Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1 Регуляторная функция газообразных посредников 14
2.2 Роль сероводорода в регуляции сердечно-сосудистой системы 19
2.2.1 Свойства, синтез и эндогенные концентрации сероводорода в сердечно-сосудистой системе 19
2.2.2 Эффекты и механизмы действия сероводорода на хронотропную и инотропную функцию сердца 23
2.2.3 Взаимодействие между сигнальными путями NO и H2S 26
2.2.4 Кардиопротекторные эффекты сероводорода 27
2.3 Особенности клеточных механизмов регуляции сократимости миокарда мыши 30
2.3.1 Роль К+ каналов 32
2.3.2 Роль Са2+ каналов 38
2.3.3 Роль адренорецепторов 42
2.3.4 Роль мускариновых ацетилхолиновых рецепторов 45
2.3.5 Роль NO 49
3.Материалы и методы 52
3.1 Объект исследования 52
3.2 Методика исследования 52
3.2.1 Изучение сократимости предсердий мыши 52
3.2.2 Исследование кальциевых сигналов 53
3.3 Растворы и реактивы 55
3.4 Статистическая обработка и анализ данных 56
4. Результаты собственных исследований 58
4.1 Влияние эндогенного и экзогенного сероводорода на сократимость миокарда предсердий 58
4.1.1 Эффекты субстрата синтеза сероводорода и блокатора фермента синтеза сероводорода на предсердный миокард мыши 58
4.1.2 Эффекты экзогенного донора сероводорода - гидросульфида натрия на сократимость миокарда предсердий и на уровень внутриклеточного Са2+ 59
4.2 Выявление роли калиевых и кальциевых каналов в эффектах сероводорода на сократимость миокарда предсердий 62
4.2.1 Роль кальций активируемых и потенциал зависимых калиевых каналов в эффектах гидросульфида натрия 62
4.2.2 Исследование роли АТФ зависимых калиевых каналов в отрицательном инотропном эффекте гидросульфида натрия 64
4.2.3 Роль потенциал зависимых Ca2+ каналов в эффектах NaHS 68
4.3 Роль оксида азота и гуанилатциклазы в отрицательном инотропном эффекте NaHS на сократимость миокарда предсердий 70
4.4 Исследование роли -адренорецепторов и аденилатциклазы в эффектах NaHS на сократимость миокарда предсердий 73
4.4.1 Роль -адренорецепторов в эффектах NaHS 73
4.4.2 Роль аденилатциклазы в эффектах NaHS 74
4.5 Исследование взаимодействия мускариновых ацетилхолиновых рецепторов и NaHS в регуляции сократимости миокарда предсердий мыши 76
4.5.1 Сократимость миокарда предсердий при взаимодействии NaHS и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов 76
4.5.2 Инотропные эффекты агониста мускариновых ацетилхолиновых рецепторов на фоне восстановления дисульфидных связей 80
4.5.3 Роль циклических нуклеотидов и оксида азота во взаимодействии NaHS с мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами 81
5. Обсуждение результатов 85
5.1 Отрицательные инотропные эффекты экзогенного и эндогенного H2S в миокарде предсердий мыши 85
5.2 Участие калиевых и кальциевых каналов в реализации отрицательного инотропного эффекта H2S 87
5.3 NO/цГМФ сигнальная сиситема не участвует в эффектах H2S 89
5.4 Взаимодействие -адренорецепторов и H2S в предсердном миокраде мыши 90
5.5 Взаимодействие H2S и сигнального пути мускариновых ацетилхолиновых рецепторов 92
Выводы 97
Список литературы 99
- Свойства, синтез и эндогенные концентрации сероводорода в сердечно-сосудистой системе
- Роль мускариновых ацетилхолиновых рецепторов
- Сократимость миокарда предсердий при взаимодействии NaHS и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов
- Взаимодействие H2S и сигнального пути мускариновых ацетилхолиновых рецепторов
Свойства, синтез и эндогенные концентрации сероводорода в сердечно-сосудистой системе
H2S, растворенный в воде, является слабой кислотой и диссоциирует на H+, HS- и S2-. При физиологическом рН (7.4), который характерен для крови и ряда других физиологических жидкостей, около 14% свободных сульфидов присутствует в виде газообразного H2S, более 80% присутствует в виде HS-, а остальное в виде S2-. Важным свойством газообразного H2S является его липофильность. Подобно O2 и CO2, H2S легко проникает в клеточную мембрану [Wang et al., 2012]. Благодаря своим свойствам газа H2S легко выходит из кровяного русла в легкие и/или из инкубационной среды в воздух [Liu et al., 2012].
Молекулярные механизмы влияния H2S на клеточном уровне в настоящее время до конца неизвестны. Одним из ключевых механизмов может быть модификация SH групп цистеина до SSH-групп при образовании S-сульфгидрированных белков. S-сульфогидратация, вызванная эндогенно продуцируемым H2S, может возникать в различных белках и модифицировать их физиологические свойства. Эта посттрансляционная модификация аналогична S-нитрозилированию, которое вызывается NO, может быть важным сигнальным механизмом и оказывать различные эффекты на сердечно-сосудистую систему. [Cacanyiova, 2016]
Как эндогенно продуцируемый H2S, так и экзогенно введенный NaHS образуют смесь H2S, HS- и частично S2-, однако неизвестно, какая форма является биологически активной. Доля H2S уменьшается с увеличением рН, но пропорции HS- и S2- возрастают. Фактическая концентрация S2- очень низкая, но увеличивается в 100 раз, при изменении рН от 6,0 до 8,0. [Ondrias et al., 2008]
Было обнаружено, что H2S может действовать непосредственно паракринным образом, либо связываться с белками и таким образом транспортироваться внутри организма, высвобождаясь в органе мишени [Kimura, 2010]. Соединения серы в организме служат хранилищами и носителями H2S [Ishigami et al., 2009]. Как высокий, так и низкий уровень рН и другие факторы могут влиять на высвобождение H2S, связанного с белком. Этот процесс высвобождения H2S называется сульфид-зависимая сигнализация [Ondrias et al., 2008]. Как свободные, так и связанные сульфиды производятся ферментами, которые синтезируют H2S. Три фермента могут синтезировать H2S из аминокислоты, L-цистеина: цистатионин--синтаза (ЦБС), цистатионин- лиаза (ЦГЛ) и цистеин-аминотрансфераза (ЦАТ) в сочетании с меркаптопируват-сульфуртрансферазой (3-МСТ). Экспрессия гена ЦБС и ЦГЛ была обнаружена в различных системах, включая печень, почки, лимфатическую систему, сосудистую стенку, кардиомиоциты и фибробласты. Хотя эти ферменты вносят одинаковый вклад в локальное производство H2S в печени и почках [Xia et al., 2009], в других органах может наблюдаться специфическая экспрессия одного из ферментов. Ключевым ферментом для синтеза H2S в центральной и периферической нервной системе является ЦБС [Abe, Kimura, 1996]. Источником H2S в мозге является комплекс ферментов ЦАТ и 3-МСТ [Ram, 1988]. ЦГЛ, ЦАТ и 3-МСТ экспрессируются в сердечно-сосудистой системе, где H2S продуцируется как эндотелиальными клетками [Yang et al., 2008], так и гладкомышечными клетками стенки сосудов и кардиомиоцитами [Zhao et al., 2001]. Экспрессия ЦГЛ показана в миокарде, в артериях [Geng et al., 2004], а ЦАТ и 3-МСТ а в эндотелии [Shibuya et al., 2009]. Yang et al. [2008] было показано, что синтез H2S при помощи ЦГЛ физиологически регулируется кальций кальмодулином.
Источниками H2S являются такие аминокислоты, как цистеин и метионин, которые присутствуют в пище. Почти весь синтезированный H2S немедленно окисляется и/или включается в структуру других белков печени перед входом в печеночные вены и нижнюю полую вену [Furne et al., 2008]. Большинство эндогенно синтезированного H2S окисляется до сульфатов, которые затем выводятся из организма почками [Furne et al., 2008]. Митохондрии активно участвуют в окислении сульфидов. Молекулы H2S окисляются до тиосульфата, который, в конечном счете, превращается в сульфид и сульфат с помощью сульфатоксидазы [Furne et al., 2008]. Затем сульфаты выводятся с мочой в свободной или связанной форме. H2S также захватывается гемоглобином или молекулами, содержащими металлы или дисульфидные группы (например, окисленным глутатионом). Гемоглобин обычно снижает уровень всех трех газомедиаторов (СО, NO и H2S), что может опосредовать токсические эффекты данных молекул. Легкие также участвует в выделении H2S в случае увеличения его производства, например. во время геморрагических состояний, септического шока или панкреатита. В нормальных условиях количество H2S, выделяемое в результате выдоха, незначительно [Liu et al., 2012].
Газообразные посредники в сердечно-сосудистой системе отличаются по своим физиологическим концентрациям. В артериальной крови концентрация NO в физиологических условиях составляет около 150 нМ [Gerov et al., 1996]. Это значение измеряли порфириновым биосенсором в потоке крови вблизи эндотелиальных клеток в бедренной артерии нормотензивной собаки. Физиологическое образование СО у человека составляет 20 мкМ/ч [Durante et al., 2006]. Данные о концентрации H2S в сердечно-сосудистой системе варьируются от 10 нМ до 300 мкМ.
Имеющиеся в литературе данные об эндогенных концентрациях газообразных посредников часто зависят от используемых методов. [Cacanyiova, 2016]. Так, в некоторых исследованиях указывается, что концентрация свободного H2S в крови и тканях млекопитающих составляет всего 14-15 нМ [Doeller et al., 2005; Furne et al., 2008], но она может значительно повышаться в тех органах, где присутствуют и активны ферменты, синтезирующих H2S [Whitfield et al., 2008]. Локальные концентрации свободного H2S могут увеличиваться в несколько раз, после чего он немедленно диффундирует, связывается или окисляется. Например, в аорте мышей наблюдается гораздо более высокая концентрация H2S (1 мкМ).
Эта концентрация в 20-200 раз выше по сравнению с другими тканями [Levitt et al., 2011]. Предполагается, что эндогенно продуцируемый H2S быстро окисляется до сульфатов или включается в белки. В этой форме H2S может высвобождаться после некоторых физиологических стимулов и временно увеличиваться до значительных концентраций [Ishigami et al., 2009]. В условиях in vitro физиологически релевантной предлагается концентрация H2S 100 мкМ. Эксперименты in vivo показывают, что способ введения H2S (внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный) является важным параметром, учитывая, что этот выбор метода может модулировать биодоступность H2S. При пероральном приеме высокий процент H2S метаболизируется в желудочно-кишечном тракте и печени, не достигая органа-мишени [Cacanyiova, 2016].
Роль мускариновых ацетилхолиновых рецепторов
Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы (М-АХР) принадлежат к семейству рецепторов связанных с G-белком. Они играют важную роль в регуляции сердечной деятельности. Парасимпатическая нервная система регулирует сердце при помощи блуждающего нерва через высвобождение ацетилхолина [Дугин, 1976; Соколова и др., 1976; Яшина, 1989]. Влияния блуждающего нерва на сердечную деятельность исследуются, начиная с XIX века [Volkmann, 1838; Weber, 1846], стимуляция которого оказывает значительное влияние на генерацию и распространение электрических импульсов, а также на способность регулировать силу сокращения [Lffelholz, Pappano, 1985]. Холинорецепторы подразделяются на мускариновые и никотиновые. На данный момент известны 5 типов (M1–5 АХР), которые являются метаботропными [Hulme et al., 1990]. Они связаны с G-белком, который является -гетеротримером. Активация М-АХР приводит к диссоциации G-белка на - и - субъединицы, которые независимо друг от друга запускают каскад внутриклеточных посредников [Cabrera-Vera et al., 2003]. Основываясь на их дифференциальной связи с G-белками и вторичными посредниками, пять рецепторов можно разделить на два основных функциональных класса. Рецепторы M1, M3 и M5 преимущественно связаны с белком Gq, и их активация влечет за собой увеличение уровня IP3 и ДАГ. Рецепторы M2 и M4 ассоциированы с Gi белком, который ингибирует аденилатциклазу и снижает уровень цAMФ в клетке [Caulfield, Birdsall, 1998]. В сердце крысы встречаются М-АХР всех типов- 1, 2, 3, 4, 5 [Dvorakova et al., 2005]. В предсердиях и желудочках крысы мРНК M2-АХР составляют более 90% от общего количества всех мускариновых рецепторов [Chen et al., 2008]. Таким образом, считается, что рецептор М2 является преобладающим подтипом мускариновых рецепторов, экспрессируемых в сердечной мышце [Dhein et al., 2001]. Хотя существуют свидетельства того, что другие подтипы мускариновых рецепторов могут участвовать в регуляции сердечной деятельности [Colecraft et al., 1998; Shi et al., 1999]. Регуляция работы сердца с помощью М2-АХР может быть объяснена одной из двух общих парадигм. Первая включает регулирование ионных каналов напрямую, через G-белок. Вторая включает косвенное регулирование активности ионного канала посредством модуляции цАМФ-зависимых ответов.
Прямой сигнальный путь регуляции связан с K+ каналами внутреннего выпрямления и выражен преимущественно в клетках предсердного миокарда, клетках синоатриального и атриовентрикулярного узлов. Этот сигнальный механизм включает прямую связь М2-АХР с K+ каналами внутреннего выпрямления с помощью чувствительного к коклюшному токсину G-белка. - субъединица Gi-белка непосредственно активирует K+ каналы внутреннего выпрямления, что приводит к гиперполяризации сердечной мышцы. Гиперполяризация уменьшает сократимость сердечной мышцы. Активация этого пути вовлечена в парасимпатическое замедление сердечного ритма, а также может способствовать замедлению проводимости импульса через атриовентрикулярный узел [Dascal, 1997; Mark, Herlitze, 2000].
Косвенный эффект, чаще всего связанный со стимуляцией мускариновых рецепторов, опосредуется ингибированием цАМФ-зависимых ответов [Dhein, Van Koppen, Brodde, 2001]. Способность M2-АХР ингибировать цАМФ-зависимые ответы была названа «акцентуированным антагонизмом» [Levy, 1971] в связи с тем, что ингибирующий ответ на активацию мускариновых рецепторов является более выраженным или становится очевидным в условиях предварительной стимуляции -АР. У большинства млекопитающих ответ на мускариновую стимуляцию наблюдается только у взрослых кардиомиоцитов, когда повышается продукция цАМФ вследствие активации -АР [McDonald et al., 1994]. В некоторых исследованиях было продемонстрировано, что действие ацетилхолина связано с образованием цГМФ в тканях сердца [Watanabe, Besch, 1975]. Однако, данная теория перестала пользоваться популярностью в связи с тем, что не было обнаружено постоянной корреляции между действием ацетилхолина и уровнем цГМФ [Lffelholz, Pappano, 1985]. Тем не менее, экзогенный цГМФ или его аналоги могут служить антагонистами эффектов цАМФ. Такие эффекты были описаны для экзогенного цГМФ, стимулирующего активность ФДЭ2, что приводило к увеличению расщепления цАМФ [Wang, Lipsius, 1995; Vandecasteele et al., 2001]. Другие исследователи связывали ингибирующие эффекты цГМФ с активацией ПКG [Imai et al., 2001; Shen, Pappano, 2002]. Возобновление интереса к цГМФ и его возможной роли в осуществлении регуляции мускариновыми рецепторами произошло после обнаружения NO в качестве регулятора активности растворимой гуанилилциклазы в различных типах клеток млекопитающих [Moncada et al., 1991; Snyder, Bredt, 1991]. Было установлено, что мускариновые агонисты могут стимулировать образование NO кардиомиоцитами, а ингибиторы NOS могут блокировать как образование NO, так и эффекты активации мускариновых рецепторов [Balligand et al., 1993]. NO участвует в ингибировании цАМФ-зависимых эффектов при активации мускариновых рецепторов через механизмы, включающие цГМФ-зависимую регуляцию активности ФДЭ2 [Balligand et al., 1995; Han et al., 1998].
Важно отметить, что развитие ишемической болезни сердца сопровождается нарушением регуляция сердечной деятельности вегетативной нервной системой, а именно уменьшением тонуса блуждающего нерва и увеличением влияния симпатической нервной системы [Sroka, 2004]. При этом стимуляция блуждающего нерва благоприятно сказывается на восстановлении миокарда [Olshansky et al., 2008]. При этом активация M2-АХР оказывает кардиозащитный эффект в условиях пре- и посткондиционирования ацетилхолином через открытие mitoKATФ каналов [Lu et al., 2006]. В некоторых случаях ацетилхолин индуцирует положительный инотропный эффект. Например, обработка коклюшным токсином приводила к положительному инотропному эффекту ацетилхолина в предсердиях крысы [Imai, Ohta, 1988]. В предсердиях мыши ацетилхолин индуцировал двухфазный инотропный ответ: быстрое снижение и следующее за ним увеличение силы сокращения, обе фазы ингибируются атропином [Nishimaru et al., 2000], но положительный инотропный эффект сохранялся на фоне блокирования Gi-белка коклюшным токсином, таким образом, положительный инотропный эффект связан с Gq белком. Первая фаза представляет собой ответ на стимуляцию М2-АХР, чувствительных к коклюшному токсину [Imai, Ohta, 1988; Caulfield, Birdsall, 1998]. В сердце М2-АХР преобладают, но есть данные о наличии не- M2-АХР, которые включают подтип M3-рецепторов [Wang et al., 2004; Myslivecek et al., 2008]. В исследованиях Hara et al. [2009] блокирование мускариновых М3-рецепторов с помощью 4-DAMP почти полностью отменила положительный ответ на ацетилхолин с небольшим ингибированием отрицательного ответа. Кроме того, применение простагландинов вызывало положительный инотропный ответ в предсердиях крысы, морской свинки и мыши [Tanaka et al., 2009]. В предсердиях мыши индометацин, неселективный ингибитор ЦОГ, снижал положительный инотропный эффект опосредованный M3-АХР [Kitazawa et al., 2009; Tanaka et al., 2009]. Похожий эффект наблюдался и при применении антагонистов простаноидных рецепторов [Hara et al., 2009]. Показано, что положительный ответ опосредуется простагландинами, высвобождающимися из эндокардиального эндотелия [Tanaka et al., 2009], а при его удалении вторая фаза положительного инотропного ответа существенно уменьшалась [Hara et al., 2009]. Таким образом, положительный инотропный ответ на ацетилхолин в предсердии мыши опосредуется простагландинами, высвобождающимися в основном из эндокардиального эндотелия [Hara et al., 2009].
Показано, что в миокарде М3-АХР опосредуют свое влияние через Gq-белки и стимуляцию фосфолипазы С [Felder, 1995], которая осуществляет гидролиз PIP2 с образованием IP3 и ДАГ. В свою очередь, IP3 активирует инозитолтрифосфатные рецепторы (IP3-рецепторы) СПР, что приводит к выбросу Са2+ [Leite et al., 2003]. Кроме того, М3-АХР участвуют в активации ранее неизвестного К+ тока, который активируется при мембранном потенциале положительнее -30 мВ [Shi et al., 1999; Wang et al., 1999; Shi et al., 2004].
Сократимость миокарда предсердий при взаимодействии NaHS и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов
Классический медиатор ацетилхолин играет важную роль в регуляции сердечной деятельности. В предсердиях мыши встречаются М-АХР второго и третьего типа (М2-АХР и М3-АХР) [Hara, 2009]. В последнее время появились данные о том, что эндогенный H2S может вносить вклад в эффекты ацетилхолина в гладкомышечных клетках аорты и кавернозных тел мыши [Coletta et al., 2012; Aydinoglu et al., 2017]. В нашей работе для исследования взаимодействия между H2S и М-АХР был использован карбахол - агонист М-АХР в концентрации 1 мкМ. Аппликация карбахола приводила к двухфазному инотропному эффекту, что согласуется с данными литературы [Hara, 2009]. Первая фаза проявлялась в быстром снижении силы сокращения предсердий на 29.2 ± 3.1 % (n = 13, p 0.05) к 5-8 минуте аппликации, что является следствием активации М2/М3-АХР кардиомиоцитов. Далее наблюдали повышение силы сокращений, связанное с активацией М3-АХР в эндокардиальном эндотелии, которое к 18 минуте достигло 16.2 ± 1.6 % (n = 13, p 0.05) относительно минимального значения силы сокращений, наблюдаемого в первую фазу (Рисунок 12 Б). На фоне предварительной аппликации карбахола отрицательный инотропный эффект NaHS полностью сохранялся, сила сокращения снизилась на 46.2 ± 2.8 % (n = 12, p 0.05) относительно сокращений, предшествующих аппликации NaHS (Рисунок 12 А). Однако, в условиях предварительной аппликации NaHS наблюдалось достоверное увеличение отрицательного инотропного эффекта карбахола на сократимость предсердий; в этих условиях сила сокращения уменьшалась на 51.8 ± 4.7 % (n = 12, p 0.05), при этом вторая фаза оставалась неизменной 10.0 ± 5.2 % (n = 12, p 0.05) (Рисунок 12 Б). В качестве блокатора АХР был использован атропин в концентрации 1 мкМ, аппликация которого не приводила к достоверному изменению силы сокращения (n = 9, p 0.05), а на его фоне эффект NaHS полностью сохранялся (19.6 ± 3.9 %, n = 9, p 0.05).
Анализ уровня внутриклеточного Са2+, полученный с помощью флуоресцентной микроскопии, также показал усиление эффекта карбахола на фоне NaHS. Так, активация М-АХР с помощью карбахола приводила к достоверному уменьшению Са2+ сигналов в волокнах предсердий мыши на 21.9 ± 4.9 % (n = 5, p 0.05) (Рисунок 13 А, Б). Для выявления эффекта карбахола на фоне NaHS, предсердия предварительно инкубировали в растворе, содержащем донор H2S, после чего регистрировали контрольные Са2+ сигналы; далее проводили аппликацию карбахола. На фоне перфузии предсердий раствором, содержащим NaHS, карбахол приводил к более значительному уменьшению Са2+ сигналов (на 43.6 ± 4.1 %; n = 5, p 0.05), что достоверно отличалось от эффекта карбахола в контроле (Рисунок 13 А, Б).
Полученные данные свидетельствуют о том, что внутриклеточные сигнальные пути, активируемые М2 / М3-АХР, могут являться мишенью для H2S.
Взаимодействие H2S и сигнального пути мускариновых ацетилхолиновых рецепторов
Стимулирование мускариновых рецепторов ацетилхолином играет важную роль в парасимпатическом контроле деятельности сердца. В предсердии мыши в передаче парасимпатических сигналов участвуют два вида М-АХР: М2 и М3-АХР [Kitazawa et al., 2016], которые относятся к двум функционально разным классам рецепторов. Так, М2-АХР связаны с Gi-белком, и их активация приводит к ингибированию аденилатциклазы, усилению К+ токов или увеличению синтеза NO, который активирует растворимую гуанилатциклазу с последующим повышением уровня цГМФ, стимуляции ФДЭ2 и снижением синтеза цАМФ [Harvey, Belevych, 2003, Balligand et al., 1993]. При этом М3-АХР сопряжены с Gq- белком, который запускает каскад внутриклеточных посредников, включающий фосфолипазу С, фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат, инозитол (1,4,5) -трифосфат и диацилглицерол [Wang et al., 2004]. В наших экспериментах агонист М-АХР, карбахол, оказывал двухфазный инотропный эффект: за стремительно развивающимся снижением следует постепенное увеличение силы сокращения, при этом было зарегистрировано уменьшение Са2+ сигналов в ответ на активацию М-АХР. Nishimaru K. et al. [2000] показали на левых предсердиях мыши, что оба эффекта блокируются неселективным антагонистом рецепторов, атропином; селективный блокатор М2-АХР отменял отрицательный инотропный эффект, тогда как антагонист М3-АХР устранял положительный инотропный эффект. Кроме того, показано, что М3-АХР в кардиомиоцитах могут активировать собственные К+ каналы [Shi et al., 1999; Wang et al., 1999; Shi et al., 2004]. Таким образом, отрицательный инотропный эффект связан как с М2-АХР за счет ингибирования аденилатциклазы, уменьшения уровня цАМФ и активации К+ каналов внутреннего выпрямления, так и М3-АХР, которые также способны активировать специфические К+ каналы. Положительный инотропный эффект в большей степени является результатом активации М3-АХР, которые располагаются в эндокардиальном эндотелии, и в ответ на стимуляцию которых увеличивается высвобождение простагландинов, синтезируемых циклооксигеназой 2 [Hara et al., 2009]. При этом некоторые внутриклеточные посредники, участвующие в формировании ответа на активацию М-АХР являются мишенями действия H2S в сердечно-сосудистой системе [Ali et al., 2006; Yong et al., 2008, 2010]. Кроме того, Ping et al. [2015] показали, что вызванная H2S вазоконстрикция может опосредоваться простагландинами, так как в присутствии ингибитора ЦОГ она заметно ослаблялась. В наших экспериментах эффект NaHS на фоне активации М-АХР не менялся, однако на фоне предварительной аппликации NaHS существенно увеличивался отрицательный инотропный эффект карбахола, без изменения второй фазы - увеличения силы сокращения. Полученные данные свидетельствуют о том, что внутриклеточные сигнальные пути, активируемые М2/М3-АХР кадиомиоцитов, но не М3-АХР эндокардиального эндотелия, могут являться мишенью для H2S.
H2S является восстановителем, и молекулярные механизмы его действия могут осуществляться через восстановление дисульфидных связей, что приведет к конформационным изменениям в белке. Квантовые химические расчеты указывают на двухступенчатую реакцию, в которой две молекулы H2S разрушают одну дисульфидную связь [Wang et.al., 2016]. Было предположено, что H2S может оказывать прямое модифицирующее действие на М-АХР. В качестве восстанавливающего агента был использован дитиотреитол, который оказывал отрицательный инотропный эффект. На его фоне эффект карбахола не отличался от контрольного, что предполагает существование других механизмов взаимодействия H2S и М-АХР.
Одной из общих мишеней H2S и М-АХР является аденилатциклаза. Косвенный эффект связанный с стимуляцией мускариновых рецепторов, представляет собой угнетение цАМФ-зависимых ответов за счет того, что активированная -субъединица Gi/o белка ингибирует активность аденилатциклазы, что приводит к уменьшению цитоплазматического цАМФ [Dhein, Van Koppen, Brodde, 2001]. Кроме того, H2S способен отрицательно модулировать функцию -АР желудочкового миокарда крысы за счет ингибирования аденилатциклазы [Yong et al., 2008]. Однако, в наших экспериментах блокирование аденилатциклазы с помощью MDL 12.330 не влияло на усиление эффекта карбахола на фоне предварительной аппликации NaHS.
Другой общей мишенью является NO/цГМФ. Имеется ряд исследований, демонстрирующих связь ацетилхолина и уровня цГМФ в тканях сердца [Watanabe, Besch, 1975]. Было показано, что агонисты М-АХР могут стимулировать образование NO кардиомиоцитами, тогда как ингибиторы NOS блокируют не только образование NO, но и эффекты активации М-АХР [Balligand et al., 1993]. В свою очередь NO ингибирует цАМФ-зависимые эффекты на ионные каналы при активации М-АХР через механизмы, включающие цГМФ-зависимую регуляцию активности ФДЭ2 [Balligand et al., 1995; Han et al., 1998]. В грудной аорте крысы было показано, что донор H2S потенциировал вазорелаксацию, вызванную ацетилхолином и донором NO путем увеличения уровня цГМФ [Coletta et al., 2012]. Кроме того, взаимодействие АХР и H2S с вероятным участием NO было показано в пещеристых телах мыши [Aydinoglu et al., 2017]. Однако, в наших экспериментах ни блокирование синтеза NO и цГМФ, ни сам NO не влияли на усиленный эффект карбахола на фоне предварительной аппликации NaHS.
Известно, что M2-АХР вовлечены в защиту миокарда при пре- и посткондиционирование ацетилхолином через открытие КАТФ каналов [Lu et al., 2006]. В свою очередь КАТФ каналы являются одной их основных мишеней для H2S [Geng et al., 2004; Xu M. et al., 2007; Абрамочкин, Моисеенко, Кузьмин, 2009; Sivarajah et al., 2009; Abramochkin, 2013; Хаертдинов и др., 2015]. В нашем исследовании блокирование КАТФ каналов с помощью глибенкламида снимало усиленный эффект активации М-АХР на фоне предварительной аппликации NaHS, тогда как активация КАТФ каналов диазоксидом приводила к усилению отрицательного инотропного эффекта карбахола, аналогично действию NaHS. Эти данные свидетельствует об участии КАТФ каналов в усиление отрицательного инотропного эффекта при активации М-АХР на фоне NaHS. КАТФ каналы в миокарде предсердий мыши образованы субъединицами SUR1/Kir6.2. Активация этих каналов может опосредоваться PIP2, участвующем в каскаде М3-АХР кардиомиоцитов путем связывания с субъединицей Kir6.2 [Ribalet et.al., 2005]. При этом показано, что и H2S способен напрямую активировать КАТФ каналы за счет модификации SUR1 или Kir 6.1 субъединицы [Jiang et. al., 2010; Mustafa et. al., 2011]. Кроме того S-сульфгидратация субъединицы Kir 6.1 снижает ее аффинность к АТФ и увеличивает доступность сайта связывания для PIP2, [Mustafa et. al., 2011]. По-видимому, предварительная аппликация NaHS приводит к химической модификации канальных субъединиц КАТФ каналов, способствуя их большей чувствительности к PIP2 в условиях аппликации агониста М-АХР, вызывая усиление отрицательного инторопного эффекта карбахолина.
Таким образом, полученные данные предполагают возможность синтеза H2S в предсердном миокарде мыши ферментом ЦГЛ, что согласуется с литературными данными, где данный фермент рассматривается в качестве основного фермента синтеза H2S в сердечно-сосудистой системе, в том числе и у мыши [Yang et al., 2008]. В наших исследованиях как субстрат синтеза, L-цистеин, так и экзогенный донор H2S, NaHS, оказывали отрицательный инотропный эффект, а также было установлено уменьшение Са2+ сигналов в ответ на аппликацию NaHS. Основываясь на литературных данных можно было предположить целый ряд мишеней, воздействие на которые приводили бы к данным эффектам: различные типы К+ каналов [Zhao et al., 2001; Tang et al., 2005; Cheang et al., 2010; Mustafa et al., 2011; Abramochkin, 2013]; изменение уровня циклических нуклеотидов и активности Са2+ каналов [Sun et al., 2008], изменение уровня синтеза NO или непосредственное взаимодействие этих газообразных посредников [Geng et al., 2007; Cacanyiova et al., 2016], а также модуляция функции адренорецепторов и М-АХР [Yong et al., 2008; Coletta et al., 2012; Aydinoglu et al., 2017]. Однако, в предсердиях мыши в качестве центрального звена, через которое H2S реализует свои эффекты были выявлены только КАТФ каналы, активация которых влечет за собой укорочение фазы плато потенциала действия и уменьшение IСа. Усиление отрицательного инотропного эффекта от активации М-АХР, вероятно, также связано с изменением активности КАТФ каналов. По-видимому, предварительная аппликация донора H2S приводит к химической модификации канальных субъединиц КАТФ каналов, вызывая их активацию в условиях аппликации агониста М-АХР.