Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 9
1.1 Общая характеристика болезни Паркинсона 9
1.2 Патогенез болезни Паркинсона 12
1.3 Экспериментальные модели болезни Паркинсона in vivo 32
1.4 Шаперон Hsp70 и болезнь Паркинсона 39
1.5 Индукторы белка теплового шока Hsp70 в терапии нейродегенеративных заболеваний 44
Глава II Материалы и методы исследования 47
2.1 Объект исследования 47
2.2 Стереотаксические операции по вживлению направляющих канюль в черную субстанцию 47
2.3 Моделирование болезни Паркинсона у крыс с помощью ингибитора протеасом лактацистина 48
2.4 Нокдаун Hsp70 в компактной части черной субстанции в модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста 50
2.5 Интраназальное введение рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 человека крысам среднего возраста в модели клинической стадии болезни Паркинсона 50
2.6 Системное введение индуктора белков теплового шока соединения U133 крысам среднего и пожилого возраста в моделях клинической и доклинической стадий болезни Паркинсона 51
2.7 Тесты на моторное поведение 52
2.8 Декапитация 54
2.9 Вестерн-блот 55
2.10 Иммуногистохимическое исследование 55
2.11 Двойное иммуномечение и конфокальная микроскопия 56
2.12 Метод ловушки на фильтре 57
2.13 Статистическая обработка результатов 58
Глава III Результаты исследования 59
3.1 Влияние нокдауна Hsp70 (HSPA1) в дофаминергических нейронах компактной части черной субстанции на показатели нейродегенерации и компенсаторные процессы в нигростриатной системе в модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста 59
3.2 Исследование возрастных особенностей в проявлении нейродегенерации и развитии компенсаторных процессов в нигростриатной системе на модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс 65
3.3 Исследование защитных эффектов белка теплового шока Hsp70 при его интраназальном введении при моделировании клинической стадии болезни Паркинсона у крыс среднего возраста 71
3.4 Исследование нейропротективного потенциала индуктора шаперонов U133 в моделях доклинической и клинической стадий болезни Паркинсона у крыс среднего и пожилого возраста 77
3.5 Исследование влияния препарата U133 на -синуклеиновую патологию и микроглиоз в головном мозге крыс при моделировании болезни Паркинсона 85
Глава IV Обсуждение 90
Заключение 104
Выводы 107
Список использованных сокращений 108
Список цитируемой литературы 109
- Патогенез болезни Паркинсона
- Индукторы белка теплового шока Hsp70 в терапии нейродегенеративных заболеваний
- Исследование возрастных особенностей в проявлении нейродегенерации и развитии компенсаторных процессов в нигростриатной системе на модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс
- Исследование влияния препарата U133 на -синуклеиновую патологию и микроглиоз в головном мозге крыс при моделировании болезни Паркинсона
Патогенез болезни Паркинсона
В среднем мозге человека выделяют три крупных группы ДА-ергических нейронов, лежащие в ретрорубральном поле (А8), черной субстанции (А9) и вентральной тегментальной области (А10). Терминали этих групп нейронов формируют проекции, которые образуют соответственно мезокортикальную, нигростриатную и мезокортиколимбическую ДА-ергические системы мозга. Черная субстанция среднего мозга состоит из трех отделов - компактного, ретикулярного и латерального. Терминали аксонов компактной части черной субстанции оканчиваются в области хвостатого ядра или неостриатума. Нигростриатная система является основной ДА-ергической системой мозга, вовлеченной в организацию двигательных актов [54].
Согласно современным представлениям о центральных механизмах реализации движения, важную роль в этих процессах играет именно ДА-ергический вход из кчЧС [55]. Дорсальный стриатум получает возбуждающий глутаматный вход через отростки пирамидных нейронов коры больших полушарий и ДА-ергический вход от нигростриатной системы. Показано, что конвергенция кортикального и дофаминового входов в дорсальном стриатуме облегчает организацию поведения, направленного на получение подкрепления. Через прямой выход (дофаминовые рецепторы первого типа (Д1), активирующие Gs-белки аденилатциклазной системы) стриатум тормозит внутренний паллидум и ретикулярную часть черной субстанции, уменьшая их тормозящие влияния на таламокортикальные входы (т.е. растормаживает их) и облегчая запуск запланированного движения. Таким образом, прямой выход является активирующим. С другой стороны, через непрямой выход (дофаминовые рецепторы второго типа (Д2), активирующие Gi-белки аденилатциклазной системы) стриатум тормозит наружный паллидум и снижает его тормозящее влияние на субталамическое ядро, что приводит к увеличению активирующего влияния последнего на внутренний паллидум и ретикулярную часть черной субстанции и в результате увеличивает их тормозящие влияния на таламокортикальные входы и уменьшает растормаживающее влияние прямого пути [56]. Таким образом, непрямой выход является тормозным (рис. 2). В результате конвергенции этих двух путей осуществляется запуск или отмена движения [57, 58].
Впервые предположение о связи повреждений нигростриатной системы с развитием патологического состояния, которое впоследствии было названо БП, высказано в 1893 году при исследовании postmortem головного мозга человека, страдающего паркинсоническим тремором [59, 60]. Позже, Фридрих Генрих Леви впервые описал характерные внутриклеточные включения в дорсальном моторном ядре блуждающего нерва, базальном ядре Мейнерта, стриатуме и ядрах таламуса, а в 1919 году российский невропатолог К.Н. Третьяков сообщил о наличии таких включений в кчЧС пациентов с идиопатическим и пост-энцефалическим паркинсонизмом и назвал их тельцами Леви [61–63].
На сегодняшний день абсолютно точно установлено, что к развитию основного симптома БП - моторных феноменов - приводит нарушение метаболизма ДА, в основе которого лежит дегенерация ДА-ергических нейронов кчЧС и их отростков в стриатуме, уменьшение уровня ДА и ненормальная работа прямого и непрямого путей регуляции двигательной функции [1, 64]. Интересно, что дегенерация ДА-ергических нейронов в кчЧС наблюдается и при нормальном старении и составляет примерно 5% от общего числа нейронов кчЧС в десятилетие [65]. Однако при развитии БП процесс дегенерации значительно ускоряется и, в клинической стадии, к моменту появления двигательных симптомов, погибает более 60% ДА-ергических нейронов кчЧС, а уровень ДА в стриатуме падает на 70% по сравнению с возрастным контролем.
БП является заболеванием всей нервной системы, поэтому, помимо нигростриатной системы, процесс агрегации белков, формирования телец Леви и нейродегенерации охватывает и другие области головного мозга, а также периферическую нервную систему. Считается, что развитие нейродегенерации начинается с терминальных отделов мозга (обонятельные луковицы, дорсальное двигательное ядро блуждающего нерва), а затем распространяется в различные области головного мозга через проекции аксонов [66]. Эта гипотеза подтверждается тем, что одним из первых симптомов БП (как и некоторых других нейродегенеративных заболеваний) является ольфакторная дисфункция, т.е. неспособность чувствовать запахи, которая развивается у 90% больных БП задолго до появления моторных феноменов [67]. Также во время этой немоторной фазы заболевания, называемой продромальной стадией БП, проявляются и иные немоторные признаки, например, быстрый сон без мышечной атонии, запоры и другие вегетативные нарушения [52, 68, 69], возникающие вследствие нейродегенеративного процесса в обонятельных луковицах, голубом пятне, дорсальном моторном ядре блуждающего нерва, ядре шва, туберомамиллярном гипоталамическом ядре [70]. Однако вопрос, почему именно моноаминергические нейроны кчЧС, голубого пятна и других ядер оказываются особо чувствительными к дегенерации при БП, до сих пор обсуждается.
Несмотря на то, что БП открыта давно и ведется ее непрерывное изучение, этиология этого заболевания остается неясной. Мутации являются причиной лишь малой части всех эпизодов БП: около 90% случаев являются спорадическими. Считается, что основными факторами риска являются генетическая предрасположенность, подверженность стрессам, травмы мозга, воздействие эндо- и экзогенных токсичных веществ, способных запустить нейродегенеративный процесс [71, 72]. Несмотря на открытия, сделанные генетиками в последние годы, точные патогенетические механизмы, лежащие в основе селективной гибели ДА-ергических нейронов кчЧС, остаются до конца не изученными, и на сегодняшний день считается, что к нейродегенерации при БП приводит сочетание эндогенных и экзогенных факторов.
1. Морфологические и нейрохимические особенности дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции
Уникальность ДА-ергических нейронов кчЧС заключается в необычайной разветвленности их терминалей и формировании огромного количества синапсов. Каждый ДА-ергический нейрон может образовывать 100-245 тыс. и более синапсов в стриатуме и иметь аксон длиной более 40 см, а некоторые ДА-ергические нейроны кчЧС человека имеют до 2.4 млн синапсов [73]. ДА-ергические нейроны вентральной тегментальной области имеют меньшую разветвленность и обычно формируют не более 30 тыс. синапсов [74]. Предполагается, что распространение потенциала действия по столь длинным немиелинизированным аксонам -биоэнергетически «дорогой» процесс, который может увеличивать уровень стресса в ДА-ергических нейронах кчЧС [75]. Даже если не затрагивать биоэнергетическую сторону вопроса, просто физическое поддержание столь сложной архитектуры нейрона может вносить вклад в его уязвимость к действию эндо- и экзогенных стрессовых факторов. Новосинтезированные белки, липиды и органеллы, в том числе митохондрии, должны быть доставлены от сомы нейрона к его дистальным участкам посредством антероградного транспорта, а поврежденные молекулы и органеллы необходимо вернуть в сому ретроградным транспортом для последующей деградации. Все эти процессы траффинга являются АТФ-затратными и зависят от работы митохондрий [76]. Неправильное распределение и медленный транспорт митохондрий по аксону и дендритному древу может приводить к нарушениям процессов транспорта в нейроне вследствие недостатка энергии АТФ. Действительно, дефекты в распространении митохондрий в ДА-ергических нейронах кчЧС описаны в некоторых моделях БП [77]. У пациентов, страдающих БП, отмечаются нарушения внутринейронного транспорта и аномальное распределение транспортных белков кинезина и динеина, перемещающих внутри клетки митохондрии, в телах и отростках нейронов кчЧС [78]. На клеточных культурах и моделях БП in vivo, при экспрессии мутантного -синуклеина или под действием нейротоксинов также наблюдается снижение содержания моторных белков и дефекты аксонального транспорта [78, 79]. Таким образом, нарушения аксонального транспорта и внутриклеточного распределения главных продуцентов АТФ -митохондрий - могут лежать в основе ретроградной дегенерации длинных и сильно разветвленных нейронов кчЧС.
Индукторы белка теплового шока Hsp70 в терапии нейродегенеративных заболеваний
Приведенные выше данные о нейропротективных эффектах Hsp70 в различных моделях БП позволяют предположить, что фармакологические методы лечения, направленные на мобилизацию шаперонов в головном мозге, могут представлять собой потенциально новый подход к уменьшению в нейронах головного мозга количества токсичных белков с неправильной конформацией и замедлению процесса нейродегенерации при БП и других нейродегенеративных заболеваниях человека. Основным активатором транскрипции генов HSPs при развитии стресса является транскрипционный фактор теплового шока HSF1 [306]. У всех эукариотических организмов в состоянии покоя HSF1 находится в мономерном, связанном с Hsp90 состоянии. В ответ на стресс HSF1 освобождается от Hsp90, тримеризуется, фосфорилируется, транслоцируется в ядро и запускает транскрипцию стресс-индуцируемых генов HSP [307]. Старение организма и развитие конформационных заболеваний сопровождаются пониженным уровнем экспрессии и активности HSF1, а значит и сниженной способностью нейронов противостоять токсическим повреждениям и нейродегенерации [160]. Следовательно, для мобилизации защитных механизмов требуется активация HSF1. Поэтому поиск безопасных малых молекул-индукторов HSF1 является приоритетной задачей современной биомедицины.
Одним из первых изученных активаторов HSF1 стал ингибитор Hsp90, антибиотик гелданамицин. Его нейропротективные эффекты, основанные на повышенной экспрессии Hsp70, были продемонстрированы в моделях -синуклеиновой токсичности. Показано, что терапия гелданамицином снижает количество -синуклеиновых агрегатов и их токсичность, препятствует секреции -синуклеина в межклеточное пространство и увеличивает выживаемость ДА-ергических нейронов в модели БП, основанной на сверхэкспрессии -синуклеина у мушек Drosophila sp. [308]. Превентивное интражелудочковое введение гелданамицина предотвращает гибель нейронов кчЧС, снижение содержания ТГ и ДА в стриатуме в МФТП-модели БП у мышей. Продемонстрировано, что гелданамицин снижает содержание цитозольного Hsp90, увеличивает уровень фактора HSF1 и активность его взаимодействия с промотором гена Hsp70, и повышает содержание шаперона Hsp70 в стриатуме [309]. Однако возможность применения гелданамицина в терапии нейродегенеративных заболеваний лимитирована его низкой растворимостью, слабой проходимостью через гематоэнцефалический барьер, потенциальной токсичностью для печени и желудочно-кишечного тракта [310].
Другой активатор HSF1, аримокломол, лишен недостатков, свойственных гелданамицину, и поэтому проходит клинические испытания в качестве потенциального терапевтического агента для лечения амиотрофического латерального склероза [311]. Механизм действия аримокломола основан на его способности продлевать время пребывания HSF1 в связанном с ДНК состоянии и, таким образом, приводить к возрастанию экспрессии Hsp70 и других стресс-индуцируемых шаперонов. Однако терапевтическая эффективность аримокломола для лечения людей, страдающих амиотрофического латерального склероза, пока не доказана, хотя подтверждена его безопасность и хорошая переносимость даже при ежедневном приеме в течение 12 месяцев [312]. К сожалению, информация об эффектах аримокломола в моделях БП отсутствует в современной литературе, а его эффективность в отношении других нейродегенеративных заболеваний пока под вопросом.
Растительный препарат селастрол, длительное время применяемый в традиционной китайской медицине, также способен увеличивать содержание HSPs в нейронах за счет активации фосфорилирования HSF1. Индукция синтеза Hsp70 селастролом сходна с ответом организма на тепловой шок, однако является более продожительной [313]. Терапия селастролом приводит к замедлению процесса нейродегенерации в различных моделях БП [314, 315]. Однако, несмотря на многообещающие нейропротективные эффекты, некоторые исследования свидетельствуют о негативном влиянии селастрола на работу печени и почек у экспериментальных животных, а также о его токсичности у людей [310, 316].
Одним из многообещающих терапевтических агентов в борьбе с нейродегенеративными заболеваниями является вещество FLZ, выделяемое из некоторых растений [317]. Нейропротективные эффекты FLZ основаны на его способности активировать HSF1 и увеличивать содержание Hsp70 в клетках и продемонстрированы в моделях БП in vitro и in vivo, основанных на применении 6-OHDA или МФТП [318, 319]. Установлено, что в МФТП-модели БП у мышей, нейропротективный потенциал FLZ, оцениваемый по количеству ДА-ергических нейронов в кчЧС, реализуется через уменьшение количества -синуклеиновых агрегатов в нейронах [320]. Также показано, что, помимо освобождения HSF1 из ингибиторного комплекса и активации таким образом экспрессии гена HSP70, FLZ взаимодействует с кошапероном Hsp70 Hip, который стимулирует шаперонную активность Hsp70 [321]. Первые публикации о нейропротективных эффектах FLZ появились в 2005 году [322], и пока ни в одном из исследований не упоминается о его возможных токсичных эффектах, что позволило китайским ученым начать его преклинические испытания на добровольцах [323].
Практически все перечисленные выше индукторы HSPs, помимо нейропротективных свойств, обладают нежелательными побочными эффектами, ограничивающими их применение в клинической практике. Поэтому поиск безопасных индукторов шаперонов для лечения нейродегенеративных заболеваний активно продолжается. В связи с этим в нашей лаборатории, совместно с коллегами из ИНЦ РАН (лаб. защитных механизмов клетки под руководством д.б.н. Гужовой И.В.), было начато исследование нейропротективного потенциала нового индуктора HSF1 - нетоксичного низкомолекулярного хиноидного липофильного соединения U133. Это соединение получено из библиотеки низкомолекулярных веществ Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (лаб. органического синтеза природных соединений, к.х.н. Полоник С.Г.). U133 является производным эхинохрома, основного пигмента дальневосточных морских ежей. Показано, что даже в высокой концентрации U133 не обладает цитотоксическим действием, при этом дозо-зависимо увеличивая содержание Hsp70 и других шаперонов в нейронах головного мозга. В микромолярных концентрациях U133 способен вызывать активацию транскрипционного фактора теплового шока HSF1, что приводит к индукции синтеза белков теплового шока Hsp70 и HSP40 (Hsp40/Hdj1) [324]. Защитные эффекты U133 продемонстрированы в моделях канцерогенеза in vitro и in vivo [325], а также в модели окислительного стресса, вызванного воздействием на клетки крысы линии С6 пероксидом водорода [326]. Одной из задач данной диссертационной работы является оценить нейропротективный потенциал U133 и его влияние на -синуклеиновую патологию и реактивный микроглиоз в моделях БП у крыс среднего и пожилого возраста.
Таким образом, представленные данные литературы убедительно показывают, что белки теплового шока Hsp70, являясь эффективными молекулярными шаперонами, представляют собой первую линию защиты клеток от нейротоксичности конформационно дефектных белков при развитии нейродегенеративных болезней. Однако ряд вопросов до сих пор остается не решен: 1) является ли стресс-индуцируемый Hsp70 ключевой молекулой, принимающей участие в замедлении нейродегенеративной патологии при развитии БП; 2) сопряжены ли возрастные изменения в нейродегенеративных и компенсаторных процессах в ДА-ергической нигростриатной системе с содержанием Hsp70 в нейронах кчЧС при развитии БП; 3) обладают ли экзогенный белок теплового шока Hsp70 и индуктор белков теплового шока малая молекула U133 нейропротективным потенциалом в моделях БП у крыс среднего и пожилого возрастов; 4) каковы основные механизмы реализации защитных эффектов Hsp70 при моделировании БП у крыс. Данная диссертационная работа направлена на решение этих вопросов.
Исследование возрастных особенностей в проявлении нейродегенерации и развитии компенсаторных процессов в нигростриатной системе на модели доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс
Старение является сложным биологическим явлением, в процессе которого нарушается молекулярно-генетическое и физиологическое поведение клеток и накапливаются возрастные повреждения [209, 210]. Преклонный возраст – основной фактор риска развития и прогрессии нейродегенеративных заболеваний. У пожилых людей отмечено снижение уровня ТГ и ДА в стриатуме, уменьшение количества пигментированных нейронов в кчЧС и плотности рецепторов ДА в стриатуме [212]. Синтез белков теплового шока HSP70 и других шаперонов, обладающих нейропротективными свойствами, в клетках и тканях при старении ослабевает, стресс не вызывает такого отчетливого повышения экспрессии шаперонов, как у молодых [18, 160, 225, 226]. Однако в литературе до сих пор отсутствуют данные, экспериментально подтверждающие зависимость от возраста и содержания Hsp70 в нейронах головного мозга темпа прогрессии нейродегенерации и активности компенсаторных процессов в нигростриатной системе при развитии БП. Поэтому следующей задачей исследования было выяснить, является ли возрастное снижение уровня Hsp70 в нейронах кчЧС одним из факторов, способствующих развитию нейродегенерации и ослаблению механизмов пластичности мозга при моделировании доклинической стадии БП у крыс.
Для решения этой задачи мы применили антитела против индуцибельного белка Hsp70 и исследовали содержание Hsp70 в нейронах кчЧС у крыс разных возрастных групп при моделировании доклинической стадии БП. Проведенный анализ иммунореактивности Hsp70 в нейронах кчЧС показал, что в контрольных условиях содержание Hsp70 в нейронах кчЧС сходно у молодых крыс и животных среднего возраста, а у пожилых крыс по сравнению с молодыми уровень Hsp70 снижен на 14% (р 0.05). Выяснено, что при моделировании доклинической стадии БП с помощью ЛЦ содержание Hsp70 в кчЧС возросло на 41% (р 0.05) и 38% (р 0.05) соответственно через две недели после последней микроинъекции ЛЦ, у крыс молодого и среднего возраста, а у пожилых крыс наблюдалась лишь тенденция к приросту уровня Hsp70 по сравнению с возрастными контрольными значениями (рис. 14). Следовательно, введение ЛЦ в кчЧС вызывает в 2.7 раза меньшее увеличение уровня Hsp70 в нейронах кчЧС у пожилых крыс по сравнению с молодыми животными и крысами среднего возраста, что указывает на ослабление мобилизации шаперонного механизма, основанного на Hsp70, при старении. Рисунок 14. Изменение содержания белка теплового шока Hsp70 в нейронах компактной части черной субстанции после микроинъекций лактацистина (ЛЦ) у крыс молодого, среднего и пожилого возраста. Световая микроскопия: (а) Hsp70-иммунореактивные нейроны в кчЧС (масштаб 10 мкм). Достоверность различий в опыте относительно: соответствующего возрастного контроля - p 0.05; пожилого контроля по сравнению молодым # - p 0.05.
Для того чтобы выяснить, насколько зависит от возраста темп развития нейродегенерации и активность компенсаторных процессов в нигростриатной системе при введении ЛЦ, проанализировано количество выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в стриатуме, содержание в нейронах кчЧС ТГ и ВТМА 2. Проведенный морфологический анализ нейронов, иммунореактивных к ТГ, показал, что в контрольных условиях количество ДА-ергических нейронов в кчЧС на 17% (р 0.05) и 12% меньше у пожилых по сравнению с крысами молодого и среднего возраста, соответственно. Следовательно, по мере старения животных ДА-ергические нейроны подвергаются нейродегенерации. После введения ЛЦ количество выживших нейронов в кчЧС уменьшилось на 14% (р 0.05) у молодых, на 24% (р 0.05) в среднем возрасте и на 35% (р 0.05) у пожилых крыс по сравнению с соответствующими возрастными контролями (рис. 15 а, б). Сходная картина наблюдалась в дорсальном стриатуме - в контрольных условиях у пожилых крыс количество ТГ-иммунопозитивных ДА-ергических терминалей аксонов было ниже на 16% (р 0.05) и на 13% по сравнению с животными молодого и среднего возраста, соответственно. При введении ЛЦ количество ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме значимо не изменялось у молодых животных; у животных среднего возраста количество аксонов уменьшилось на 14% (р 0.05), а у пожилых – на 21% (р 0.05), по сравнению с возрастным контролем (рис. 15 в, г). Таким образом, микроинъекции ЛЦ в кчЧС приводят к уменьшению в 2.5 раза числа выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и в 2.3 раза их аксонов в дорсальном стриатуме у пожилых крыс по сравнению с молодыми. Это указывает на ослабление резистентности нигростриатной системы к токсическому действию ЛЦ при старении.
Обнаружено, что у пожилых крыс в контрольных условиях происходит увеличение на 19% (р 0.05) содержания ТГ в нейронах кчЧС по сравнению с молодыми. При введении ЛЦ наблюдалось возрастание уровня ТГ в выживших нейронах кчЧС у крыс молодого и среднего возраста, а у пожилых, напротив, содержание ТГ снижалось на 18% (р 0.05) в кчЧС по сравнению с соответствующим возрастным контролем (рис. 16 а, б). Сходная направленность отмечена при анализе содержания ВТМА 2. При старении в контрольных условиях содержание ВТМА 2 в нейронах кчЧС увеличивалось на 21% (р 0.05). Введение ЛЦ вызывало повышение ВТМА 2 на 17% (р 0.05) у крыс молодого и среднего возраста, а у пожилых– снижение на 19% (р 0.05) (рис. 16 в, г).
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что микроинъекции ЛЦ в кчЧС вызывают у пожилых крыс, в отличие от животных молодого и среднего возраста, не увеличение, а снижение уровня ТГ и ВТМА 2 в нейронах кчЧС. Это свидетельствует об ослаблении активности механизмов, направленных на компенсацию функциональной недостаточности ДА-ергической системы к действию ЛЦ при старении.
На сегодняшний день в литературе превалирует мнение, что основной причиной гибели нервных клеток при БП является образование в телах нейронов токсичных агрегатов белка -синуклеина [6, 340]. Ключевое значение в предотвращении образования белков с неправильной укладкой играют белки теплового шока семейства HSP70 и малые белки теплового шока sHSPs. Мы предположили, что возрастное снижение экспрессии Нsp70 может являться причиной ускоренной агрегации -синуклеина, инициирующей гибель нейронов.
Исследование влияния препарата U133 на -синуклеиновую патологию и микроглиоз в головном мозге крыс при моделировании болезни Паркинсона
С помощью антител против -синуклеина и световой микроскопии установлено, что в контрольных условиях -синуклеин распределен диффузно в цитоплазме нейронов кчЧС (рис. 32), что согласуется с исследованиями других авторов [350, 351]. При моделировании доклинической стадии БП у пожилых крыс через две недели после двукратного введения ЛЦ в телах нервных клеток кчЧС обнаруживаются тельца Леви. Они имеют характерную морфологию: плотное ацидофильное ядро с бледным ореолом вокруг него (рис. 32 а). Тельца Леви сходной морфологии наблюдаются у пациентов БП [228].
Для того чтобы выявить, способна ли Hsp70-индуцирующая терапия с помощью U133 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс повлиять на процесс формирования агрегатов белка -синуклеина, были исследованы нейроны обонятельной луковицы и кчЧС. Морфологический анализ показал, что индукция синтеза Hsp70 с помощью соединения U133 привела к резкому сокращению количества агрегатов -синуклеина в ДА-ергических нейронах кчЧС (рис. 32 в), при этом в обонятельных луковицах этого не наблюдалось (рис. 32 б).
Для оценки количества агрегатов -синуклеина в кчЧС в модели БП у крыс при терапии с U133 мы применили метод ловушки на фильтре (Filter Trap Assay). Данное исследование проведено совместно с нашими коллегами из лаб. защитных механизмов клетки (рук. д.б.н. Гужова И.В.) на базе ИНЦ РАН. Установлено, что введение ЛЦ крысам характеризовалось формированием в кчЧС нерастворимых агрегатов -синуклеина, которые идентифицировались через 1 и 21 день после первой инъекции ЛЦ (рис. 33), что согласуется с данными, полученными с помощью конфокальной микроскопии. Терапия с использованием U133 привела к регрессии агрегированной нерастворимой формы -синуклеина в кчЧС у модельных животных, однако для проявления терапевтического эффекта требовалось пролонгированное применение U133: защитный эффект U133 не детектировался через сутки после первой микроинъекции ЛЦ (рис. 33).
Таким образом, фармакологическая активация синтеза Hsp70 с помощью U133 способствует уменьшению количества агрегатов белка -синуклеина в кчЧС в модели доклинической стадии БП у крыс.
Одной из основных патологических модификаций -синуклеина является его фосфорилирование по Ser129, которое может влиять на растворимость этого белка и способствовать его патогенной агрегации [6, 185]. Поэтому важным представлялось исследовать влияние U133 на содержание фосфорилированного -синуклеина (Ser129) в кчЧС крыс при моделировании БП.
Показано, что через две недели после введения ЛЦ содержание общей формы -синуклеина у модельных крыс возросло в 1.4 раза (p 0.01), а фракция фосфорилированного -синуклеина (Ser129) увеличилась в 2.9 раза (p 0.01) по сравнению с контролем (рис. 34). На конфокальных микрофотографиях фосфорилированный -синуклеин (Ser129) обнаруживался в виде агрегатов в цитоплазме ТГ-иммунопозитивных нейронов кчЧС, что свидетельствует о переходе -синуклеина в патологическую форму в модели БП у крыс (рис. 35). При терапии с U133 количество общего растворимого -синуклеина в кчЧС имело явную тенденцию к возрастанию. Фосфорилированная форма -синуклеина (Ser129) снижалась до контрольных значений (рис. 34). На конфокальных микрофотографиях видно, что в кчЧС -синуклеин (Ser129) оказался гомогенно распределен в телах ДА-ергических нейронов у модельных крыс, получавших U133 (рис. 35).
Хроническое нейровоспаление – патологический признак БП. Его развитие способствует поддержанию процесса нейродегенерации и проявляется возрастанием количества клеток активированной микроглии [352]. Для того чтобы проверить наличие активированной микроглии в головном мозге мы применили антитела против Iba-1, который является маркером активированной микроглии.
Выяснено, что после введения ЛЦ у пожилых крыс прирост количества микроглиоцитов в обонятельной луковице составил 30% (p 0.05), а в кчЧС - 47% (p 0.01) по сравнению с возрастным контролем, что указывает на развитие нейровоспаления в исследованых структурах мозга при моделировании доклинической стадии БП у пожилых крыс (рис. 36). Терапия с U133 уменьшила в 2.4 раза реактивный микроглиоз в кчЧС, что свидетельствует о противовоспалительном действии U133. Однако в обонятельных луковицах противовоспалительный эффект U133 не проявился (рис. 36).
Таким образом, системное введение U133 в модели доклинической стадии БП у пожилых крыс оказывает противовоспалительный эффект в кчЧС, но не корректирует воспалительную реакцию в обонятельных луковицах.
Данные, представленные в этом разделе, демонстрируют, что нейропротективный эффект соединения U133 реализуется через повышение уровня шаперона Hsp70, который уменьшает цитотоксичность аберрантных форм -синуклеина и ослабляет процесс нейровоспаления в кчЧС в модели БП у крыс.