Введение к работе
туальность темы. Криоконсервация эмбрионов значительно облегчает пользование метода трансплантации зародышей и открывает большие зможности для его широкого использования в животноводстве. Кроме1 го, замораживание и длительное хранение эмбрионов позволяет решить ряд научных задач, таких как сохранение гибридных линий различных :вотных, комбинаций мутаций, сохранение эмбрионов редких или исче-лщих видов животных.
Разработка эффективных методов низкотемпературного охлаждения юлогических объектов, которые позволяли бы сохранить высокий уро->нь жизнеспособных клеток, возможна лишь на основе исследований ізиологической реакции биологических объектов на воздействие холо-I. Именно на основе тщательного изучения физико-химических процесів, протекающих в биомакромолекулах, клетках, тканях и органах, >жно разработать наиболее целесообразные методы защиты от поврежда-іего действия низких температур.
Методы низкотемпературной консервации, разработанные для эм-зионов лабораторных Смыли, крыс, хомяков) и сельскохозяйственных срупнго рогатого скота, овец, коз, кроликов) животных, позволяют зеле пересадки деконсервированных зародышей в ряде случаев получать івое потомство. Все разработанные режимы замораживания эмбрионов текопитающих на момент начала наших исследований включали медленное жжение температуры, медленное оттаивание, искусственное вызывание ристаллизации среды. Характерной особенностью этих режимов является эстоянная скорость снижения температуры на отдельных этапах от їчальной температуры до переноса в жидкий азот. Однако, применяемые этоды низкотемпературного консервирования в значительной мере яв-яются следствием эмпирических подходов,,и не ясно, насколько они гражают реакцию эмбрионов на воздействие низких температур. К тому э они имеют, с нашей точки зрения, ряд недостатков, таких как зна-ительная длительность и большая трудоемкость процесса, необходи-ость применения сложного и дорогостоящего оборудования.
Анализ процессов, происходящих при низкотемпературном охлажде-ии данных биообъектов, недостаточно полно отражает реальные физи-еские явления. Это касается анализа выхода воды из клетки при замо-аживании, изучения кристаллизации цитоплазмы и т.п. В связи с этим еобходима разработка обоснованного режима замораживания эмбрионов
на базе исследований физиологической реакции зародышей на возденет вие холода.
Цель и задачи исследований. Исходя из вышесказанного, целью данної работы было изучение механизмов, отвечающих за специфичность реакциі эмбрионов крупного рогатого скота на воздействие различных режимої снижения температуры. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Определение температуры внутриклеточной кристаллизации эмбрионов крупного рогатого скота.
-
Изучение обезвоживания эмбрионов коровы при замораживании переменными скоростями.
3. Исследование механизма повреждающего действия начальної
переохлаждения на эмбрионы коровы.
-
Усовершенствование метода искусственной инициации кристаллизации.
-
Разработка установки для замораживания эмбрионов коровы бе применения электронных устройств.
Научная новизна работы:
-показано, что степень обезвоживания, позволяющая избежать внутриклеточной кристаллизации эмбрионов крупного рогатого скота, может быть достигнута как при замораживании с постоянной скоростью, так и с использованием режима переменной скорости по закону пассивного остывания;
-установлено, что вероятность образования льда внутри клетки, расчитанная как отношение величин переохлаждения цитоплазмы и внеклеточной среды не отражает реальных физических процессов, происходящих в системе клетка-окружающая среда при замораживании; реальные физико-химические процессы отражает вероятность внутриклеточной кристаллизации как отношение остаточного объема внутриклеточной воды и количества воды, которое должно было выйти из клетки при равновесном замораживании;
-показано, что сравнение жизнеспособности эмбрионов с вероятностью их внутриклеточной кристаллизации можно применять для расчета оптимальной скорости замораживания эмбрионов крупного рогатого скота;
- разработана методика определения температуры образования кри-
-$
стаялов льла внутри клеток на основе анализа сохранности эмбрионов после быстрого охлаждения до низких температур и медленного оттаивания;
-определено среднее значение температуры внутриклеточной кристаллизации эмбрионов коровы, равное -34,7С 0,3С;
— доказано,что ни на ;льное переохлаждение, ни выделение скры
той теплоты кристаллизацкі ни изменение режима снижения температуры
после плато кристаллизации -;е уменьшает сохранность эмбрионов круп
ного рогатого скота после оа.мораживаяия-еттаивания;
- установлено, что повреждающим началом переохлаждения является
изменение процесса обезвоживания клетки: понижение температуры ини
циации кристаллизации уменьшает время выхода воды из клетки и, сле
довательно, увеличивает вероятность образования кристаллов льда внут
ри нее, а искусственная инициация кристаллизации необходима для
увеличения времени обезвоживания эмбрионов;
— предложен метод самопроизвольной инициации кристаллизации
замораживаемой среды, основанный на прорастании кристаллов льда из
одной части контейнера в другу» по градиенту температура;
- предложен способ замораживания эмбрионов крупкого рогатого
скота с переменной скоростью по закону пассивного остывания.
Практическая значимость работы. Разработанный нами способ самопроизвольной инициации кристаллизации, названный нами "саыспосевом льда", делает гроцесс замораживания эмбрионов более технологичным, чем ранее предложенные. Самолосев льда по предлагаемому нами методу происходит так же, как к инициация кристаллизации, прсводикая оператором, однако вмешательства извне не требует.
На основании изучения обезвоживания эмЗриоксв крупного рогатого скота при замораживании с переменными скоростями и определения температуры внутриклеточного льдообразования был разработан режим снижения температуры для криоконсервзиин эмбрионов крупного рогатого скота по закону пассивного остывания. Для реализации данного режима и способа самопосева1 льда была разработана и изготовлена технологичная и несложная установка для замораживания эмбрионов без электронных и электромеханических устройств.
Внедрение результатов работы. Разработанные способы самопроизвольной инициации кристаллизации и установка для замораживания эмбрионов
заявлекы как изобретения. На изобретения "Способ замораживания эм< рионов" и "Установка для замораживания эмбрионов" получены патенты Разработки использовались в лаборатории трансплантации А! "Світанок" Ахтырского района Сумской обл.,ЩО "Прогресс"'г.Баркау; колхозе им.Кирова Золочевского района Харьковской обл., лаборатор; трансплантации г. Целинограда.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладі вались на екегодкык ученых Советах Ш УААН, в отчетах- о научгк исследовательской работе за 1985-1992 годы, на 2-й республикакскс научно-производственной конференции молодых ученых и специалисте С г. Харьков, 1988), Всесоюзном симпозиуме по трансплантации эмфзюж С г. Тарту.1SS6), Республиканской научно-практической конференции С г. Львов,1987}, Республиканских практических конференциях (г. Харі ков,1988; г. Львов,1990), опубликованы в трудах 11-го международно! конгресса по воспроизводству и искусственному осеменению ЖИВОТКі Сх\ Дублин,1988) к 25-го Международного конгресса по криобиолог* С г.Аахен.1988).
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзра литературь материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, вь веков, практических предлокений. Работа изложена на -/-/О страница машинописного текста, включает /5"*таблиц и J2& рисунка. Список ис пользованной литературы состоит из /Со источников, в том числ иностранных
В качестве объектов исследований были использованы эмбрион крупного рогатого скота. Получение эмбрионов ''-поизводилось на 6-дни полового цикла нехирургическим способом CL.. A.Rowson el al. , 1969). В качестве осноеной рабочей среды испольс~вали модифицирозан ный буфер Дюльбекко - PBS CD.G.Whittingham, 1971). ЗКиэ неспособное! эмбрионов после получения или проведения опыта определялась несколь киыи способами: морфологическим' Сметодом световой микроскопии), п способности эмбрионов к развитию in vitro, по реакции эмбрионов н действие гипо- к гипертонических растворов.
Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота проводилось н установках ЗЗМ (г.Харьков), "Mirucool" (Фракция), а также на уста
:овке, разработанной в институте животноводства УААН. Э качестве. штейкеров для бкоматериаяа использовались пробирки Уленгута, паи-!ТЫ отечественного и импортного производства. В качестве криопротек-орачиспользовали глицерин.
Температуру образца измеряли при помощи медь-констаятаяовых термопар. Режим снижения температуры регистрировали с помощью самопишущего потенциометра КСП-4.
Полученные результаты были статистически обработаны по общепри-іятьм методикам.