Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Структурно-функциональная организация дыхательного центра 11
1.2 Структура и физиологическая роль лептина 26
1.3 Респираторная активность лептина, орексигенных и анорексигенных пептидов 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 40
2.1. Операционная подготовка 40
2.2. Микроинъекции пептида лептина в структуры мозга 41
2.3. Регистрация паттерна дыхания крысы 42
2.4. Регистрация биоэлектрической активности инспираторных мышц 43
2.5. Исследование инспираторно-тормозящего рефлекса Геринга-Брейера 44
2.6. Методика исследования вентиляторной реакции на гиперкапнию 45
2.7. Статистическая обработка данных 46
2.8. Вещества, использованные в работе 47
ГЛАВА 3. Реакции внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц на микроинъекции лептина в различные функционально-специфические отделы дыхательного центра 48
3.1. Реакции на микроинъекции лептина в область ядра солитарного тракта. 48
3.2. Реакции на микроинъекции лептина в каудальный отдел вентральной дыхательной группы 74
3.3. Реакции на микроинъекции лептина в ростральный отдел вентральной дыхательной группы 80
3.4. Реакции на микроинъекции лептина в область комплекса пре-Бетцингера 92
3.5. Реакции на микроинъекции лептина в комплекс Бетцингера 116
ГЛАВА 4. Влияние микроинъекций лептина в ядро солитарного тракта на инспираторно-тормозящий рефлекс Геринга-Брейера 117
ГЛАВА 5. Влияние микроинъекций лептина в ядро солитарного
тракта на вентиляторную чувствительность к гиперкапнии 122
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 129
Выводы 144
Список использованных источников и
Литературы 146
- Структурно-функциональная организация дыхательного центра
- Структура и физиологическая роль лептина
- Микроинъекции пептида лептина в структуры мозга
- Реакции на микроинъекции лептина в область ядра солитарного тракта.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Физиологическая и нейрохимическая организация центральной регуляции дыхания остается одной из актуальных проблем физиологии (Сергиевский, 1950; Cohen, 1979; Richter., 1996; Пятин и соавт., 1998; Johnson et al., 2001; DelNegro et al., 2002; Bongianni et al., 2002; Onimaru et al., 2003; Попов., 2003; Якунин., 2003; Александрова, 2004; Меркулова и соавт., 2004; Миняев и соавт., 2004; Бреслав, Ноздрачев., 2005; Инюшкин, 2006; Сафонов, 2007).
В настоящее время пристальное внимание уделяется исследованию нейрохимического обеспечения булъбарных механизмов регуляции дыхания. Это объясняется тем, что полученные в последнее время данные подтвердили непосредственное участие многочисленных нейромедиаторов и нейромодуляторов в реализации сложных функциональных взаимодействий между различными типами нейронов дыхательного центра, в анализе и синтезе поступающей туда афферентной информации, в процессах формирования адекватных параметров моторного респираторного драйва (Lonergan et al., 2003; Liu et al., 2004; Wu et al., 2004; Inyushkin, 2005, 2006). В рамках проблемы нейрохимических механизмов регуляции дыхания особый интерес представляет изучение регуляторных пептидов, в частности, их участия в генерации дыхательного ритма и регуляции паттерна дыхания (Bayliss et al., 1994; Bianchi et al., 1995; Schmid et al., 1996; McCrimmon et al., 1997; Haji et al., 2000; Инюшкин, 2003; Mellen et al., 2003). Иммуногистохимические и ауторадиографические исследования показывают высокую концентрацию различных пептидов и плотность их специфических рецепторов в различных ядрах дыхательного центра, что свидетельствует о непосредственном участии эндогенных пептидов в деятельности дыхательного центра (Инюшкин, 2003). Приоритетность проблемы пептидергических механизмов регуляции дыхания определяется широким представительством пептидергических структур в центральной нервной системе, участием пептидов в регуляции многих
5 физиологических функций, в том числе и дыхания, а также перспективностью использования веществ данной группы, их аналогов и антагонистов в медицинской практике (Ашмарин и соавт., 1988; Гомазков, 1995; Ашмарин и соавт., 1999).
Одним из наиболее значимых событий в современной физиологии явилось открытие регуляторного полипептида лептина (Zhang et aL, 1994). Установлено, что данный пептид продуцируется клетками жировой ткани и принимает активное участие в центральных механизмах регуляции жирового обмена, аппетита, количества принимаемой пищи и веса тела (Schwartz et al., 1996), а также в циркадианной модуляции физиологических функций, оказывая непосредственное влияние на уровень активности и спайковое кодирование информации нейронами супрахиазматического ядра (Inyushkin, Dyball, 2004). Установлено, что лептин, свободно проникая через гематоэнцефалический барьер, связывается со специфическими рецепторами в различных структурах центральной нервной системы (Schwartz et al., 1996). Следует особо подчеркнуть, что сравнительно высокая концентрация специфических рецепторов к лептину выявлена в структурах бульварного дыхательного центра, особенно в ядре солитарного тракта (Mercer et al., 1998; Hosoi et al., 2002), что указывает на возможность участия лептина в центральных механизмах регуляции дыхания на уровне этих структур. Однако, значение лептина в регуляции деятельности дыхательного центра до настоящего времени практически не изучалось. Несмотря на то, что ранее в единичных работах было продемонстрировано наличие дыхательных эффектов лептина при его внутрибрюшинном введении (Tankesley et al., 1998; O'Donell et al., 1999), механизмы центральной респираторной активности данного пептида остаются совершенно неисследованными. Это определило цели и задачи настоящего исследования.
6 Цель и задачи исследования: целью работы явилось изучение роли и физиологических механизмов участия лептина в центральной регуляции дыхания.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ респираторных эффектов лептина при
его локальном введении в различные функционально-специфические отделы
дыхательного центра. Выявить отделы дыхательного центра, играющие
наиболее важную роль в реализации респираторных эффектов лептина.
Выяснить характер респираторных реакций на микроинъекции растворов лептина в широком диапазоне концентраций в ядро солитарного тракта - область максимальной концентрации лептиновых рецепторов в стволе мозга.
Изучить роль лептина в реализации инспираторно-тормозящего рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта.
4. Исследовать влияние микроинъекций лептина в ядро солитарного тракта
на вентиляторную чувствительность к гиперкапнии
5. Выяснить особенности респираторных реакций на микроинъекции
лептина в комплекс пре-Бётцингера - важнейший ритмогенерирующий отдел
дыхательного центра и оценить потенциальную возможность участия лептина в
механизмах дыхательного ритмогенеза.
6. Оценить роль и возможные механизмы участия вентральной
дыхательной группы и комплекса Бетцингера в опосредовании центральной
респираторной активности лептина.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые проведено сравнительное исследование респираторных эффектов, возникающих при локальном воздействии широкого диапазона концентраций лептина на различные отделы дыхательного центра и доказано непосредственное участие этого пептида в центральных механизмах регуляции дыхания.
7 Показано, что респираторные эффекты лептина реализуются главным образом на уровне трех отделов дыхательного центра: дорсальной дыхательной группы, комплекса пре-Бетцингера и рострального отдела вентральной дыхательной группы. При этом установлено, что конкретные особенности дыхательных реакций определяются не только концентрацией лептина, но и функциональными свойствами отдела дыхательного центра, подвергающегося воздействию. В частности, впервые продемонстрировано, что локальное воздействие лептина на ядро солитарного тракта и область локализации вентральной дыхательной группы оказывает преимущественное влияние на механизмы регуляции объемных параметров паттерна дыхания, при микроинъекциях лептина в комплекс пре-Бетцингера главным образом затрагивается ритмогенерирующая функция дыхательного центра.
Впервые экспериментально раскрыты механизмы центральной респираторной активности лептина на уровне ядра солитарного тракта. В частности, получены приоритетные данные о модуляции лептином специфической афферентапии, поступающей в данную область от рецепторов растяжения легких. Доказано, что рост глубины дыхания при микроинъекции лептина в дорсальный отдел дыхательного центра обусловлен ингибирующим влиянием на инспираторно-тормозящий рефлекс Геринга-Брейера. Кроме этого, получены новые данные о способности лептина модулировать функцию центральных хемочувствительных структур ядра солитарного тракта. Установлено, что локальное воздействие лептина на данную область вызывает стимуляцию вентиляторной чувствительности к гиперкапнии. Полученные данные дают основания предполагать, что в основе этого эффекта лежит непосредственное влияние пептида на расположенные в дорсальном отделе дыхательного центра хемочувствительные нейроны.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные сведения о характере и особенностях реакций внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц на микроинъекции лептина в различные
функционально-специфические структуры дыхательного центра, изучение влияния лептина на инспираторно-тормозящий рефлекс Геринга-Брёйера в условиях микроинъекции лептина в ядро солитарного тракта, анализ влияния лептина на вентиляторную чувствительность к гиперкапнии при воздействии данного пептида на хемочувствительные нейроны ядра солитарного тракта, имеют существенное значение являются основополагающими для обоснования теоретических представлений об участии нового эндогенного регуляторного пептида лептина в регуляции дыхания.
Данные о роли и конкретных механизмах участия лептина в деятельности дыхательного центра важны для понимания нейрохимических закономерностей респираторного ритмогенеза и регуляции паттерна дыхания.
Учитывая, что лептину принадлежит ведущая роль в регуляции жирового обмена, настоящая работа имеет важное практическое значение для нейрофармакологии и медицины в плане разработки новых методов коррекции дыхательных нарушений, при формах ожирения, обусловленных недостатком лептина или нарушением процессинга лептиновых рецепторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Микроинъекции 10'10 - 10"4 М лептина в различные функционально-специфические отделы дыхательного центра вызывают реакции паттерна дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц. Характер реакций определяется как действующей концентрацией лептина, так и функциональными свойствами отдела дыхательного центра, подвергающегося воздействию. Наиболее важную роль среди структур дыхательного центра в реализации респираторных эффектов лептина играют ядро солитарного тракта, комплекс пре-Бетцингера и ростральный отдел вентральной дыхательной группы.
Микроинъекции растворов лептина в широком диапазоне концентраций в ядро солитарного тракта вызывает выраженные изменения объемных показателей дыхания и амплитуды осцилляции в залпах активности
9 инспираторных мышц. При концентрации 10"6 М наблюдалось изменение частоты дыхательных движений.
Важным механизмом реализации респираторных эффектов лептина на уровне дорсальной дыхательной группы является повышение этим пептидом чувствительности нейронов ядра солитарного тракта к специфической механоафферентации, поступающей по блуждающим нервам, что проявляется в угнетении инспираторно-тормозящего рефлекса Геринга-Брейера.
Лептин способен модулировать уровень центрального респираторного хемочувствительного драйва на уровне ядра солитарного тракта и, таким образом, повышать выраженность вентиляторного ответа на гиперкапнию.
Микроинъекции лептина в широком диапазоне концентраций в комплекс пре-Бетцингера вызывают значительное увеличение частоты дыхания. Концентрация 10"4 М лептина параллельно вызывала уменьшение дыхательного объема и биоэлектрической активности инспираторных мышц. Это может указывать на способность комплекса пре-Бетцингера принимать участие в механизмах респираторного ритмогенеза.
Микроинъекции лептина в ростральный отдел вентральной дыхательной группы вызывают угнетение дыхательных реакций только при концентрациях 10"6 - 10"4 М; микроинъекции лептина в каудальный отдел вентральной дыхательной группы вызывают угнетение дыхательных реакций только при концентрациях 10"4 М. Микроинъекции лептина в комплекс Бетцингера не вызывают изменений дыхательных реакций.
Аппробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены:
на XI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004);
на первой конференции молодых ученых Поволжья «Актуальные проблемы экологии Волжского бассейна» (Тольятти, 2007);
на X Всероссийской школе-семинаре с международным участием «Экспериментальная и клиническая физиология дыхания» (Репино, 2007);
10 на XXX, XXXI, ХХХП научных конференциях молодых ученых и специалистов Самарского Государственного Университета (Самара, 2005, 2006,2007).
Структурно-функциональная организация дыхательного центра
Проблема центральной регуляции дыхания привлекала к себе внимание исследователей на протяжении всей истории развития физиологии. Один из аспектов этой проблемы - локализация и функциональная организация дыхательного центра является предметом интенсивного изучения
К настоящему времени благодаря исследованиям многих поколений ученых различных стран общепринятым стало положение о том, что ведущая роль в регуляции дыхания принадлежит структурам бульбарного дыхательного центра. (Сергиевский, 1950; Cohen, 1979; Бреслав И.С., Глебовский В.Д., 1981; Richter et al, 1986,1996; von Euler, 1986; Feldman, 1986; Ezure, 1990; Richter et al., 1996; Инюшкин A..H., 1998; Александров и соавт.,1998; Пятин и соавт., 1998; Haji et al, 2000; Попов и соавт., 2003; Якунин и соавт., 2003; Duffin, 2004; Wong-Riley М.Т.Т., 2005; Бреслав и соавт., 2005; Сафонов, 2007). Данный центр в первую очередь рассматривается как совокупность дыхательных нейронов. Типы дыхательных нейронов могут быть разнообразными. В связи с этим ряд исследователей предложили различные классификации дыхательных нейронов.
Дыхательный центр (ДЦ) в первую очередь рассматривается как совокупность дыхательных нейронов. Типы дыхательных нейронов могут быть разнообразными. В связи с этим ряд исследователей предлагают различные классификации дыхательных нейронов.
Заслуживает особого внимания классификация в зависимости от характера паттерна активности (Bianchi et al., 1995). Автор предложил шесть основных видов: ранние инспираторные нейроны, инспираторные с нарастающим паттерном активности; поздние инспираторные; постинспираторные; экспираторные с нарастающим паттерном активности; преинспираторные.
Некоторые авторы считают, что дыхательная сеть состоит из преинспираторных, постинспираторных, ранних инспираторных нейронов и нейронов, у которых учащается импульсация на вдохе и на выдохе (Ballantyne and Richter, 1986; Bianchi et aL, 1988; Schwarzacher et aL, 1995).
Richter (1986) в дорсальной и вентральной дыхательной группах продолговатого мозга обнаружил следующие типы дыхательных нейронов: ранние инспираторные, которые разряжаются с максимальной частотой в начале фазы выдоха; полные инспираторные с постоянной или с постепенно нарастающей активностью в течение фазы вдоха; поздние инспираторные, с максимальной частотой разрядов в конце инспирации; постинспираторные, с максимальным разрядом в начале фазы выдоха; экспираторные с постоянной или постепенно нарастающей активностью, которую они проявляют в активную часть фазы выдоха; преинспираторные, имеющие максимум активности непосредственно перед началом вдоха.
Среди многочисленных взглядов по вопросам локализации и функциональной значимости респираторных нейронов в настоящее время наиболее аргументированным считается тот факт, что дыхательные нейроны сосредоточены, главным образом, в пяти функционально различных областях дыхательного центра. Эти области следующие: дорсальная дыхательная группа нейронов, расположенная в вентролатеральном отделе ядра солитарного тракта, ростральная (инспираторная) и каудальная (экспираторная) части вентральной дыхательной группы, находящейся в области п. ambiguous, а также расположенный ростральнее комплекс пре-Бетцингера и Бетцингера (Merrill, 1974; Cohen, 1979; von Euler, 1986; Feldman, 1986; Smith etal., 1991; Bianchi etal., 1995; Schwarzacher etaL, 1995; Richter, 19%; Ramirez etal, 1998;Duffin, 2004; Wong-Riley M.T.T., 2005). (Рис 1).
Дорсальная дыхательная группа (DRG) включает в себя симметричные области продолговатого мозга, расположенные в вентролатеральной части п. tractus solitarii (Hilaire et al., 1990). Большинство данных о нейронах дорсальной дыхательной группы получены в экспериментах на кошках, хотя у крыс эта группа также содержит премоторные эфферентные нейроны, которые проецируются к мотонейронам спинного мозга Исследования на крысах показали, что основные функциональные характеристики nTS у крыс и кошек сходны (de Castro et. al., 1994). Однако для дорсальной дыхательной группы крыс скорее всего главными являются функции восприятия и первичной обработки афферентных импульсов, которые поступают в эту область.
Внеклеточная регистрация активности нейронов дорсальной дыхательной группы показала, что у кошек расположенные здесь инспираторные нейроны являются в основном бульбоспинальными (Berger et al., 1984). Также в данной области присутствуют проприобульбарные нейроны, многие из которых проецируются в вентролатеральные отделы дыхательного центра, а также к контралатеральному ядру солитарного тракта (Ezure & Tanaka, 1996). Некоторые исследователи предполагают, что нейроны ядра солитарного тракта запускаются синхронно со вспышками активности диафрагмального нерва (Hilaire et al., 1990; Duffinetal., 1995).
Для данной инсішраторной группы крысы также характерным является восприятие и первичная обработка афферентных импульсов, поступающих в эту область. Особенностью структурно-функциональной организации дорсальной дыхательной группы крыс является наличие многочисленных афферентных проекций, идущих в область ядра солитарного тракта. Данное ядро отличается богатством первичных висцеральных афферентных входов. Эти афференты принимают участие в реализации многих важнейших дыхательных и гемодинамических рефлексов (Anderson et all., 1994), респираторные рефлексы на гипоксию с периферических хеморецепторов (Koshya & Guyennet, 1996; Mffin, 1997), рефлекса Геринга-Брейера (Bonham et al., 1993; Miyazaki et all., 1998;1999; Ezure et all., 2000).
Структура и физиологическая роль лептина
Открытие лептина чуть более 10 лет назад (Zhang et al., 1994) явилось одним из наиболее значительных достижений современной нейрофизиологии. Выяснение физиологической роли данного высокомолекулярного регуляторного полипептида, угнетающего аппетит, позволило существенно ускорить прогресс в понимании физиологических механизмов регуляции аппетита, патогенеза ожирения и диабета.
Лептин - высокомолекулярный 146-аминокислотный полипептид, являющийся продуктом ob гена. Структура этого пептида представляет собой единичную аминокислотную цепочку с молекулярной массой около 16 кДа (рис. 1).
Лептин не имеет гомологии ни с какими известными белками, поэтому трудно предсказать его пространственную структуру. На сегодняшний день известно, что по пространственной структуре лептин относится к группе а-спиральных белков, в которую входят также гормон роста, пролактин и некоторые другие гормоны и цитокины. Использование методов кругового дихроизма показывает, что более 50% пептидной цепи лептина имеет конформацию а-спирали. Рентгеноструктурный анализ, а также исследование гомологии первичной структуры, показывают, что молекулы этих гормонов представляют собой узлы из четырех а-спиралей (Zhang et al., 1997). Близость а-спиралъных гормонов друг к другу подтверждается не только гомологией их химической структуры, но также сходством молекулярных механизмов их биологического действия, которое выражается в общности химического строения и особенностей функционирования рецепторов этих гормонов.
Также обращает на себя внимание тот факт, что последовательности аминокислот очень стабильны среди представителей различных биологических видов (Zhang et al., 1997) (рис. 2).
Основным местом продукции лептина являются жировые клетки (адипоциты) (Friedman et al., 1998; Zhang et al. 2000), хотя некоторое количество этого полипептида продуцируется также в желудке (Bado et al., 1998; Breidert et al., 1999; CM et al., 2000) и плаценте (Dotsch et al., 1999; Hensonetal., 1999).
Плейотропная природа лептина вызвана универсальным распределением лептиновых рецепторов OB-R. Лептин действует через трансмембранные рецепторы, которые показывают структурное сходство с семейством цитокинов (Tartaglia et al., 1995; Lee et al., 1996; Ldllmann et al., 1997; Tartaglia., 1997; Myers., 2004; Fruhbeck et al., 2006), которое включает рецепторы типа IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, LIF, гормон роста, пролактин и эритропоэтин (Bazan., 1989; Hegyi et a., 2004).
Члены этого семейства характеризуются четырьмя остатками цистеина (Bazan., 1990).OB-R рецепторы существуют в различных трансформациях, таких как OB-Ro, OB-Rp, OB-Rc, OB-Rd, OB-Re и OB-Rf (Lee et al., 1996; Wang et al., 1998), все они имеют внеклеточную область с 800 и более аминокислотами, трансмембранную область с 34 аминокислотами и различную внутриклеточную область, характерную для каждой из изоформ. Исходя из этого изоформы могут быть классифицированы на три класса: короткая, длинная и скрытая. Короткие и длинные изоформы имеют 29 идентичных внутриклеточных аминокислот, различающихся определенной для каждого случая последовательностью. Внеклеточная область OB-R имеет два цитокиноподобных peuenTopa(Tartaglia et al., 1995; Tartaglia., 1997; Myers., 2004; Heshkaetal., 2001).
Модели лептина, сконструированные в лабораторных условиях позволили сделать предположение, что лептин связывается только с OB-Rp рецепторами (Fong et al., 1998; Fruhbeck et al., 2006). Короткие формы рецептора OB-Ra, OB-Rc, OB-Rd, OB-Re и OB-Rf состоят из 30-40 цитоплазматических остатков. Однако, только длинная изоформа, OB-RP, является функциональным рецептором и имеет большую внутриклеточную область около 300 цитоплазматических остатков (у человека она длиннее, чем у мышей), которые необходимы для взаимодействия с другими внутриклеточными белками, а также для последующего возможного запуска внутриклеточных каскадов. Специфические лептиновые рецепторы были обнаружены во многих периферических органах и тканях: в щитовидной железе, надпочечниках, лёгких, плаценте, почках, печени, эндотелиальных клетках, слизистой желудка и кишечника (Breidert et al., 1999; Blum et al., 1997; Cumin et al., 1997; Halaas et al., 1997; Morton et al., 1996; Berthoud et al., 2005). По всей видимости, лептиновые рецепторы обеспечивают транспорт лептина из крови в интерстициальную ткань головного мозга и в спинномозговую жидкость через гематоэнцефалический барьер. При достижении определенной концентрации лептина в сыворотке (25-30 нг/мл) дальнейшее его повышение не сопровождается параллельным увеличением концентрации лептина в ткани мозга и спинномозговой жидкости. Этот феномен может играть определенную роль в развитии резистентности к лептину и ожирения (Mantzoroz 1999; Саго JF, Kolaczynski JW, 1996).
Из вышесказанного можно предположить, что лептин имеет широкий спектр физиологической активности. Однако, наибольший интерес нейрофизиологов вызывает активность данного вещества на уровне структур центральной нервной системы (Schwartz et al., 1996а; Schwartz et al., 1996b), особенно его выраженное ингибирующее влияние на механизмы регуляции аппетита, количество принимаемой пищи и веса тела (Schwartz et al., 1996b). В рамках данной регуляторной системы лептин выполняет роль циркулирующего в системном кровотоке химического сигнала насыщения. Дополнительно было выявлено непосредственное участие лептина в регуляции расхода энергии и термогенезе (Duclos et al., 1999; Herpertz et al., 2000).
Микроинъекции пептида лептина в структуры мозга
Исследование выполнено на 115 белых нелинейных лабораторных крысах обоего пола. Масса тела животных варьировалась в пределах 200-260 г. Животных наркотизировали с помощью внугрибрюшинной инъекции уретана (из расчета 1.5 г/кг массы тела). Эксперименты проводили в соответствии с нормами и правилами этического отношения к лабораторным животным.
К операции приступали через 20-30 минут после наркотизации. Животное трахеостомировали, для этого укрепляли его на операционном столе вентральной поверхностью тела вверх. Рассекали кожу на шее от подбородочной области до верхнего края грудины, обнаруживали трахею, делали в ней Т-отбразный разрез и вводили туда трахеостомическую трубку. Трубку фиксировали в трахее при помощи лигатуры.
По завершении этой стадии операции животное переворачивали дорсальной поверхностью тела вверх и помещали на стереотаксическую установку СЭЖ-3. Голову животного фиксировали в стереотаксическом приборе для мелких животных в положении вентрального сгибания. Производили трепанацию затылочной кости и осуществляли доступ к дорсальной поверхности продолговатого мозга. Для этого частично удаляли мышцы головы и шеи, обнажали поверхность черепа. Кости черепа аккуратно удаляли Доступ к структурам бульварного дыхательного центра осуществляли через атланто-окципиталъную мембрану и твердую мозговую оболочку. Мозжечок сдвигали в ростральном направлении или удаляли его каудальную часть, в зависимости от индивидуальной анатомической особенности расположения дыхательного центра у крыс. В результате вышеперечисленных действий мы обнажали продолговатый мозг до его каудальной границы. Кровотечение останавливали при помощи гемостатической трубки. Во избежании подсыхания продолговатого мозга, его поверхность смачивалась вазелиновым маслом при температуре 37С.
Для доступа к инспираторным мышцам вдоль позвоночника делали кожный разрез от m. acromiotrapezius до поясничной области. С правой стороны отделяли кожный лоскут от грудной фасции и обнажали наружные межреберные мышцы. Абдоминальный доступ к диафрагме осуществляли латерально, через разрез брюшных мышц параллельно реберной дуге.
Воздействие на структуры мозга производили методом микроинъекций. Этот способ обеспечивает точность введения биологически-активного вещества в структуры мозга и обеспечивает его необходимый контакт с исследуемой областью.
Лептин растворяли в искусственной цереброспинальной жидкости и вводили с помощью микрошприца МШ-1, иглу которого герметично соединяли со стеклянной микропипеткой с диаметром кончика 30 мкм, которая заполнялась вазелиновым маслом. Затем заполняли микропипетку раствором лептина. Благодаря несмешиваемости рабочего раствора и вазелинового масла обеспечивается точность дозировки. Объем раствора для одной микроинъекции составлял 0.2 мкл. Микрошприц закрепляли в стереотаксическом приборе и вводили микропипетку в различные области дыхательного центра в соответствии с координатами атласа мозга крысы (Paxinos G., Watson С, 1997). Использовали растворы следующих концентраций: 10"1010"810"6 Ю М.
Скорость введения пептида составляла около 0.01 мкл в секунду. Во избежание распространения вещества в неизучаемые нами мозговые структуры, микропипетку с растворами удерживали в исследуемых областях мозга в течение всего опыта.
В контрольных экспериментах в те же области инъецировали 0.2 мкл искусственной цереброспинальной жидкости.
Для проверки точности введения вещества производили гистологический контроль. Для этого после эксперимента у животного извлекали головной мозг из черепной коробки, фиксировали в 4% растворе формалина и на гистологических срезах с помощью атласа Paxinos G., Watson С определяли место микроинъекций.
Реакции на микроинъекции лептина в область ядра солитарного тракта.
Вентиляторную реакцию на гиперкапнию изучали с помощью ингаляции газовых смесей с содержанием СО2, равным 5% и 10% Для устранения возможного влияния гипоксического стимула (Бреслав, Глебовский, 1981) применяли дыхание чистым кислородом (исходное состояние) и гипероксически-гиперкапнические смеси: 5% СОг + 95% СЬ (гиперкапническая смесь 1) и 10% С02 + 90% 02 (гиперкапническая смесь 2). Во всех экспериментах животным последовательно подавали чистый кислород, гиперкапническую смесь 1, а затем гиперкапническую смесь 2. В начале теста ёмкости со смесями подключали к дыхательной системе животного, используя 2 клапана - инспираторный и экспираторный. Инспираторный клапан открывался на вдохе и способствовал поступлению дыхательной смеси в трахею. Экспираторный клапан открывался на выдохе, благодаря чему животное производило выдох в атмосферу.
Через 10 минут после перевода животных на дыхание кислородом или гиперкапническими смесями, когда динамический период вентиляторной реакции на гиперкапнию заканчивался и дыхание стабилизировалось на новом уровне, в ядро солитарного тракта инъецировали 10"4 М лептин или искусственную цереброспинальную жидкость (контроль). Поскольку продолжительность реакции на воздействие данного раствора лептина укладывалась в 30-минутный интервал времени, тест с каждой газовой смесью заканчивали не ранее, чем через 30 минут после микроинъекции лептина.
Для оценки выраженности вентиляторной реакции на гиперкапнию по ЭМГ наружных межрёберных мышц: рассчитывали частоту дыхания и определяли максимальную амплитуду интегрированной ЭМГ. Такой экспериментальный подход теоретически обоснован существованием высокой положительной корреляции между величиной дыхательного объёма и максимальной амплитудой интегрированной ЭМГ инспираторных мышц (Evanich et al., 1976). При выборе между диафрагмой и наружными межрёберными мышцами предпочтение было отдано последним в связи с тем, что при микроинъекциях лептина в ядро солитарного тракта, изменения активности наружных межрёберных мышц в целом оказались более отчётливыми, чем изменения активности диафрагмы. После этого рассчитывали интегральный показатель активности межрёберных мышц (1Аю) как произведение максимальной амплитуды интегрированной ЭМГ на частоту генерации залпов.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически с помощью программного пакета SigmaStat 2.0 (Jandel Scientific, USA). Обработку данных в выборках и сравнение выборок начинали с определения соответствия распределения данных нормальному с использованием теста Колмогорова-Смирнова и с определения эквивалентности распределения данных в выборках. 6 экспериментах с многократным повторным определением значения исследуемого параметра в случаях соответствия данных нормальному распределению и эквивалентности их распределения в сравниваемых выборках использовали one way ANOVA test, после чего дополнительно применяли Holm-Sidak test для определения поминутных различий исследуемых параметров с исходным уровнем. В случаях, когда обнаруживались различия распределения данных в выборках с нормальным, либо при неэквивалентности их распределения в сравниваемых выборках, применяли тест ANOVA on ranks. В этих случаях для поминутных сравнений исследуемых параметров с исходным уровнем использовали Dunn s test.
Для сравнения независимых выборок использовали unpaired Mest или Mann-Whitney rank sum test (в случаях несоответствия данных в выборках нормальному распределению). Все нормально распределённые данные представлены как средние арифметические ± стандартные ошибки среднего. Для построения графиков пользовались программным пакетом SigmaPlot 8.0 (Jandel Scientific, USA). Статистически значимыми считались изменения со значениями р 0,05. Лептин («Sigma») Уретан («Sigma»)
В настоящей главе описаны результаты экспериментов, в которых выполнено сравнительное исследование реакций паттерна внешнего дыхания, а также биоэлектрической активности диафрагмы и наружных межреберных мышц наркотизированных крыс на микроинъекции широкого диапазона концентраций лептина (10 10, 10"8, 10"6 и 10"4 М) в области локализации дорсальной дыхательной группы, каудального и рострального отделов вентральной дыхательной группы, комплекса пре-Бетцингера и комплекса Бетцингера.
