Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Обзор литературы 10
Глава 1. Цикл бодрствование-сон, его регуляция и функции 10
1.1. Организация цикла бодрствование-сон 10
1.2. Центральная регуляция суточного цикла бодрствование-сон у млекопитающих 13
1.2.1. Системы активации и поддержания бодрствования 13
1.2.2. Системы активации и поддержания медленного сна 22
1.2.3. Роль вентролатеральной преоптической области в регуляции сна 26
1.2.4. Системы активации и поддержания парадоксального сна 29
1.3. Современные представления о функциях сна 37
1.3.1. Когнитивные функции: память и синаптическая пластичность 37
1.3.2. Восстановительная функция сна 40
Резюме 46
Глава 2. Белки теплового шока и их роль в модуляции сна 47
2.1. Классификация белков теплового шока 47
2.2. Молекулярный механизм действия шаперонов семейства HSP70 50
2.3. Роль шаперонов в восстановительных процессах после депривации сна 52
2.3.1. Индукция шаперонов как ответ на неправильно свернутые белки 52
2.3.2. Влияние депривации сна на экспрессию шаперонов 53
2.4. Экзогенный шаперон Hsp70 в модуляции цикла бодрствование-сон 55
Резюме 57
Раздел 2. Материалы и методы исследования 59
1. Объект исследования 59
2. РНК-интерференция 59
3. Хирургические операции 61
4. Регистрация электрофизиологических параметров 61
5. Идентификация состояний цикла бодрствование-сон 62
6. Депривация сна 63
7. Локализация микроинъекций – световая и конфокальная микроскопия 63
8. ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг 64
9. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 65
10. Статистическая обработка результатов 69
Раздел 3. Результаты исследования 70
Глава 1. Изменения характеристик суточного цикла бодрствование-сон, сопряженные со снижением содержания шаперона Hsp70 в преоптической области гипоталамуса 70
1.1. Оценка эффективности работы лентивектора ЛВК-Hsp70 70
1.2. Изменения временных характеристик сна и бодрствования в темной и светлой фазах суток в условиях недостатка шаперона Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса 74
1.3. Влияние снижения содержания шаперона Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса на медленноволновую активность и представленность глубокого медленного сна 79
Резюме 81
Глава 2. Восстановление сна после его тотальной депривации в условиях снижения содержания Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса 82
2.1. Изменения временных характеристик медленного сна у крыс после тотальной депривации сна 82
2.2. Изменения медленноволновой активности и представленности глубокого медленного сна у крыс после тотальной депривации сна 84
2.3. Изменения временных характеристик парадоксального сна у крыс после тотальной депривации сна 85
Резюме 87
Глава 3. Особенности экспрессии гена Hspa1 в естественном суточном цикле бодрствование-сон и при селективной депривации парадоксального сна 88
3.1. Изменения экспрессии Hspa1 в естественном суточном цикле бодрствование-сон 88
3.1.1 Динамика представленности состояний суточного цикла бодрствование-сон в светлой и темной фазах суток 88
3.1.2 Экспрессия Hspa1 в суточном цикле бодрствование-сон 89
3.2. Изменения экспрессии Hspa1 при селективной депривации парадоксального сна 92
3.2.1. Влияние селективной депривации парадоксального сна на временные характеристики состояний цикла бодрствование-сон 92
3.2.2. Экспрессия Hspa1 при селективной депривации парадоксального сна 95
Резюме 97
Раздел 4. Обсуждение результатов 98
1. Роль индуцибельного шаперона Hsp70, содержащегося ВЛПО гипоталамуса, в модуляции суточного цикла бодрствование-сон 98
2. Восстановление сна после тотальной депривации в условиях хронического недостатка индуцибельного шаперона Hsp70 107
3. Индуцибельный шаперон Hsp70 в естественном суточном цикле бодрствование-сон и при селективной депривации парадоксального сна 110
Заключение 114
Выводы 117
Список цитируемой литературы 118
- Системы активации и поддержания бодрствования
- Классификация белков теплового шока
- Изменения временных характеристик сна и бодрствования в темной и светлой фазах суток в условиях недостатка шаперона Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса
- Индуцибельный шаперон Hsp70 в естественном суточном цикле бодрствование-сон и при селективной депривации парадоксального сна
Системы активации и поддержания бодрствования
Изучение центральных систем регуляции бодрствования и сна началось с работ Константина фон Экономо в начале ХХ века. В последующие годы методами стимуляции или разрушения локальных структур мозга была исследована восходящая активирующая ретикулярная система, обеспечивающая бодрствование.
К началу XXI века сложилось представление об иерархичности системы «центров» бодрствования в головном мозге [50], которые представлены главным образом холин-, глутамат-, моноамин- и пептидергическими популяциями клеток. Основное внимание уделялось моноаминергическим и холинергическим системам возбуждения, однако новые данные указывают, скорее, на их модулирующее влияние, в то время как главная роль, по-видимому, принадлежит «быстрым» нейротрансмиттерам – глутамату и ГАМК [51]. Восходящая ретикулярная активирующая система ствола мозга
В 1916 году невролог Константин фон Экономо начал изучать новое заболевание – летаргический энцефалит. У пациентов наблюдалась инсомния: несмотря на сильную усталость, они испытывали сложности с засыпанием и спали лишь несколько часов в день. Фон Экономо предположил, что ствол мозга поддерживает передний мозг в бодрствующем состоянии, а передняя часть гипоталамуса, наоборот, вызывает сон и является антагонистом возбуждающей системы ствола головного мозга. Позднее было показано, что восходящая система возбуждения, отвечающая за активацию бодрствования, начинается в ростральной части моста и проходит через ретикулярную формацию среднего мозга. Этот путь получил название восходящей ретикулярной активирующей системы, ВРАС [52]. Электрическая стимуляция ретикулярной формации у спящих кошек приводит к их пробуждению, а повреждения этой структуры вызывают постоянный сон, подобный коме [34].
Во второй половине ХХ века гистохимические и нейрофизиогические методы позволили детальнее изучить анатомию ВРАС, медиаторную специфичность входящих в неё групп нейронов и особенности их электрической активности в цикле бодрствование-сон. Сейчас ВРАС рассматривается как упорядоченная сеть отдельных ядер, которые обеспечивают активацию нервной системы и поддерживают бодрствование. Ключевые нейромедиаторы ВРАС – это ацетилхолин, моноамины (норадреналин, серотонин, гистамин и дофамин) и нейропептид орексин/гипокретин [54]. Холинергические нейроны моста и базальной части переднего мозга Основным источником восходящих путей из ствола мозга в таламус являются две группы ацетилхолин–продуцирующих клеток [55]: ножко-мостовое (pedunculopontine, PPT) и латеродорсальное ядро покрышки (laterodorsal tegmental, LTD). PPT и LDT иннервируют ретикулярное и интраламинарные ядра таламуса, латеральный гипоталамус, базальную часть переднего мозга (basal forebrain) и префронтальную кору [55,56]. Кроме того, PPT и LTD обеспечивают основную связь области на границе между средним мозгом и мостом с релейными ядрами таламуса. Релейные ядра таламуса представляют собой основной источник подкорковых глутаматергических афферентов, идущих к коре головного мозга; интраламинарное ядро и ядра средней линии также дают входы в кору [57]. Однако данных о том, что эти возбуждающие входы играют важную роль в запуске и поддержании бодрствования, немного [46].
Нейроны в PPT/LDT наиболее активны в течение бодрствования и парадоксального сна и менее интенсивно разряжаются во время медленноволновой фазы, что предполагает их участие в запуске активации коры головного мозга [58,59]. Интересно, что нейроны LDT усиливают частоту разрядов непосредственно перед переходом от медленноволновой кортикальной активности дельта 15 диапазона к более высоким частотам, то есть могут участвовать в инициации бодрствования [60]. Однако до сих пор неясно, насколько PPT и LDT необходимы для регуляции собственно бодрствования. Селективная активация этих холинергических нейронов с помощью оптогенетической методики во время медленного сна вызывает не пробуждение, а переход в парадоксальный сон [61].
Возбуждающие входы в кору идут также от холинергических нейронов, расположенных рострально – в базальной части переднего мозга. Холинергические нейроны прямо и опосредованно иннервируют пирамидные нейроны коры головного мозга, усиливая десинхронизацию ЭЭГ и активацию коры [62]. Большая часть нейронов базальной части переднего мозга активна во время бодрствования, причем паттерн их разрядов коррелирует со специфическими ритмами ЭЭГ. Однако, эти клетки только частично обеспечивают поддержание бодрствования: их повреждение с помощью иботеновой кислоты проявляется увеличением представленности дельта-волн на ЭЭГ без изменения количества бодрствования или сна, а более избирательное повреждение нейронов, продуцирующих ацетилхолин, лишь временно уменьшает продолжительность бодрствования и не влияет на частотный спектр ЭЭГ [63]. Подобно PPT и LDT, холинергические нейроны базальной части переднего мозга отвечают не только за бодрствование: избирательная активация этих клеток примерно с равной вероятностью приводит к переходу из медленного сна в парадоксальный или в бодрствование; при этом стимуляция во время бодрствования усиливает возбуждение [64]. В целом результаты работ по исследованию холинергических структур указывают на то, что нейроны ствола мозга, скорее, обеспечивают переход в парадоксальный сон, а клетки базальной части переднего мозга поддерживают общее возбуждение в центральной нервной системе [54].
Моноаминергические нейроны моста, среднего и промежуточного мозга Вторая ветвь ВРАС начинается от моноаминергических ядер верхней части ствола мозга и заднего гипоталамуса, активирует нейроны латеральной области гипоталамуса и базальных ганглиев переднего мозга и заканчивается в коре больших полушарий [65]. К моноаминергическим группам клеток относятся locus coeruleus (норадреналин), ядра шва (серотонин), туберомамиллярное ядро (гистамин), вентральное околоводопроводное серое вещество и вентральная тегментальная область покрышки (дофамин). Каждая моноаминергическая система посылает менее обширные по сравнению с холинергической, но не менее важные проекции в таламус, где они иннервируют интраламинарное и ретикулярное ядра [46]. Их аксоны идут также в другие отделы центральной нервной системы: кору больших полушарий, базальную часть переднего мозга, гипоталамус и ствол головного мозга. Нейроны всех моноаминергических ядер, кроме дофаминергических, наиболее активны во время бодрствования, снижают свою активность в фазе медленного сна и прекращают работу в течение парадоксального сна [40,66–69].
Locus coeruleus, или голубое пятно – это небольшая группа клеток, которая является основным источником норадреналина в головном мозге млекопитающих. Выброс норадреналина в коре усиливает активность пирамидных нейронов и вызывает кортикальное возбуждение, регистрируемое на ЭЭГ [70]. Введение норадреналина в желудочки мозга вызывает бодрствование [71], в то время как фармакологическое торможение норадренергических нейронов увеличивает медленный сон [72]. Оптогенетическая стимуляция нейронов голубого пятна, позитивных по тирозингидроксилазе, запускает немедленный переход из состояния сна в бодрствование и увеличение локомоторной активности [73]. Работа этих нейронов, вероятно, опосредует также переход от сна к бодрствованию, вызванный активацией орексиновых клеток гипоталамуса [74].
Нейроны дорсальных ядер шва вырабатывают главным образом серотонин, однако здесь представлены и другие типы клеток – дофамин-, ГАМК-, глутамат- и пептидергические. Роль серотонина в регуляции цикла бодрствование-сон зависит от подтипов рецепторов, которые могут обеспечивать поддержание бодрствования, подавление парадоксального сна или модулировать представленность медленного сна [75]. Дофаминергические нейроны в этой области активно разряжаются во время бодрствования; их оптогенетическая стимуляция запускает переход от сна к бодрствованию [76]. Вероятно, эти нейроны отвечают за пробуждение в ответ на сенсорные раздражители, так как их ингибирование снижает вероятность перехода из медленного сна в бодрствование в ответ на звуковой стимул [76].
Туберомамиллярное ядро, расположенное в гипоталамусе, – это единственный источник гистамина в головном мозге. Проекции этого ядра распространяются к различным зонам, участвующим в регуляции бодрствования и сна, включая базальную часть переднего мозга и вентролатеральную преоптическую область гипоталамуса [77]. Результаты исследований на мышах с нокаутом по гену гистидин-декарбоксилазы (фермент синтеза гистамина) противоречивы, изменения временных параметров сна и бодрствования у таких животных слабые [78,79]. Тем не менее, применение антигистаминных препаратов – антагонистов рецепторов типа Н1 – или отсутствие этих рецепторов приводит к уменьшению бодрствования и возрастанию медленного сна, а также к ослаблению поведенческой реакции животных на новизну [80,81]. Более того, локальное торможение гистаминергических нейронов туберомамиллярного ядра с помощью оптогенетики вызывает медленный сон [82]. В целом эти данные предполагают участие туберомамиллярного ядра в стабилизации бодрствования.
Классификация белков теплового шока
В 1962 году итальянский исследователь Ф. Ритосса обнаружил, что под действием высокой температуры (свыше 300оС) на политенных хромосомах слюнных желез дрозофилы образуются пуфы, появление которых указывает на активную транскрипцию генов в этих регионах [351]. В дальнейшем электрофоретический анализ показал, что это явление связано с активацией синтеза особой группы белков [352], которые были названы белками теплового шока [353]. Впоследствии было обнаружено, что нагревание клеток до невысокой температуры вызывает, параллельно с накоплением белков теплового шока, развитие устойчивости клеток к более сильным цитотоксическим воздействиям. Такое состояние получило название термотолерантности [354]. Нагревание клеточных систем или всего тела животных, которое способствует усилению экспрессии HSPs, их накоплению в тканях и повышению устойчивости организмов к последующему действию стрессорных факторов, получило название «теплового прекондиционирования». Этот метод до сих пор широко применяется для исследования белков теплового шока [23].
К настоящему времени показано, что белки теплового шока присутствуют в клетках всех исследованных видов, от бактерий до человека, и индуцируются не только тепловым воздействием, но и множеством других стрессорных факторов, включая гиперосмолярный шок, окислительный стресс, недостаток глюкозы, действие тяжелых металлов, органических растворителей, вирусные инфекции, психоэмоциональный стресс, бактериальный эндотоксин липополисахарид и другие [355]. В связи с этим белки теплового шока называют также стресс-белками [356], хотя синтез этих белков происходит не только при стрессе, но и в нормальных условиях. В эукариотических клетках усиление экспрессии их генов опосредуется факторами теплового шока (Heat Shock Factors, HSF), которые являются транскрипционными факторами и активируются при при гипертермии и других стрессорных воздействиях [357].
В основу классификации белков теплового шока положены различия в их молекулярных массах. Выделяют следующие семейства: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 (ко-шапероны Hsp70 - Hdj1 и другие), HSP32, малые HSP (HSP25-27) и убиквитины [358]. Каждое семейство белков теплового шока обладает характерными функциями в клетке. Большинство этих белков активно участвует в процессах синтеза и транспорта белков благодаря наличию шаперонной активности, речь о которой пойдет в следующем разделе. Белки теплового шока, кроме того, предотвращают накопление и агрегацию белковых молекул с неактивной структурой, способствуя защите клеток от действия повреждающих факторов.
Необходимо отметить, что у некоторых видов отдельные семейства белков теплового шока не представлены. Они заменяются белками со сходной структурой, но с иной молекулярной массой. Например, у дрозофил функции Hsp100 выполняет Hsp90. Кроме того, семейства белков теплового шока у разных видов могут включать в себя белки, кодирующиемые различным числом индивидуальных генов. Так, геном млекопитающих содержит 14-20 генов, относящихся к семейству HSP70, в то время как у Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster число таких генов составляет соответственно 10 и 4 [355].
Самым распространенным и к настоящему моменту наиболее изученным семейством белков теплового шока является HSP70, представителями которого у млекопитающих являются Hsp70 (конститутивная и индуцибельная формы), Grp78 и mtHsp70. Цитоплазматический индуцибельный Hsp70 – первый белок, названный шапероном (от франц. chaperon – «компаньон, наставник») [359]. Функции индуцибельного Hsp70 и конститутивного Hsc70 во многом сходны, однако синтез индуцибельной формы активируется при стрессе, в то время как для конститутивной формы характерно постоянное присутствие в цитоплазме клетки. Hsp70 кодируется геном без интронов, поэтому скорость его синтеза выше, чем у конститутивного [360].
Структура и функции основных представителей семейства HSP70 охарактеризованы в таблице 1 [18,360–364]. Гены данных белков обладают высокой гомологией в кодирующей области, в то время как последовательности в нетранслируемых регионах значительно отличаются друг от друга, что важно для регуляции экспрессии этих генов.
Изменения временных характеристик сна и бодрствования в темной и светлой фазах суток в условиях недостатка шаперона Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса
Для выявления динамики изменений во временных характеристиках сна и бодрствования, происходящих после введения ЛВК-Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса, все экспериментальные записи предварительно были разделены на три условных периода, исходя из имеющейся выборки:
1) от 5 до 15 суток после введения ЛВК -Hsp70;
2) от 16 суток до 1 месяца;
3) от 1 месяца до окончания эксперимента (73 сутки).
Последующий анализ данных показал, что в суточном цикле бодрствование-сон достоверные отличия от контроля обнаруживаются с шестого дня после введения ЛВК-Hsp70 и сохраняются до окончания эксперимента. Опытные записи в период от 30 до 73 дней после трансфекции клеток ЛВК-Hsp70 выполнены на двух животных, однако значимых различий между вторым и третьим условными периодами не выявлено; они объединяются в один промежуток времени – поздние сроки после введения ЛВК-Hsp70 (16-73 сут., 5 крыс, 20 записей), а первый период рассматривается в качестве ранних сроков (6-15 сут., 6 крыс, 17 записей).
Изменение общего времени состояний суточного цикла бодрствование-сон В условиях дефицита Hsp70 в вентролатеральной преоптической области гипоталамуса изменения в общем времени состояний сна и бодрствования происходят главным образом в темной фазе суток (с 17 до 05 ч), которая для крыс является активным периодом. На ранних сроках после введения ЛВК-Hsp70 (6-15 суток, рис. 10 А) бодрствование в течение темной фазы возрастает относительно контроля, а количество медленного сна уменьшается. Наблюдается тенденция к снижению парадоксального сна и дремоты, различия оказываются достоверными в последнем трехчасовом интервале темной фазы (02-05 ч).
В поздние сроки после введения ЛВК-Hsp70 (16 суток – 2.5 месяца, рис. 10 Б) возрастание бодрствования и уменьшение медленного и парадоксального сна сохраняются только в первой половине темной фазы (17-23 ч). В светлое (неактивное) время суток (05-17 ч) выявляются главные различия во временных представленности состояний сна и бодрствования между с ранним и поздним сроками после введения ЛВК-Hsp70. На ранних сроках (рис. 10 А) количество бодрствования и сна не отличается от контрольного уровня; отмечается небольшой прирост дремоты во второй половине светлой фазы (11-17 ч).
Через две недели после введения ЛВК-Hsp70 (рис. 10 Б) развиваются компенсаторные процессы, направленные в противоположную сторону. Представленность бодрствования снижается (05-14 ч), а количество сна увеличивается. Прирост медленного сна отмечается в интервале 05-08 ч, когда сон наиболее глубокий, а парадоксальный сон возрастает в более длительном интервале, с 0до 14 ч.
Суммарно за 12 ч темной фазы недостаток Hsp70 в вентролатеральной преоптической области гипоталамуса в течение 1-2.5 месяцев после введения ЛВК-Hsp70 приводит к значимому возрастанию бодрствования и уменьшению медленного и парадоксального сна, что отражается и на среднесуточной представленности состояний (рис. 11). На поздних сроках суммарно за 12 ч светлой фазы количество сна возрастает, а общее время бодрствования снижается. В результате в среднем за сутки количество парадоксального сна не отличается от показателей контрольной группы на протяжении всего эксперимента, а представленность медленного сна достоверно возрастает на поздних сроках, хотя все еще остается ниже контрольных значений.
Изменение распределения числа и длительности эпизодов сна и бодрствования
Изменение представленности состояний после введения ЛВК-Hsp70 в ВЛПО гипоталамуса – следствие перераспределения их эпизодов. В темной фазе суток (рис. 12 А) число эпизодов бодрствования средней длительности уменьшается, а число длинных эпизодов ( 2600 c) возрастает, в результате чего общее время бодрствования увеличивается. Представленность сна при этом сокращается благодаря снижению числа длинных эпизодов: от 80 до 450 с для медленного сна и от 80 до 250 с для парадоксального сна. Значимых изменений в числе и длительности эпизодов дремоты не наблюдается.
В светлой фазе суток (рис. 12 Б) проявляются различия между разными сроками после введения ЛВК-Hsp70. В ранний период распределение числа-длительности эпизодов бодрствования не сдвигается относительно контроля, а в поздний период по сравнению с ранним уменьшается число эпизодов длительностью 25-80 с, что приводит к снижению общего времени состояния. Изменение распределения эпизодов медленного сна в первые две недели после введения ЛВК-Hsp70 указывает на его фрагментацию: возрастает число более коротких эпизодов (45-80 с) и падает число длинных (450-800 с).
На поздних сроках распределение эпизодов медленного сна возвращается к контрольной кривой, благодаря чему увеличивается общее время состояния. Распределение эпизодов парадоксального сна на ранних сроках не меняется и сохраняется его нормальная представленность, а его прирост через две недели после введения ЛВК-Hsp70 обеспечивается повышением числа эпизодов длительностью 140-250 с. Значимых изменений в состоянии дремоты по этому показателю нет.
Таким образом, недостаток Hsp70 в вентролатеральной преоптической области гипоталамуса влияет на распределение числа и длительности эпизодов состояний цикла бодрствование-сон у крыс. В темной фазе суток прирост бодрствования обеспечивается поддержанием более длительных его эпизодов, сокращение представленности медленного и парадоксального сна происходит вследствие уменьшения числа длинных эпизодов этих состояний. Компенсаторные изменения, наблюдаемые в светлой фазе суток через две недели после введения ЛВК-Hsp70, проявляются в возвращении распределения эпизодов медленного сна к норме и снижении числа эпизодов бодрствования.
Индуцибельный шаперон Hsp70 в естественном суточном цикле бодрствование-сон и при селективной депривации парадоксального сна
Длительное бодрствование и тотальная депривация покоя/сна приводят к накоплению белковых молекул с нарушенной пространственной укладкой, что является признаком клеточного стресса и обуславливает экспрессию шаперонов и подавление синтеза других белков в мозге [15]. Работа шаперонной системы противодействует конформационным изменениям белков и поддерживает ключевую функцию медленного сна – ускорение синтеза белков и восстановления протеостазиса клеток [4,8]. Так как экспрессия генов самих белков теплового шока во время медленноволнового сна ограничена [25], возможно истощение резервов шаперонов, накопленных за время бодрствования, особенно в последних циклах сна.
С другой стороны, за стадией медленного сна обычно следует стадия парадоксального. Для парадоксального сна характерны активация мозга и изменения в работе висцеральных систем, включая перестройку кровообращения, повышение температуры мозга, аритмичность дыхания и сердцебиения [344,345], что может рассматриваться как внутренний стрессорный фактор [37], который создаёт условия для усиления экспрессии Hsp70 и других шаперонов в мозге [24]. Показано также, что в нестрессовых условиях микроинъекции рекомбинантного Hsp70 в III желудочек мозга или ретикулярное оральное ядро моста крыс уменьшают представленность парадоксального сна [19,435], а системное введение индуктора Hsp70 геранилацетона подавляет восстановление парадоксального сна после тотальной депривации [436].
Однако при обосновании гипотез о важной роли молекулярных шаперонов в биосинтезе белков и восстановлении сна вопрос закономерного чередования медленного и парадоксального сна не рассматривается, и в современной мировой литературе отсутствуют данные об изменениях экспрессии эндогенного Hsp70 в суточном цикле бодрствование-сон в зависимости от состояния. Это связано с тем, что в исследованиях, направленных на изучение роли шаперонов в регуляции сна [4,14,25,27,28], состояние сна обычно определяется по поведенческим признакам, а медленный и парадоксальный сон не дифференцируются. Таким образом, остается неизвестным, какой вклад в выполнение восстановительной функции сна вносит парадоксальный сон и какую роль в этом играют его временные и количественые взаимоотношения с медленным сном.
В рамках настоящей работы мы объединили регистрацию полисомнограмм с оценкой уровня экспрессии гена Hspa1, кодирующего шаперон Hsp70, методом ПЦР и определением содержания белка Hsp70 с помощью иммуноблоттинга, чтобы определить, возможна ли индукция шаперона Hsp70 не только в бодрствовании [25,27], предшествующем глубокому медленному сну, но и в парадоксальном сне, следующем за медленным в цикле сна и возрастающем во второй половине неактивной фазы суток. Это позволило изучить особенности экспрессии эндогенного шаперона Hsp70 в головном мозге крыс в естественном суточном цикле бодрствование-сон и при нарушении временных соотношений между медленным и парадоксальным сном.
Впервые установлено, что во второй половине неактивной фазы суток, когда общее время парадоксального сна в 6 раз выше, чем в активной фазе, содержание мРНК Hsp70 в NRPO во время парадоксального сна возрастает в 3 раза по сравнению с бодрствованием. При этом значимых изменений в содержании шаперона Hsp70 в этой временной точке не выявлено, что может быть следствием отставания в накоплении новосинтезированного белка от усиления экспрессии соответствующего гена. В клетках млекопитающих возрастание уровня индуцибельного Hsp70, достаточное для детекции методом иммуноблоттинга, происходит только через 3-6 часов после теплового прекондиционирования или введения индуктора шаперонов U-133 [437–439], хотя транскрипционная активация наблюдается уже в течение часа, включая первые 20 минут после теплового шока [439,440]. Вероятно, в наших экспериментах увеличение содержания Hsp70 в NRPO происходило значительно позже, чем усиление экспрессии гена Hspa1, или не достигало порогового уровня, необходимого для определения достоверных различий с помощью иммуноблоттинга.
NRPO входит в систему центральной регуляции парадоксального сна. Это единственная структура, разрушение которой связано с потерей электрофизиологических признаков парадоксального сна [220]. Однако в пределах NRPO найдены холин-, ГАМК-, глутамат-, катехоламин- и гистаминергические афференты, включенные в исполнительный контроль не только парадоксального сна, но также бодрствования и медленного сна, что может вносить вклад в обнаруженную нами вариабельность экспрессии гена Hspa1 между животными [218,220]. Кроме того, при анализе высокой вариабельности экспрессии Hspa1 между животными следует учитывать, что она может быть связана с особенностями взятия ткани головного мозга и, соответственно, с вовлечением PS-on нейронов, локализованных в разных отделах NRPO (см. часть 1.2.4. раздела «Обзор литературы»).
Возрастание уровня мРНК Hsp70 происходит через 5-7 ч после максимального повышения глубокого медленного сна в начале неактивной фазы суток, и общее время медленного сна в период максимальной представленности парадоксального сна во второй половине этой фазы значительно превышает общее время парадоксального сна (рис. 36). Подобные взаимоотношения между медленным и парадоксальным сном характерны многих видов теплокровных животных [31,37,39,344,441], а также частично сохраняются и в период «отдачи» сна после его тотальной депривации у крыс. Такая задержка может отражать молекулярные механизмы взаимоотношений между медленным и парадоксальным сном в суточном цикле сна. Латентный период может быть обусловлен накоплением в глубоком медленном сне белков с нарушенной укладкой, стимулирующих экспрессию шаперонов [383], а также длительным временем, необходимым для синтеза и повышения в клетках содержания Hsp70 [355]. Полученные данные позволяют предполагать, что экспрессия гена Hspa1 реализуется в условиях парадоксального сна и является одной из функций этого состояния, необходимой для «исправления» дефектных белков. Возможно, что экспрессия гена Hspa1 касается прежде всего тех белков с нарушенной укладкой, которые накапливаются при интенсивном синтезе белков во время глубокого медленного сна в начале неактивной фазы суток.
Исходя из полученных данных, представлялось целесообразным выяснить, влияет ли нарушение временных взаимоотношений между медленным и парадоксальным сном на экспрессию индуцибельного шаперона Hsp70. Согласно гипотезе, парадоксальный сон рассматривается как «археободрствование» и «внутренний стрессор» организма, во время которого происходит интенсивная эндогенная активация различных систем мозга [37], стимулирующая, вероятно, и экспрессию молекулярных шаперонов [24]. В связи с этим мы изучили изменения уровня мРНК и белка Hsp70 в головном мозге крыс при подавлении парадоксального сна во время его селективной депривации и возрастании этого состояния во время феномена «отдачи» после депривации.
С целью определить оптимальную длительность избирательной депривации парадоксального сна испытаны три срока – 2, 4 и 6 ч. Депривация парадоксального сна проводилась таким образом, чтобы пик «отдачи» этого состояния приходился на суточный максимум этого состояния в естественном суточном цикле бодрствование-сон. Выраженной «отдачи» медленного сна не наблюдалось ни по временным, ни по спектральным характеристикам, несмотря на подавление медленного сна в течение депривации в результате увеличения попыток к переходу в парадоксальный сон. За 6 ч периода восстановления суммарное количество парадоксального сна достоверно увеличивалось относительно контроля только после 6-часовой селективной депривации, поэтому эта длительность была выбрана для дальнейшего исследования экспрессии Hsp70.
В динамике такой селективной депривации «давление» парадоксального сна усиливается и общее время этого состояния, представленного короткими эпизодами по 10-20 с, к концу депривации постепенно увеличивается; наибольшее повышение общего времени парадоксального сна в период «отдачи» достигает 19% в первые 2 ч после депривации, что на четверть превышает естественный суточный максимум. При сравнении с контролем наблюдается тенденция к усилению увеличению содержания мРНК Hsp70 в сенсомоторной коре, преоптической области гипоталамуса и NRPO во время селективной депривации парадоксального сна, что указывает на возможный вклад подавления этого состояния в повышение уровня шаперонов, которое наблюдается при тотальной депривации сна [14,27,28,324,442,443]. Однако, по сравнению с периодом сразу после окончания 6 ч селективной депривации уровень экспрессии Hsp70 в исследованных структурах в период наибольшей «отдачи» парадоксального сна не меняется.