного 2 группы эффективность химиотерапии оценивалась у 112 пациентов, в том числе, 18 – впервые выявленных, 78 – с повторным лечением и 16 - с рецидивом заболевания. Из 215 больных 3 группы было отобрано 152 больных, в том числе, 115 – впервые выявленных, 25 – с повторным лечением и 12 – с рецидивами.
При статистической обработке материала рассчитывали среднее значение показателя и величину средней ошибки. Статистическую достоверность показателей оценивали с помощью коэффициента достоверности Стьюдента, рассчитываемого по формуле: t=M1-M2/m1+m2, где М – значения показателей, m – стандартная ошибка, считая разницу достоверной при вероятности 95% и более (р 0,05). Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft Excel 2007 и статистической компьютерной программы «Биостатика».
Сравнительная эффективность лечения туберкулёза лёгких при устойчивости МБТ к изониазиду в сравнении с лекарственно-чувствительным и МЛУ туберкулёзом
Как видно из таблицы 4.1, максимальная эффективность лечения по данным люминесцентной микроскопии наблюдалась у больных 3 группы с сохранённой чувствительностью возбудителя – 70,4%, минимальная – при МЛУ-МБТ во 2 группе – 44,6%. Разница показателей между 1 – 2 и 3 – 2 группами статистически достоверна (р 0,05), между 1 – 3 группами статистической достоверности по данным люминесцентной микроскопии нет (р 0,05). Наиболее высокие темпы абациллирования отмечались в 3 группе. К 4 месяцам лечения в этой группе прекращение бактериовыделения наблюдалось у 48,7%больных, при этом в 1 группе к этому сроку показатель составил 36,9%, во 2 –16,1%. Динамика абациллирования по данным люминесцентной микроскопии представлена в диаграмме на рис. 4.1.
Динамика абациллирования по данным метода посева повторяет графический профиль показателей, полученных методом люминесцентной микроскопии (рис. 4.2). По данным метода посева отмечается статистическая разница показателей между 3 – 1, 3 – 2 , 1 – 2 группами (р 0,05).
Определённый интерес представляет динамика показателей прекращения бактериовыделения у больных различных категорий. Результаты абациллирования у впервые выявленных больных по данным метода посева представлены в диаграмме на рис. 4.3.
Как следует из представленных на рис. 4.3 данных, несмотря на более высокий показатель в 1 группе, разница между больными 1 – 2 групп не является статистически значимой (р 0,05). Очевидно, этот факт объясняется характером спектров лекарственной устойчивости МБТ к небольшому количеству химиопрепаратов у впервые выявленных больных этих групп. Разница показателей между 3 – 2 группами имеет статистическое различие (р 0,05). Таким образом, у впервые выявленных больных устойчивость к изониазиду снижает эффективность лечения по критерию абациллирования в сравнении с лекарственно-чувствительным туберкулёзом на 20,4% и сближает показатель с результатом прекращения бактериовыделения у больных с МЛУ-ТБ, соответственно – 57,7% и 50,0% (р 0,05).
Динамика показателей абациллирования больных с повторным лечением представлена в диаграмме на рис. 4.4. Разница показателей между 3 – 2, 3 – 1 группами статистически достоверна (р 0,05). Между показателями 1 – 2 группами разница показателей не имеет статистической значимости (р 0,05). Следует отметить замедленную динамику абациллирования в группе МЛУ-ТБ. Существенный прирост показателей во 2 группе наблюдается к 6 и 8 мес. химиотерапии, что отражает, как показали исследования, коррекцию режимов лечения с включением бедаквилина, линезолида, использованием методов коллапсотерапии.
Таким образом, устойчивость МБТ к изониазиду среди больных с повторным лечением снижает эффективность химиотерапии по сравнению с лекарственно-чувствительным туберкулёзом на 14,9%, вместе с тем, на 13,0% превышает аналогичный показатель у больных с МЛУ-МБТ. Результаты абациллирования по данным метода посева у больных с рецидивами представлены в диаграмме на рис. 4.5.
Малая выборка больных с рецидивами не позволяет делать статистически значимые заключения. Вместе с тем, тенденция динамики показателей у больных с рецидивами аналогична ранее рассмотренным группам. Показатели пациентов с устойчивостью возбудителя к изониазиду занимают промежуточное положение между лекарственно-чувствительным и МЛУ туберкулёзом.
Эффективность лечения по критерию заживления деструкций лёгочной ткани
Показатели закрытия полостей деструкции у больных 1 группы представлены в таблице 4.3. Из табл. 4.3 следует, что наиболее высокий показатель закрытия полостей в 1 группе больных отмечается при инфильтративном – 48,1% и диссеминированном туберкулёзе – 41,7%. При кавернозном туберкулёзе и туберкуломе небольшое количество наблюдений не позволяет делать статистически значимые заключения. Заживление деструкций у 4 из 8 больных с туберкуломой (50,0%) как правило носило характер заполнения полости. У 1 больного из 23 с фиброзно-кавернозным туберкулёзом лёгких наблюдалось заживление деструкции. Этому способствовало относительно умеренное развитие перикавитарного фиброза (гипердиагностика фиброзно-кавернозного туберкулёза), а также использование в лечении адекватной химиотерапии, применение коллапсотерапии и регионарного введения фторхинолонов. Использование этих же методов лечения позволило добиться заживления деструкций у 2 больных из 10 (20,0%) с казеозной пневмонией. Несмотря на полученные результаты, следует отметить недостаточно высокие показатели заживления деструкций у больных 1 группы (38,3%) учитывая то, что ригидный и фиброзный характер полостей имелся лишь у 32,8% больных и предполагаемый потенциал консервативного заживления полостей мог составить не менее 65%.
Показатели закрытия полостей деструкции у больных 2 группы представлены в табл. 4.4
Токсичность наночастиц серебра
Внутрижелудочное введение раствора НЧС белым мышам в дозах 3000; 5000 и 10000 мкг/кг не вызывало изменений в поведении животных. Гибели животных не отмечалось. Отставания прибавки массы тела по сравнению с контрольными животными не было. Гибели животных не отмечалось (табл. 6.1.1)
Наблюдения за животными в течение 14 суток не выявили у них признаков интоксикации, при этом физиологические функции оставались в пределах нормы и не отличались от животных контрольной группы.
При остром внутрижелудочном введении раствора НЧС в дозе 100 мг не было отмечено изменений функции ЦНС по методике «открытого поля» (табл. 6.1.2.).
Таким образом, LD50 изучаемого раствора НЧС при однократном внутрижелудочном введении будет составлять более 10000 мкг/кг массы тела животного. В соответствии с установленными параметрами пероральной токсичности (ГОСТ 12.1.007-76) изучаемый раствор НЧС относится к 4 классу опасности (малоопасные соединения).
Острая токсичность при внутрибрюшинном введении.
При внутрибрюшинном введении НЧС в дозах 600; 1000 и 2000 мкг/кг гибели животных не наблюдалось (табл. 6.1.3).
На протяжении 14 дней опыта гибели животных не наблюдалось. Также не отмечалось изменений в физиологическом состоянии и поведении животных. После выведения животных из опыта, гистологическое исследование не выявило изменений во внутренних органах. Таким образом, LD50 изучаемого раствора НЧС при внутрибрюшинном введения составляет более 2000 мкг/кг массы тела.
Острая токсичность при внутривенном введении.
Наблюдение в течение 14 дней после внутривенного введения НЧС в дозах 600, 1000 и 2000 мкг/кг не выявило отклонений в поведении и общем состоянии животных. Гибели крыс не наблюдалось (табл. 6. 1.4).
При макроскопической оценке и гистологическом изучении внутренних органов животных после выведения их из опыта не отмечалось отклонений по сравнению с контрольными животными. Таким образом, LD50 изучаемого раствора НЧС при внутривенном введении составляет более 2000 мкг/кг массы тела животного.
Острая токсичность при нанесении на кожу
Накожное применение раствора НЧС в дозе 1000 и 2000 мкг/кг не сопровождалось изменениями общего состояния и физиологических функций. На кожном окне отсутствовали признаки раздражения и повреждения. Гибели животных не отмечалось. На основании полученных результатов можно заключить, что LD50 изучаемого раствора НЧС при нанесении на кожу составляет более 2000 мкг/кг массы тела животного. По гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76) в соответствии с установленными параметрами для накожной токсичности раствор НЧС относится к 4 классу опасности (малоопасные).
Подострая токсичность при внутримышечном введении Внутримышечное введение растворов НЧС в дозах 50, 100, 250 и 500 мкг/кг на протяжении 30 дней не вызывало изменений в состоянии и поведении животных. Гибели животных не наблюдалось. Двигательная активность крыс по сравнению с контрольной группой не менялась. Внешний вид и физиологические показатели животных не отличались от контрольной группы. Динамика массы тела крыс в сравнении с контрольной группой представлена в таблицах 6.1.5 и 6.1.6.
Из данных таблиц 6.1.5 и 6.1.6 следует, что у животных всех подопытных групп наблюдалась положительная динамика массы тела, при этом не выявлено достоверно значимых отличий от показателей контрольной группы (р 0,05).
Показатели гемограммы экспериментальных животных после 30-дневной внутримышечной затравки НЧС представлены в таблицах 6.1.7 и 6.8.
Как видно из таблиц 6.1.7 и 6.1.8, гематологические показатели у животных экспериментальных групп находились в пределах физиологической нормы и достоверно не отличались от контрольной (р 0,05).
Биохимические показатели крови крыс при изучении подострой токсичности НЧС представлены в таблицах 6.1.9 и 6.1.10.
Из таблиц 6.1.9 и 6.1.10 следует, что биохимические показатели у животных исследуемых групп статистически не отличались от контрольной группы (р 0,05). Показатели выделительной функции почек у 15 крыс-самцов, получавших дозы НЧС 50 и 500 мкг/кг представлены в таблице 6.1.11.
Как следует из таблицы 6.1.11, НЧС не оказывали влияния на выделительную функцию почек (р 0,05).
Исследование функции ЦНС крыс по методике «открытого поля» при затравке НЧС в дозе 100 мкг/кг в течение 21 дня не выявило у животных функциональных отклонений (табл. 6.1.12).
Исследование адаптивной возможности крыс к нагрузкам при плавании с грузом при внутримышечном введении НЧС в дозе 100 мкг/кг на протяжении 21 дня не выявило разницы в мышечной выносливости животных опытной и контрольной групп (табл. 6.1.13).
Хроническая токсичность при внутримышечном введении.
Внутримышечная затравка крыс растворами НЧС в дозах 50, 100, 250 и 500 мкг/кг ежедневно в течении 7 месяцев не вызывала существенных изменений в состоянии и поведении животных. Гибели подопытных животных не наблюдалось. Внешний вид и физиологические показатели подопытных животных при всех изучаемых концентрациях наночастиц серебра не отличался от контрольной группы. Динамика массы тела животных представлена в таблицах 6.1.14 и 6.1.15.
Патоморфологичекие исследования
Изучалась гистологическая структура лёгких, печени, почек и селезёнки животных. При макро- и микроскопической оценке органов незаражённых мышей (контроль-А) отклонений в гистологической структуре тканей не обнаружено. У животных контрольной группы «Б» (заражённые не леченые) в лёгочной ткани определялось значительное количество инфильтративных изменений. Сливной характер инфильтрации наблюдался у 9 (90%) животных (табл. 7.5.2).
У всех мышей отмечалось выраженное снижение воздушности лёгочной ткани. В альвеолах определялись явления серозной и фибринозной экссудации. В периваскулярной зоне фиксировались крупные лимфогистиоцитарные инфильтраты. В тоже время, перибронхиальные отделы были свободны от лимфогистиоцитарных скоплений. В составе инфильтратов наблюдались лимфоциты, эпителиоидные клетки, крупные макрофаги (клетки типа Пирогова-Лангханса), нейтрофильные гранулоциты. В подавляющем большинстве случаев (у 9 животных из 10) отмечались выраженные скопления нейтрофильных лейкоцитов с формированием детрита и участков казеозного некроза (табл. 7.5.3). Наличие нейтрофильных гранулоцитов свидетельствовало о превалировании альтеративного воспаления с прогрессированием туберкулёзного процесса. Использование в лечении изониазида (контрольная группа «В») способствовало некоторому уменьшению распространённости специфического воспаления. Зоны инфильтративных изменений имели тенденцию к фрагментации и располагались отдельными очагами, расположенными чаще периваскулярно и перибронхиально. Сливные инфильтративные изменения наблюдались в этой группе у 6 мышей (60%), у 4 животных инфильтрация имела очаговый характер с относительно чёткими границами, при этом лимфоциты располагались вокруг единичных эпителиоидных клеток или их скоплений. Таким образом, намечалось формирование лимфоидно-клеточных и эпителиоидно-клеточных гранулём. Лимфоидные гранулёмы отмечены у 2 животных (20%), эпителиоидные – у 1 (10%). В зонах специфической инфильтрации альвеолы и межальвеолярные перегородки были инфильтрированы лимфоцитами, клетками Пирогова – Лангханса, эпителиоидными клетками и их скоплениями. Таким образом, несмотря на лекарственную устойчивость возбудителя, использование изониазида в высоких дозах способствовало некоторому снижению интенсивности воспалительных изменений. Характер патоморфологических изменений в лёгких мышей при монотерапии изониазидом представлен на рис. 7.5.7 – 7.5.12.
В 1 опытной группе при использовании НЧС так же отмечалось некоторое уменьшение распространённости зон специфического воспаления. Сливные инфильтративные изменения зафиксированы у 12 животных (60%), у 8 мышей инфильтрация имела очаговый характер. Экссудативные изменения с выраженным снижением воздушности лёгочной ткани имели место у 15 животных (75%), в 6 случаях наблюдалось формирование отдельных гранулём. В 4 наблюдениях гранулёмы имели макрофагально-лимфоцитарный состав, у 2 животных наблюдались эпителиоидные гранулёмы. Полученные результаты дают основания говорить о бактериостатическом действии НЧС.
Как показали гистологические исследования, использование НК способствовало дальнейшему уменьшению распространённости специфических воспалительных изменений в лёгочной ткани животных. Выраженное снижение воздушности лёгочной ткани отмечалось у 6 животных (30%). Сливные инфильтративные изменения зафиксированы у 1 мыши (5%), у 7 животных инфильтрация носила крупно- и среднеочаговый характер, у 12 – мелкоочаговый. В 9 случаях наблюдались множественные гранулёмы, у 7 животных – отдельные гранулёмы. Нейтрофильные гранулоциты у животных этой группы в гистологических препаратах не встречались. В гранулёмах в значительном количестве наблюдались макрофагально-эпителиоидные элементы, клетки типа Пирогова-Лангханса. Эпителиоидные гранулёмы при лечении нанокомпозитом наблюдались у 11 животных (55%), лимфоидные – у 5 (25%). Преобладание эпителиоидных клеток, многоядерных гигантских клеток Пирогова-Лангханса отражает преимущественно продуктивный тип тканевой реакции и свидетельствует о положительной динамике течения воспалительного процесса. Патоморфологические изменения в лёгких мышей, получавших лечение НК представлены в иллюстрациях на рис. 7.5.13 – 7.5.18.
Таким образом, наиболее выраженная положительная динамика в гистологической картине наблюдалась у животных при использовании в лечении НК. Отмечалось уменьшение распространённости воспалительных изменений и преобладание продуктивных тканевых реакций. Результаты гистологического исследования подтверждают эффективность применения наночастиц серебра в лечении экспериментального туберкулёза и не исключают потенцирования изониазида.