Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общие представления о химической трансмиссии 12
2.2. Рецепторы гамк 14
2.3. Рецепторы глутамата 20
2.4. Взаимодействие гамк и глутаматной медиаторных систем
3. Методика исследований 30
4. Результаты
4.1. Описание нейронов, использованных в эксперименте 36
4.2. Свойства гамк- и глутамат-опосредованных ответов изолированных нейронов 38
4.3. Влияние концентрации агонистов на пиковую амплитуду ответов 47
4.4. Особенности суммации ионных токов 50
4.5. Влияние активации рецепторов глутамата на гамк-опосредованные токи 67
4.6. Влияние активации рецепторов гамк на глутамат-опосредованные токи 70
4.7. Модуляция ответов нейронов метаботропными рецепторами глутамата
5. Обсуждение результатов 83
5.1. Общие свойства нейронов префронтальной коры, использованных в экспериментах 83
5.2. Характеристика гамк- и глутамат-опосредованных ответов изолированных нейронов префронтальной коры головного мозга крысы 85
5.3. Общая характеристика проявления эффектов окклюзии 93
5.4. Модуляция ответов нейронов метаботропными рецепторами гамк 100
6. Выводы 108
7. Список литературы 109
- Рецепторы глутамата
- Взаимодействие гамк и глутаматной медиаторных систем
- Влияние концентрации агонистов на пиковую амплитуду ответов
- Характеристика гамк- и глутамат-опосредованных ответов изолированных нейронов префронтальной коры головного мозга крысы
Введение к работе
Актуальность исследования
Современные данные свидетельствуют о том, что синаптическая передача в каждом отдельном синапсе центральной нервной системы регулируется множеством факторов, в том числе набором котрансмиттеров и нейромодуляторов (Cesselin, Hamon, 1984; Burnstock, 2013). В целом ряде исследований продемонстрирована совместная локализация в пресинаптических окончаниях ряда медиаторов (Vigh et al., 1995; Seal et al., 2006; Somogyi, 2006). Могут быть колокализованы ГАМК и ацетилхолин (Manolov, Davidoff, 1989; Duarte et al., 1999; Jia et al., 2003), ГАМК и серотонин (Dnker, 1998; Barreiro-Iglesias et al., 2009), ГАМК и АТФ (Jo et al., 1999), ГАМК и дофамин (Nguyen-Legros et al., 1997; Barreiro-Iglesias et al., 2009), ГАМК и глицин (Todd et al., 1996; Legendre, 2001), а также глутамат и ацетилхолин (Li et al., 2004; Nishimaru et al., 2005), глутамат и дофамин (Sulzer, Rayport, 2000; Lapish et al., 2007; Hnasko et al., 2012), дофамин и серотонин (Vanhatalo et al., 1995) и ряд других нейротрансмиттеров.
В литературе имеются достаточно обширные сведения о взаимовлиянии
нескольких медиаторов, выделяемых из одного или разных пресинаптических
окончаний и широко обсуждается, каково его функциональное значение (Hnasko et al.,
2012). При этом при изучении совместного действия нескольких медиаторов на многих
объектах продемонстрировано, что трансмембранные ионные токи нейронов,
вызываемые активацией постсинаптических рецепторов разной модальности,
суммируются нелинейно. По-видимому, данное взаимовлияние представляет собой
быстрый адаптивный процесс, участвующий в регуляции эффективности
синаптической передачи. Факт нелинейного взаимодействия ответов нейронов установлен для большого числа сочетаний рецепторов: P2X2 рецепторы АТФ и 5HT3 рецепторы серотонина (Boue-Grabot et al., 2003), P2X и никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Barajas-Lopez et al., 1998; Searl et al., 1998; Khakh et al., 2000), P2X2 и ГАМКа-рецепторы (Sokolova et al., 2001; Boue-Grabot et al., 2003), P2X3 и ГАМКа-рецепторы (Toulme et al., 2007), капсаициновые и P2X (Piper et al., 2000), а также для ГАМКа и глициновых рецепторов (Russier et al., 2002; Li et al., 2002; 2003).
ГАМК и глутамат – основные нейромедиаторы ЦНС млекопитающих,
присутствующие практически во всех ее отделах. Многие нейроны могут получать
входы, опосредуемые этими обоими сигнальными веществами (Staley et al., 1992). В
ряде случаев ГАМК и глутамат могут высвобождаться в синаптическую щель
совместно из одного окончания (Seal et al., 2006; Noh et al., 2010; Beltran et al., 2012), что может приводить к взаимовлиянию их эффектов на постсинаптическом уровне. Возможность совместной локализации ионотропных рецепторов глутамата и ГАМК в синапсе продемонстрирована во многих исследованиях (Shrivastava et al., 2011). Оба этих вещества способны активировать как ионотропные рецепторы (ГАМКа или глутаматные NМDА-типа, AMPA-типа и каинатные), так и метаботропные (ГАМКб и множество подтипов метаботропных глутаматных рецепторов), локализованные как пре- так и постсинаптически. Постсинаптические метаботропные глутаматные рецепторы первой и второй групп достаточно широко распространены в префронтальной коре головного мозга крысы (Lopez-Bendito et al., 2002; Ohishi et al., 1993; Petralia et al., 1996). Постсинаптические ГАМКб-рецепторы также обнаружены в коре головного мозга крысы (Princivalle et al., 2001). Это создает предпосылки для самых разнообразных взаимодействий эффектов рассматриваемых нейромедиаторов и взаимной модуляции их рецепторов в нейронах коры головного мозга (Shrivastava et al., 2011; Амахин и др., 2012).
В настоящий момент имеется информация о том, что нелинейное взаимодействие ответов нейронов в ходе одновременной активации разных рецепторов может протекать по-разному. Так, на примере ГАМК-глицинового взаимодействия сделаны предположения о его молекулярных механизмах (Амахин и др., 2012). Предполагается, что причиной нелинейной суммации ответов может быть межрецепторное взаимодействие, в том числе с участием внутриклеточных посредников (Li et al., 2003) или неселективная активация медиатором не своих рецепторов (Baev et al., 1992; Trombley et al., 1999; Амахин и др., 2009; 2011). Однако отсутствуют достаточные сведения о нелинейном взаимодействии ГАМК- и глутамат-опосредованных токов нейронов коры. Для расширения сведений об этом необходимо исследовать вклад как инотропных, так и метаботропных рецепторов на постсинаптическом уровне.
Вышеизложенное обосновывает актуальность выбранного направления
диссертационных исследований. В целом, имеющиеся на сегодняшний день сведения о
взаимовлиянии активации ГАМК и глутаматных рецепторов нейронов
немногочисленны и разрознены. Малоизученность этих процессов, обуславливает важность проведенных исследований.
Тема диссертационной работы «Взаимовлияние активации ГАМК- и глутаматных рецепторов нейронов коры головного мозга крыс» лежит в русле исследований межнейронной сигнализации и принадлежит к перспективному направлению нейрофизиологических исследований.
Цель работы: выяснить характер взаимодействия процессов, вызываемых активацией ГАМК- и глутаматных рецепторов в нейронах коры головного мозга крыс.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:
исследовать свойства ответов, вызываемых действием ГАМК и глутамата на изолированные нейроны коры головного мозга крысы;
исследовать особенности суммации ГАМК- и глутамат-опосредованных ионных токов при различных физиологических условиях;
оценить модуляцию ГАМК- и глутамат-опосредованных ответов нейронов коры метаботропными рецепторами глутамата и ГАМК.
Исследования проводились на изолированных пирамидных нейронах коры головного мозга крысы (Wistar) методом «Пэтч-кламп» в конфигурации «Целая клетка» в режиме фиксации мембранного потенциала.
Научные положения, выносимые на защиту:
-
В нейронах коры головного мозга крысы взаимодействие между ГАМКа-и ионотропными рецепторами глутамата (АМРА и каинатными) приводит к нелинейной суммации ответов при одновременной активации рецепторов.
-
При совместной аппликации глутамата и ГАМК активация ГАМКа-рецепторов в большей мере влияет на глутаматные рецепторы, чем активация глутаматных рецепторов влияет на ГАМКа-рецепторы.
-
Постсинаптические ГАМКб-рецепторы осуществляют модуляцию ГАМКа-рецепторов в исследованных нейронах. Эта модуляция приводит к усилению или ингибированию ГАМКа-опосредованных ионных токов.
-
Модуляции ГАМКб-рецепторами ионотропных рецепторов глутамата в нейронах коры головного мозга крыс не выявлено.
-
Модуляции ГАМК-рецепторов и ионотропных рецепторов глутамата метаботропными рецепторами глутамата I группы не выявлено.
Научная новизна полученных результатов диссертационных исследований заключается в следующем:
впервые при исследовании взаимовлияния активации ГАМК- и глутаматных рецепторов нейронов коры головного мозга крыс учитывался вклад как ионотропных, так и метаботропных рецепторов;
впервые показано значение нелинейной суммации ионных токов в регуляции сиаптической передачи при совместном воздействии медиаторов;
впервые выявлено, что снижение амплитуды ответов, которое наблюдается при нелинейном взаимодействии ГАМК- и глутамат-опосредованных ответов происходит за счет снижения глутаматного компонента тока;
впервые показано, что модуляция ГАМКб-рецепторами ГАМКа-опосредованных токов может проявляться по-разному. Модулирующее влияние ГАМКб-рецепторов на данные токи может быть ингибирующим или активирующим. Это проливает свет на роль метаботропных рецепторов в регуляции возбудимости нейрона, а также помогает разрешить противоречивые результаты ранее выполненных исследований.
Теоретическая значимость. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов межнейронной сигнализации в нервной системе.
В работе проанализированы пути межмедиаторной регуляции синаптической передачи на постсинаптическом уровне. Важное теоретическое значение имеют полученные в нашей работе данные о взаимодействии эффектов ГАМК и глутамата как нейромедиаторов, взаимной модуляции сигналов, в частности нелинейной суммации и окклюзии ответов нейронов.
Практическая значимость. Результаты работы могут быть использованы при целенаправленной разработке специфических нейроактивных препаратов, а также могут быть включены в курсы лекций для студентов биологических и медицинских факультетов. Полученные автором данные проведенных исследований уже использовались в учебном процессе по нормальной физиологии для студентов Медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета.
Личный вклад автора. Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии. Автор проводил статистическую обработку полученных данных, осуществлял
их анализ и обобщение. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и
обсуждены на XVI Всероссийской медико-биологической научной конференции
молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» и конференции молодых исследователей, посвященной памяти академика В.Л. Свидерского, Санкт-Петербург, 2013 г., на XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова, Волгоград, 2013 г., наконференции «Биология – наука XXI века», Москва, 2012 г. Были также представлены и обсуждены на коллоквиумах и семинарах лаборатории молекулярных механизмов нейронных взаимодействий ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикаций основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней. Одна статья находится в печати в перечне журналов ВАК.
Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований №11-04-00868 «Внутри- и внеклеточные механизмы регуляции синаптической передачи» и программы Президиума РАН «Механизмы интеграции молекулярных систем при реализации физиологических функций».
Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 350 источника. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 3 таблицы.
Рецепторы глутамата
Химическая трансмиссия - форма взаимодействия нейронов через специализированные образования - синапсы при помощи сигнальных молекул - медиаторов. Синапс образуется между отростками или между отростком и телом нейронов. В синапсе различают пресинаптический и постсинаптический отделы и, синаптическую щель между ними. Медиаторы делят на тормозные и возбуждающие в зависимости от характера воздействия на постсинаптическую нервную клетку. Тормозные медиаторы препятствуют возникновению нервного импульса, возбуждающие - способствуют. ГАМК - тормозный нейромедиатор в ЦНС, непротеиногенная аминокислота, из которой не синтезируется белок (Molina-Rueda et al., 2015). Большое количество ГАМКергических нейронов в нервной системе млекопитающих содержится в головном мозге (Kwon et al., 2014), ганглиях автономной нервной системы (Oldham et al., 2014), сетчатке (Dumans ka et al., 2014). Многие годы считалось, что ГАМК является тормозным медиатором преимущественно ростральных отделов ЦНС, в то время как в спинном мозге торможение осуществляется с использованием в качестве медиатора глицином (Kwon et al., 2014). Однако сейчас показано, что в спинном мозге ГАМКергическое торможение представлено достаточно широко (Oldham et al., 2014). ГАМК образуется из глутамата с помощью фермента глутаматдекарбоксилазы в ходе метаболического пути (Dhakal et al., 2012) обозначаемого как «ГАМК-шунт» (Shimajiri et al., 2013).
Глутамат - возбуждающий нейромедиатор в ЦНС, алифатическая аминокислота, анион глутаминовой кислоты, присутствует в составе белков и низкомолекулярных соединений (Rowley et al., 2012). Глутамат синтезируется из глутамина с помощью фермента глутаминазы. Он также может образовываться из -кетоглутарата при участии фермента аминотрансферазы (Palaiologos et al., 1989; Lieth et al., 2001; Chaudhry et al., 2002).
Медиаторы синтезируются в нейроне и запасаются в синаптических пузырьках - везикулах. В накоплении обоих медиаторов в везикулы участвуют везикулярные ферменты АТФазы, а также специализированные транспортеры. Везикулы транспортируют медиатор к пресинаптической терминали, из которой он выделяется в синаптическую щель. В щели медиатор активирует соответствующие рецепторы, расположенные на постсинаптической мембране, и удаляется различными способами.
Мембранные рецепторы представляют собой белковые комплексы на поверхности клеточных мембран, выполняющие сигнальную функцию. Передача сигнала клетке происходит при активации рецепторов. Различают ионотропные и метаботропные рецепторы. Ионотропные рецепторы являются ионными каналами, при активации которых возникает трансмембранный ионный ток. Канал формируют белковые субъединицы. В состоянии покоя каналы обладают низкой вероятностью открытия, которая значительно увеличивается при воздействии на рецептор соответствующим медиатором (Purves et al., 2012). Группа ионотропных рецепторов опосредует быстрые трансмембранные ионные токи (Nicholls et al., 2012). Метаботропные рецепторы запускают метаболические реакции внутри клетки. При воздействии на них соответствующим медиатором активируется система вторичных посредников, например, G-белков, которые инициируют каскад реакций, в результате чего меняется функциональное состояние клетки. ГАМК и глутамат могут активировать как ионотропные, так и метаботропные рецепторы (Purves et al., 2012).
Известны два типа ионотропных рецепторов ГАМК - ГАМКА и ГАМКС. Рецепторы этих типов состоят из пяти белковых субъединиц (Bormann, 2000; Chebib et al., 2000).
Субъединицы ГАМКА-рецепторов объединяют в классы на основании их биохимического сходства (Sieghart et al., 1995). Существует семь таких классов субъединиц: , , , , , и . Каждый класс включает в себя различные изоформы субъединиц. Эти изоформы принято обозначать цифрами. Молекулярная масса субъединиц около 50 кДа. Субъединицы содержат сайты фосфорилирования, посредством которых регулируется активность рецептора (Hines et al., 2012). В состав рецептора могут входить субъединицы разного типа (Sieghart et al., 2002). Чаще всего в состав рецептора входят субъединицы не менее трех типов (Olsen et al., 2009). Типы , , субъединиц встречаются чаще всего в составе рецептора. В литературе недостаточно сведений о распространенности , , типов субъединиц в структуре нативных ГАМКА-рецепторов. На формирование субъединичного состава рецепторов влияет множество факторов (Succol et al., 2012; Gutirrez et al., 2014). Например, он может отличаться в зависимости от типа нейронов. Так, -субъединица обнаружена в нейронах репродуктивной системы, но отсутствует в клетках мозга млекопитающих (Hedblom et al., 1997). Доказано, что субъединичный состав ГАМКА-рецепторов может влиять на кинетику трансмембранных ионных токов.
Активация агонистом ГАМКА-рецепторов приводит к открытию ионных каналов (Sodickson et al., 1996; Slesinger et al., 1997; Fritschy, 2014) и возникновению хлорной и незначительной карбонатной (НСО3) проводимостей (Hajos et al., 2000; Kim, 2009).
Агонистами ГАМКА-рецепторов являются: мусцимол (Holmes et al., 2013), THIP (Vanini et al., 2013), таурин (Furukawa et al., 2014), -аланин (Kuver et al., 2012). Бикукуллин (Egawa et al., 2013), габазин (SR95531) (Wlodarczyk et al., 2013), пикротоксин (Jonaidi et al., 2012) и TBPS (Dansey et al., 2010) являются антагонистами.
Торможение, которое развивается в результате воздействия ГАМК на постсинаптические ГАМКА-рецепторы, разделяют на фазовое и тоническое. (Duguid et al., 2012). Фазовое торможение является коротковременным увеличением синаптического ингибирования, возникающее в ответ на везикулярное выделение ГАМК (Semyanov, 2002). Тоническое торможение опосредуется рецепторами, расположенными внесинаптически, чаще всего активирующимися в результате спилловера. Для этих рецепторов характерно высокое сродство к ГАМК (Farrant et al., 2005; Glykys et al., 2007). ГАМКА-опосредованное тоническое торможение играет важную роль в функционировании ЦНС млекопитающих (Rossi et al., 2003; Martin et al., 2010). Например, уровень тонического торможения регулирует синаптическую интеграцию в мозжечке (Chadderton et al., 2004;), таламусе и неокортексе (Ye et al., 2013). А также он влияет на уровень тревожности и другие поведенческие аспекты (Maguire et al., 2005).
Активация агонистом ГАМКС-рецепторов приводит к открытию хлорных каналов (Perfilova et al., 2011; Chebib et al., 2004). ГАМКА- и ГАМКС-рецепторы имеют много общего в структурной организации. Для обоих схожих типов рецепторов предполагается наличие рецептора-предшественника, который в дальнейшем претерпел дифференциацию, при этом ГАМКС-рецепторы считаются близкими к исходной форме (Zhang et al., 2001). ГАМКА-рецепторы широко представлены в нервной системе млекопитающих, ГАМКС-рецепторы обнаружены в сетчатке позоночных.
Взаимодействие гамк и глутаматной медиаторных систем
Нейромедиаторы часто имеют совместную локализацию в нейронах и высвобождаются в синаптическую щель совместно (Zhang et al., 2007). Например, было выявлено совместное выделение ГАМК и глицина в спинном мозге (Jonas et al., 1998; O Brien et al., 1999) и в слуховой коре (Kotak et al., 1998), глутамата и ацетилхолина в спинном мозге (Li et al., 2004; Nishimaru et al., 2005), глутамата и серотонина в продолговатом мозге (Johnson et al., 1994) глутамата и допамина в конечном мозге (Barreiro-Iglesias et al., 2009; Hnasko et al., 2010) и ряда других медиаторов в различных сочетаниях. Выявлено совместное выделение ГАМК и глутамата из пресинаптических терминалей нейронов различных отделов ЦНС (Sandler et al., 1991; Uchigashima et al., 2007). Например, зернистых клеток зубчатой извилины, слуховой коры, обонятельной луковицы (Gutierrez et al., 2003), медиального ядра трапециевидного тела (MNTВ) (Sanes et al., 2000; Seal et al., 2006) и мозжечка (Kim K et al., 2003).
Пресинаптические рецепторы глутамата и ГАМК регулируют высвобождение нейромедиаторов в синаптическую щель. Например, пресинаптические ГАМКБ-рецепторы регулируют выделение медиаторов в клетках Гольджи (Mitchell, Silver, 2000а; Kulik et al., 2002) и других типах нейронов (Morishita, Sastry, 1995; Mouginot et al., 1998; Jensen et al., 1999; Mitchell, Silver, 2000б; Fearon et al., 2003; Porter, Nieves, 2004; Chen, Yung, 2005); метаботропные рецепторы глутамата регулируют высвобождение ГАМК в моховидных волокнах (Chen, Bonham, 2005; Liu et al., 2014). Постсинаптические ионотропные и метаботропные рецепторы могут располагаться вблизи друг друга (Waldvogel et al., 2004). Колокализация рецепторов ГАМК и глутамата выявлена в различных структурах ЦНС. Например, в лимбической системе (Hodge, Cox, 1998), в частности в амигдале, гиппокампе (Besheer, Hodge, 2005), а также в ядрах базального ганглия (Smith et al., 2000; 2001).
Совместное выделение медиаторов, колокализация рецепторов разного типа вместе с другими факторами создают предпосылки для самых разнообразных взаимодействий эффектов активации рецепторов глутамата и ГАМК и модуляции сигналов.
Существуют отрывочные сведения о регуляции на постсинаптическом уровне физиологических эффектов одних рецепторов другими. Например, показана возможность взаимовлияния процессов запускаемых активацией метаботропных рецепторов (Rives et al., 2009; Pin et al., 2009; Pacey et al., 2011; Samengo et al., 2013; Kantamneni, 2015), ионотропных рецепторов (Shrivastava et al., 2011; Li et al., 2002; 2003), а также регуляции эффектов ионотропных рецепторов метаботропными (Tabata et al., 2006; 2010; Neale et al., 2006). Многие клетки получают как ГАМК- так и глутамат-опосредованные воздействия от разных синапсов, что обуславливает интерес к процессу интеграции разнонаправленных стимулов.
При коактивации ионотропных рецепторов разного типа происходит суммация трансмембранных ионных токов, которая по характеру бывает линейной и нелинейной. Суммация считается линейной, когда при действии разными медиаторами суммарный ток равняется по амплитуде алгебраической сумме токов, опосредованных действием этих медиаторов по отдельности. В том случае, когда значение сумарного тока отклоняется от алгебраической суммы токов, суммация считается нелинейной.
Нелинейная суммация токов, опосредованных ионотропными рецепторами, выявлена при взаимовлиянии Р2Х2 рецепторов АТФ и 5НТЗ рецепторов серотонина (Boue-Grabot et al., 2003), Р2Х и никотиновых рецепторов ацетилхолина (Barajas-Lopez et al., 1998; Searl et al., 1998; Khakh et al., 2000), P2X и капсаициновых (Piper et al., 2000), P2X2 и ГАМКА-рецепторов (Sokolova et al., 2001; Lee et al., 2010), P2X3 и ГАМКА-рецепторов (Toulm et al., 2007), P2X4 и ГАМКА-рецепторов (Jo et al., 2011 a,б), глициновых и ГАМКА-рецепторов (Li et al., 2002; 2003; Russier et al., 2002). Одним из эффектов нелинейной суммации токов является окклюзия. Она проявляется тем, что при совместной аппликации медиаторов, пиковая амплитуда тока меньше, чем алгебраическая сумма токов, вызванных индивидуальными аппликациями нейромедиаторов. Эффект окклюзии малоизучен и выявлен на ограниченном круге объектов. Например, на нейронах спинного мозга лягушки при взаимодействии ионных токов ГАМКА- и глициновых рецепторов (Амахин и др., 2009; 2011; 2012).
Влияние активации метаботропных рецепторов на эффекты ионотропных рецепторов ГАМК показано на зернистых клетках зубчатой извилины. В этих нейронах ГАМКБ-рецепторы колокализованы с внесинаптическими ГАМКА-рецепторами. В структуре последних присутствует субъединица. Выявлено, что между колокализованными рецепторами существует взаимодействие, опосредованное этой субъединицей. Предполагается, она является мишенью для посредников внутриклеточных сигнальных путей, которые запускаются ГАМКБ-рецепторами. Совместная активация содержащих субъединицу внесинаптических ионотропых и метаботропных рецепторов ГАМК ведет к развитию тонического торможения. Стоит отметить, что ГАМКБ-рецепторы не модулировали эффектов синаптических ГАМКА-рецепторов: при их совместной активации развивалось фазическое торможение. Это может быть связано с тем, что большое количество ионотропных ГАМКА-рецепторов «синаптического типа» содержат субъединицу, которая меньше подвержена влияниям модулирующих процессов со стороны метаботропных рецепторов (Tao et al., 2013; Connelly et al., 2013а).
Эффект модуляции ГАМКБ-рецепторами ГАМКА-рецепторов обнаружен не только в зернистых клетках зубчатой извилины, но и в группе таламокортикальных нейронов (Errington et al., 2011а,б,с) и зернистых клетках мозжечка (Connelly et al., 2013б). На срезах префронтальной коры головного мозга крыс показано, что активация постсинаптических ГАМКБ-рецепторов увеличивает тонический ток, опосредованный ГАМКА-рецепторами (Wang et al., 2010).
Другим примером влияния активации ГАМКБ-рецепторов является усиление магниевого блока NMDA рецепторов (Morrisett et al., 1991; Otmakhova et al., 2004), что ведет к угнетению ионных токов.
В нейронах спинного мозга лягушки ГАМКБ-рецепторы модулируют ионный ток, вызванный аппликацией глицина: при коактивации соответствующих рецепторов наблюдается обратимое снижение пиковой амплитуды ответа на 10-60% (Цветков и др., 2007; 2008).
Активированные метаботропные рецепторы глутамата способны влиять на токи вызванные ионотропными глутаматными рецепторами (Cho et al., 2002а,б). Например, усиливать кальциевую проводимость гетеромерных каинатных рецепторов в обонятельной коре (Cho et al., 2003), гиппокампе и при экспресии таких рецепторов в ооцитах шпорцевой лягушки (Rojas et al., 2013а,б).
Влияние концентрации агонистов на пиковую амплитуду ответов
Несмотря на различия в значении командного потенциала, результаты в целом аналогичны полученным в предыдущей серии экспериментов: ответ нейрона на аппликацию ГАМК был меньше, чем ответ на аппликацию смеси медиаторов, который был практически равен арифметической сумме индивидуальных ответов, что говорит об отсутствии окклюзии в данном случае. 4.4.3. Особенности суммации ответов при увеличении концентрации нейромедиаторов
Для исследования особенностей суммации ответов на аппликации насыщающих концентраций нейромедиаторов использовались оба внутрипипеточных раствора. Так же, как и в предыдущих сериях экспериментов по изучению суммации ответов, при использовании пипеточного раствора №1 мембранный потенциал фиксировался на -10 мВ, а при использовании пипеточного раствора №2 – на -80 мВ. При регистрации с использованием пипеточного раствора №1 и при аппликации глутамата и ГАМК в концентрации 5 мМ (оба), наблюдаемый результат суммации был практически идентичен результату с меньшими концентрациями (200 мкМ), то есть наблюдалась полная окклюзия. На рисунке 4.22 приведены пиковые амплитуды ответов нейрона на аппликацию ГАМК (5 мМ) и совместную аппликацию глутамата и ГАМК (5 мМ + 5 мМ). Ответы зарегистрированы с применением пипеточного
На рисунке 4.23 приведено соотношение усредненных пиковых амплитуд ответов на аппликацию ГАМК, глутамата и совместную аппликацию этих веществ. Регистрация произведена с применением пипеточного раствора №1. Пиковые амплитуды, нормированные по арифметической сумме ответов на индивидуальные аппликации глутамата и ГАМК (IGABA + IGlut) достигали значений для ГАМК-опосредованного ответа 0.846±0.036 (n=5); для опосредованного аппликацией смеси ответа 0.865±0.043 (n=5); для глутамат-опосредованного ответа 0.154±0.036 (n=5). Значения нормированных пиковых амплитуд также схожи с аналогичными полученными данными в ходе исследования особенностей суммации ионных токов с меньшими концентрациями.
Соотношение нормированных усредненных пиковых амплитуд ответов на аппликацию ГАМК, глутамата и совместную аппликацию этих веществ (n=5) Как видно из диаграммы, пиковые амплитуды на аппликацию ГАМК и совместную аппликацию глутамата и ГАМК совпадают (различия статистически недостоверны по парному критерию Стьюдента). Наблюдается полная окклюзия ответов.
При регистрации ответов на аппликацию больших концентраций агонистов с использованием раствора №2, картина существенно меняется. На рисунке 4.24 приведены ответы нейрона на аппликацию ГАМК (5 мМ) и совместную аппликацию глутамата и ГАМК (5 мМ + 5 мМ).
Средние значения пиковой амплитуды ответа на аппликацию ГАМК (5 мМ) и аппликацию смеси глутамата и ГАМК (5 мМ+5 мМ) составляли -2.754±0.456 нА (n=8), -2.355±0.392 нА (n=8), соответственно. Различия статистически достоверны (p=0.008, Wilcoxon signed-rank test). Зарегистрировано с применением пипеточного раствора №2. Ответы нейрона на аппликацию ГАМК (5 мМ) и совместную аппликацию глутамата и ГАМК (5 мМ + 5 мМ) Диаграмма, отражающая соотношение пиковых амплитуд ответов на аппликацию ГАМК (5 мМ), смеси глутамата и ГАМК (5 мМ + 5 мМ) и глутамата (5 мМ), зарегистрированных с применением пипеточного раствора №2, приведена на рисунке 4.25. Диаграмма отражает усредненные пиковые амплитуды, нормированные по арифметической сумме ответов на индивидуальные аппликации глутамата и ГАМК (IGABA + IGlut), которые составляли для ГАМК 0.834±0.023 (n=8), для смеси медиаторов 0.724±0.034 (n=8), для глутамат-опосредованного ответа 0.166±0.023 (n=8).
Из диаграммы видно, что пиковая амплитуда ответа на аппликацию смеси ГАМК (5 мМ) и глутамата (5 мМ) достоверно меньше (p=0.008, Wilcoxon signed-rank test), чем амплитуда ответа на аппликацию ГАМК (5 мМ), то есть наблюдается полная окклюзия. По мере десенситизации ответа окклюзия пропадает, и ответ на аппликацию смеси становится больше ответа на аппликацию ГАМК.
Рис. 4.25 - Соотношение пиковых амплитуд ответов на аппликацию ГАМК, смеси глутамата и ГАМК и глутамата (n=8). Ответы зарегистрированы с применением пипеточного раствора №2 Ниже приведены результаты серии экспериментов, в которых проводились аналогичные аппликации нейромедиаторов, но в других концентрациях с применением обоих пипеточных растворов. При использовании пипеточного раствора №1 мембранный потенциал фиксировался на -10 мВ, а при использовании пипеточного раствора №2 – на -80 мВ. Регистрировались ответы на аппликацию глутамата (5 мМ), ГАМК (0.2 мМ) и аппликацию смеси этих веществ в указанных концентрациях.
В случае применения пипеточного раствора №1, на основе хлорида цезия, наблюдалась частичная окклюзия ответов: значение амплитуды ответа, опосредованного аппликацией смеси нейромедиаторов, в указанной концентрации было меньше арифметической суммы амплитуд ответов на индивидуальные аппликации, но больше чем значение амплитуды ответа на аппликацию только лишь ГАМК (IGABA IGABA+Glut IGABA + IGlut).
На рисунке 4.26 представлены соотношения нормированных значений пиковых амплитуд ответов на аппликацию ГАМК (0.2 мМ), смеси глутамата и ГАМК (0.2 мМ + 5 мМ) и глутамата (5 мМ), зарегистрированные с применением пипеточного раствора №1. Пиковые амплитуды, нормированные по арифметической сумме ответов на индивидуальные аппликации глутамата и ГАМК, составили 0.833±0.035 (n=5), 0.887±0.059 (n=5), 0.167±0.035 (n=5), соответственно.
Характеристика гамк- и глутамат-опосредованных ответов изолированных нейронов префронтальной коры головного мозга крысы
Аппликации ГАМК способны приводить не только к активации ионотропных рецепторов, но и соответствующих метаботропных рецепторов. Это создает предпосылки для взаимной модуляции этих рецепторов. Модуляция может реализоваться через различные внутриклеточные пути. Активация ГАМКБ-рецепторов может приводить к ряду внутриклеточных реакций, одной из которых является снижение активности аденилатциклазы, и как следствие, протеинкиназ А и С (Yu et al., 1997; Bagley, 2014). Активация этого внутриклеточного каскада ведет к разнообразным изменениям активности внутриклеточных сигнальных молекул (Kawaguchi et al., 2002; Kubota et al., 2003). Среди эффектов активации ГАМКБ-рецепторов может быть модуляция ионотропных рецепторов, поскольку многие из них имеют сайты для воздействия внутриклеточных сигнальных молекул (Kellenberger et al., 1992; McDonald et al., 1998). Так, внутриклеточные домены различных субъединиц ГАМКА-рецепторов имеют сайты специфичные к протеинкиназе А, С, G, кальций/кальмодулин-зависимой киназе СаКII, тирозин-киназам (Machu et al., 1993; McDonald et al., 1994). Таким образом, важную роль для реализации модулирующего эффекта может играть наличие тех или иных сайтов для воздействия внутриклеточных сигнальных молекул в структуре рецептора (McDonald et al., 1997).
Реализация модулирующего влияния со стороны метаботропных рецепторов может в значительной степени зависеть от субъединичного состава ГАМКА-рецепторов. Например, показано, что ГАМКА-рецепторы могут взаимодействовать с различными внутриклеточными белками при определенных условиях. Это способствует модуляции ГАМКА-рецепторов метаботропными рецепторами ГАМК (Gerrow, Triller, 2014). Но для осуществления такого взаимодействия необходимо наличие в структуре ионотропного рецептора определенных субъединиц. Например, (Tao et al., 2013) или субъединиц (Balasubramanian et al., 2004). Это было показано на зернистых клетках зубчатой извилины и клетках линии НЕК-293, соответственно. На нейронах мозжечка было показано, что ГАМКА-рецепторы должны содержать 1 и 2 субъединицы для осуществления процесса модуляции (Balasubramanian et al., 2004). К сожалению, отсутствуют данные о субъединичном составе ГАМКА-рецепторов префронтальной коры головного мозга крысы, которые позволили бы корректно соотнести наблюдаемый эффект модуляции с типом субъединиц.
В нейронах Пуркинье мозжечка ГАМКБ-рецепторы модулируют постсинаптические АМРА-рецепторы не только за счет активации Gi/Go белков, но и посредством межрецепторного взаимодействия, не зависящего от G-белков (Tabata et al., 2006; 2010). Так же было продемонстрировано непосредственное молекулярное взаимодействие ионотропных ГАМКА- и метаботропных ГАМКБ-рецепторов (Balasubramanian et al., 2004).
Предполагается, что межрецепторное взаимодействие между метаботропными и ионотропными рецепторами может реализовываться различными способами. Одним из таких способов взаимодействия ионотропного и метаботропного рецепторов является колокализация этих рецепторов (Balasubramanian et al., 2004). Колокализация метаботропных и ионотропных рецепторов ГАМК может являться предпосылкой для формирования ассоциации субъединиц рецепторов между собой. Возможность формирования ассоциации между этими рецепторами была экспериментально продемонстрирована на клетках линии НЕК-293 (Balasubramanian et al., 2004). Метаботропные рецепторы ГАМК этих клеток содержат в своей структуре изоформу субъединицы В1 - В1. Эта изоформа способна формировать ассоциацию с изоформой субъединиц ионотропного рецептора ГАМК. Предполагается, что ассоциированные ГАМКБ- и ГАМКА-субъединицы способны формировать функциональные микродомены. Эти микродомены обладают стабилизирующим действием на ионотропные рецепторы ГАМК, а также меняют кинетику работы ионных каналов при их активации. Предполагается, что ассоциированные рецепторы выполняют модулирующую функцию (Balasubramanian et al., 2004). Если исследуемые нейроны несли на своей мембране ассоциированные рецепторы, то это теоретически могло приводить к различным проявлениям модуляции ГАМКА-опосредованных токов ГАМКБ-рецепторами.
Данные о наличии или отсутствии ассоциированных рецепторов на мембране пирамидных нейронов отсутствуют, однако их возможная роль в модуляции ответов может рассматриваться. Возможно, увеличение амплитуды ГАМК-опосредованных ответов на фоне предварительного воздействия баклофеном связано с изменением активности каких-либо неидентифицированных биохимических посредников в результате длительной активации метаботропных рецепторов (Fairfax et al., 2004). Для того чтобы определить вклад различных посредников в увеличение амплитуды ответов требуется проведение молекулярных исследований. На сегодняшний день нет точных данных о конкретных путях воздействия ГАМКБ-рецепторов на ГАМКА-рецепторы, которые бы приводили к описанным эффектам. Мы рассмотрели возможные механизмы, однако, возможно, существуют и другие пути взаимодействия метаботропных ГАМК-рецепторов с ионотропными рецепторами ГАМК, модулирующие их эффект.