Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Современные представления о язвенной болезни желудка 14
1.2 Защитные факторы слизистой оболочки желудка против инфекции и воспаления
1.3 Цитокины при заболеваниях ЖКТ 25
1.4 Глипролины 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1 Схема постановки экспериментов 48
2.2 Экспериментальная модель язвообразования 49
2.3 Гистологическое исследование ткани желудка крысы при развитии и заживлении ацетатной язвы
2.4 Выделение и культивирование эпителиальных клеток желудка у крыс
2.5 Выделение и культивирование клеток ln. gastricus caudalis крысы 53
2.6 Определение оптимальной концентрации Con A для исследования влияния пептидов на митоген - стимулированную секрецию цитокинов клетками ln.gastricus caudalis крысы
2.7 Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией 58
2.8 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 59
2.9 Иммуноферментный анализ 59
2.10 Проточная цитофлюориметрия 60
2.11 Статистическая обработка данных 60
Глава 3. Результаты 61
3.1 Определение экспрессии генов цитокинов в мононуклеарных клетках крови при ацетатном язвообразовании
3.1.1 Влияние PGP и AcPGP при интраназальном введении на развитие и заживление ацетатной язвы у белых беспородных крыс.
3.1.2 Влияние пептидов на экспрессию генов цитокинов в мононуклеарных клетках крови при ацетатном язвообразовании
3.2 Гистоморфологическое исследование формирования и заживления ацетатной язвы у крыс линии Wistar на фоне противоязвенного действия пептидов. Определение экспрессии гена и секреции GRO/CINC-1 эпителиоцитами СОЖ и в тканях желудка при ацетатном язвообразовании
3.2.1 Влияние PGP и AcPGP на ацетатное язвообразование у крыс линии Wistar. Гистоморфологическая оценка формирования и заживления ацетатной язвы
3.2.2 Влияние пептидов на экспрессию гена и секрецию GRO/CINC-1 эпителиальными клетками СОЖ
3.2.3 Влияние пептидов на экспрессию гена и его секрецию GRO/CINC- 1 в тканях желудка крысы
3.3 Определение продукции цитокинов (IFNy, IL-1, IL-4, IL-17, MCP-1, TNF) Con A - стимулированными клетками каудального желудочного лимфоузла ln. gastricus caudalis и в сыворотке у белых беспородных крыс при ацетатном язвообразовании
3.3.1 Влияние PGP и AcPGP на уровень цитокинов в сыворотке крыс при развитии и заживлении ацетатной язвы
3.3.2 Влияние пептидов на секрецию цитокинов Con А - стимулированными лимфоцитами интактных крыс и крыс с ацетатной язвой в экспериментах in vitro
3.3.3 Влияние пептидов на Con A - стимулированную секрецию цитокинов клетками ln. gastricus caudalis у крыс после ацетатного язвообразования в экспериментах in vivo
Глава 4. Обсуждение 82
Выводы 94
Список литературы
- Защитные факторы слизистой оболочки желудка против инфекции и воспаления
- Экспериментальная модель язвообразования
- Определение оптимальной концентрации Con A для исследования влияния пептидов на митоген - стимулированную секрецию цитокинов клетками ln.gastricus caudalis крысы
- Влияние пептидов на экспрессию гена и секрецию GRO/CINC-1 эпителиальными клетками СОЖ
Защитные факторы слизистой оболочки желудка против инфекции и воспаления
К гастродуоденальным язвам, не ассоциированным с Н. pylori, относят в первую очередь эрозивно-язвенные поражения, вызванные приемом нестероидных противовоспалительных препаратов. Прием препаратов НПВП чрезвычайно распространен среди населения, многие больные принимают их без предварительной консультации с лечащим врачом [Ивашкин и др., 2009]. НПВП-ассоциированные эрозивно-язвенные поражения вызваны: подавлением активности фермента циклооксигеназы (ЦОГ), имеющего 2 изомера – ЦОГ-1 и ЦОГ-2, и прямое цитотоксическое действие на эпителий [Wallace, 2008]. Развитие НПВП-гастропатий наблюдается у лиц пожилого возраста. Они имеют гораздо больший риск возникновения гастродуоденальных язв и желудочно-кишечные осложнения, чем люди молодого возраста [Tarnawski et al., 2014]. Это связано с частичной атрофией желудочных желез и нарушением защиты слизистой оболочки (снижение секреции бикарбонатов и простагландинов и др.), и как следствие ухудшение заживления повреждений. По последним данным в слизистой оболочке желудка пожилых больных снижен кровоток и нарушена доставка кислорода, что приводит к гипоксии и к активации белка фактора транскрипции «early growth response-1» (EGR-1), далее происходит активация фосфатазы с двойной субстратной специфичностью (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, PTEN), в результате действия которой подавляется экспрессия антиапоптотического белка – сурвивина и активируются проапоптотические протеазы – каспаза 3 и каспаза 9. Дисбаланс между про- и антиапоптотическими посредниками приводит к увеличению апоптоза и повышенной восприимчивости к повреждениям. Другие возможные механизмы включают снижение активности теломеразы, увеличение репликативного клеточного старения, угнетение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor, VEGF) и ядерного транспортного белка «importin », необходимого для транспортировки транскрипционных факторов в ядро [Tarnawski A.S., 2014].
Слизистая оболочка желудка сохраняет свою целостность благодаря защитным механизмам (рис. 2), которые состоят из предэпителиального (слизисто-бикарбонатно-фосфолипидный барьер), эпителиального (эпителиальный барьер, состоящий из плотных соединений) и постэпителиального (эндотелиальный барьер) компонентов. Рис. 2. Схематическое представление защитных механизмов слизистой оболочки желудка [Tarnawski et al., 2014]. (1) слой слизи/бикарбоната/фосфолипидов; (2) эпителиальные клетки; (3) обновление клеток СОЖ из клеток-предшественников; (4) бикарбонат; (5) микроциркуляция слизистой через микрососуды; (6) стимуляция сенсорных окончаний нервов; (7) непрерывная генерация простагландина Е2 и простациклина. Кортикотропин-рилизинг-гормон (КРГ), Тиреотропин-рилизинг-гормон (ТРГ), Холецистокинин (ХЦК). Предэпителиальный компонент представляет первую линию защиты слизистой оболочки желудка. Вторая линия защиты заключается в способности эпителиальных клеток секретировать бикарбонат, слизь, фосфолипиды, простагландины, трефойловые пептиды и белки теплового шока. Целостность эпителиального слоя поддерживается путем непрерывного обновления клеток, которая регулируется факторами роста, простагландина Е2 и сурвивина. Третья линия защиты регулирует кровоток слизистой, генерируя простагландины и оксид азота [Laine et al., 2008; Tarnawski et al., 2014].
Слизь желудочно-кишечного тракта является первой линией защиты против бактерий [Johansson et al., 2013]. Слизь – это вязкоупругий секрет, покрывающий пищеварительный, дыхательный и урогенитальный тракты организмов. Этот слой служит не только смазкой и барьером, защищающим клетки от агрессивного действия факторов внешней среды, но также играет важную функциональную роль: поступающие в организм или выводимые из него вещества должны проходить через слой слизи. В норме в слое слизи тонкого кишечника могут свободно перемещаться и дистально находиться бактерии. Основной структурный и функциональный компонент слизи – особый подкласс гликопротеинов (муцины от англ. mucus – слизь).
Организация системы защиты слизи заметно изменяется в пределах пищеварительного тракта (рис. 3). В полости рта, слюнные железы образуют MUC5B и MUC7, которые обволакивают съеденную пищу для прохождения через пищевод. Желудок имеет двухслойную систему слизи, состоящую из внутреннего слоя, прикрепленного к эпителию, и внешнего, неприкрепленного, рыхлого слоя слизи. Оба слоя построены муцином MUC5AC, синтезируемый поверхностным эпителием. Железы желудка и ДПК выделяют гелеобразующий муцин MUC6. В отличие от желудка и толстой кишки, тонкая кишка имеет только один тип неприкрепленной и рыхлой слизи, состоящей из муцина MUC2. Толстая кишка имеет двухслойную систему слизи из MUC2: внутренний (плотный и прикрепленный слой слизи) и внешний (рыхлый и неприкрепленный слой слизи) [Johansson et al., 2013]. Tanaka T. et al. показали, что экспрессия MUC5AC в желудке постепенно увеличивается, начиная от 10-го дня после рождения крысят, выходя на плато на 30-й день и повторяя активность взрослых крыс линии Wistar [Tanaka et al., 2003]. Экспрессия муцина MUC5AC в СОЖ у интактных неинбредных крыс соответствует таковой в эпителии человека, что позволяет использовать белых крыс в качестве экспериментальной модели при исследовании поражений желудка [Черанева, 2011].
Долгое время роли слизи в организме не придавалось значения. Однако накоплены данные о том, что течение многих болезней проявляется в изменении свойств слизи. В последние годы быстро растет интерес к муцинам. Это обусловлено как пониманием важной функциональной роли слизи, так и тем, что большие муциноподобные домены обнаружены в составе гликопротеинов, связанных с мембраной многих (возможно, всех) эпителиальных клеток. Интерес к мембраносвязанным муцинам также вызван тем, что их экспрессия почти в 10 раз увеличивается в трансформированных клетках — в различных типах карцином и некоторых злокачественных опухолях [Железная, 1998].
При кистозном фиброзе, слизь тонкого кишечника не может свободно перемещаться, что вызывает симптомы этой болезни. Толстая кишка с двухслойной системой слизи несёт большую бактериальную нагрузку, в которой внутренний слой обычно остается непроницаем для бактерий. Нарушение функционирования слоя слизи толстой кишки может служить причиной колитов и ряда других инфекционных заболеваний [Johansson et al., 2013].
Экспериментальная модель язвообразования
Соответствующие рецепторы для антитромботического влияния глипролинов не идентифицированы, но полагают, что PGP, HypGP и другие глипролиновые фрагменты могут взаимодействовать с теми же рецепторами тромбоцитов, по которым происходит связывание коллагена III типа. Известно, что в структуре коллагенов имеется октапептидная последовательность KPGGluPGPK. Когда эта последовательность в структуре коллагена связывается с рецептором, возникает агрегация тромбоцитов. Свободный октапептид блокирует рецептор и тормозит агрегацию [Ашмарин и др, 2006].
У глипролиновых пептидов ярко выраженная тропность к тканям желудка, что обеспечивает эффективное воздействие на слизистую желудка. Меченный тритием PGP, введенный внутрижелудочно, обнаруживался вместе с дипептидными метаболитами, в тканях мозга, сердца, желудка и кишечника уже через 15 минут, при этом наибольшее их концентрация наблюдалась в органах ЖКТ [Бакаева и др., 2004a]. Было показано, что PGP и GPGPGP устойчивы к действию протеаз желудочного сока крысы и лошади [Труфанова и др., 2011]. Данный факт подтверждается сохранением противоязвенных свойств пептидов при их внутрижелудочном введении. Эффекты пептидов обусловлены влиянием как самих пептидов, так и их метаболитов. Однако, значительно более простым и менее травматичным способом является интраназальное введение [Каменский и др., 2001]. При этом вещество, всасывающиеся в области слизистой оболочки носа, минуя печень, по кровеносным и/или лимфатическим путям быстро достигают структур мозга.
Показано, что глипролины способны проходить гемато энцефалический барьер и накапливаться в тканях желудка при различных способах введения: внутрижелудочном, внутривенном, интраназальном или внутрибрюшинном. Вне зависимости от пути введения уже к 12-й минуте после инъекции меченный тритием PGP обнаруживается в мозгу, а его концентрация в тканях желудка становится выше, чем в крови и других внутренних органах [Ашмарин и др., 2008]. Способность проникать в мозг может обуславливать центральные эффекты глипролинов. После 10-ти минутного плавания, PGP в дозе 1 мг/кг вызывает снижение уровня тревожности и небольшое, но значимое увеличение уровня ориентировочно-исследовательской активности [Левицкая и др., 2000]. Постстрессорное интраназальное введение PGP и GP в концентрации 3.7 и 37 мкМ/кг в течение 3-х часов устраняло вызванные стрессом нарушения поведенческой активности крыс в тестах «крестообразный приподнятый лабиринт» и «Норковая камера». PG не проявил выраженного протекторного действия в отношении стрессогенных нарушений поведения [Бадмаева и др., 2005а; Бадмаева и др., 2005б]. Кроме того, PGP и GP предотвращают развитие и устраняют постстрессорные изменения поведения, вызванные физическим (10 мин. плавание) и психоэмоциональным стрессом (внутрибрюшинное введение ХЦК-4 в дозе 100 мкг/кг) [Эдеева и др., 2008]. PGP и GP также обладают терапевтическим анксиолитическим свойством, нормализуя поведенческую активность животных, нарушенную в результате действия стрессора [Копылова и др., 2007]. Кроме того, трипептид оказывает протекторное противогипоксическое действие, повышая устойчивость крыс к гипоксии и уменьшая постгипоксические нарушения поведения [Эдеева и др., 2008a]. В экспериментах in vitro было показано, что PGP и семакс обладают нейропротективным действием в мозге после церебральной ишемии, активируя транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов [Dmitrieva et al., 2010].
Меченный тритием PGP специфически связывается с мембранами базальных ядер, но не других отделов переднего мозга крыс [Вьюнова и др., 2008]. Позже было высказано предположение о возможном действии пептида через пост- и пресинаптические D2 и D3 рецепторы [Мешавкин и др., 2011]. В другом исследовании PGP в диапазоне концентраций до 100 мкМ практически не влиял на связывание 3Н-спиперона с 5-НТ2-рецепторами фронтальной коры – участком мозга, наиболее обогащенным этими рецепторами [Bymaster et al., 1996]. Учитывая, что спиперон является неселективным лигандом не только дофаминовых рецепторов D2-класса (D2-, D3- и D4-типа) и серотониновых рецепторов 5-НТ1- и 5-НТ2-типа, но и 1-адренорецепторов можно предположить, что PGP может взаимодействовать и с последними, что согласуется способностью трипептида и его дериватов снижать увеличенный норадреналином тонус аорты [Бакаева и др., 2003].
Таким образом, противоязвенные свойства глипролиновых пептидов могут быть опосредованы как периферическими так и центральными механизмами гомеостаза СОЖ. Вместе с тем, ввиду новых современных сведений о роли PGP и AcPGP в развитии воспалительных заболеваний некоторых органов, роль глипролиновых пептидов в язвообразовании и язвозаживлении остается неясной. Крайне мало данных о возможном его влиянии на цитокины. В связи с этим, весьма интересным представляется изучение взаимодействия двух регуляторных систем организма, с одной стороны - цитокинов, с другой стороны – глипролиновых пептидов. Эндогенная природа глипролинов, их высокая эффективность в нормализации различных физиологических функций, в том числе, поддержание гомеостаза СОЖ, позволяет предполагать их тесное взаимодействие с цитокинами. Однако, неизвестно сохранится ли противоязвенный эффект PGP при его интраназальном, удобном для человека способе введения.
Определение оптимальной концентрации Con A для исследования влияния пептидов на митоген - стимулированную секрецию цитокинов клетками ln.gastricus caudalis крысы
Супернатанты клеточных суспензий опытных проб и последовательные разведения стандартов инкубировали с бусами, покрытыми антителами, специфически реагирующими с каждым из аналитов. Далее добавляли биотин-конъюгированные антитела к цитокинам и стрептавидин, меченый флюорохромом - фикоэритрином. Концентрацию цитокинов определяли цитофлуориметрическим методом на приборе FlowCytomix FC500 «Beckman Coulter» с использованием наборов Rat Cytokine Multiplex Kit FlowCytomix eBioscience (IFNy, IL-1, IL-4, MCP-1 и TNF) и Simplex (IL-17). Чувствительность данной тест-системы для IFNy - 0,8 пг/мл, IL-1 - 8,5 пг/мл, IL-4 - 0,3 пг/мл, MCP-1- 0,8 пг/мл, TNF - 4,3 пг/мл и IL-17 -5,0 пг/мл. Анализ результатов проводили при помощи программы FlowCytomix Pro (Bender MedSystems, Австрия), предоставленной компанией eBioscience: http://www.ebioscience.com/resources/flowcvtomix-software/downloads/ full-version.htm
При статистической обработке результатов использовали t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни и тест LSD из статистического пакета ANOVA компьютерной программы «STATISTICA 7». Различия считались значимыми при р 0,05. Корреляционную зависимость оценивали при помощи коэффициента корреляции по Кендаллу. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение экспрессии генов цитокинов в мононуклеарных клетках крови при ацетатном язвообразовании Влияние PGP и AcPGP при интраназальном введении на развитие и заживление ацетатной язвы у белых беспородных крыс
На 4-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка площадь ацетатных язв в контроле была равна в среднем 43,6±17,0 мм2. PGP уменьшал развитие ацетатной язвы до 9,4±3,4 мм2 (противоязвенный эффект - 78,5 %). АсPGP проявил тенденцию к уменьшению, площадь язвы составила 22,4±9,2 мм2 (рис.7).
Влияние PGP и AcPGP на формирование и заживление ацетатной язвы у белых беспородных крыс. Количество животных: на 4-й день, n (контроль)=9, n (PGP)=9, n (AcPGP)=8; на 7-й день, n (контроль)=8, n (PGP)=9, n (AcPGP)=9. p 0,05 к контролю. контроль PGP AcPGP На 7-й день площадь ацетатных язв в группе контроль составила 18,6±5,0 мм2. PGP проявил только тенденцию к уменьшению ацетатной язвы до 14,3±5,7 мм2. Противоязвенный эффект АсPGP составил 65,4%, тяжесть повреждений была равна 6,4±1,5 мм2 (рис.7).
Таким образом, трипептид PGP при интраназальном введении белым беспородным крысам обладает выраженным протекторным противоязвенным действием на ацетатной модели язвообразования. АсPGP имеет противоязвенное терапевтическое действие.
При проведении корреляционного анализа между площадью ацетатных язв и экспрессией генов цитокинов была обнаружена значимая положительная связь с IL-10 на 4-й день в группах контроль и PGP, которая на 7-й день не сохранялась. В группе AcPGP на 4-й день наблюдались две корреляционные зависимости, одна из которых была положительной с ИЛ-8, а другая отрицательная с IL-6. На 7-й день имелась положительная корреляция с IL-10 (табл. 5).
В клетках СОЖ корреляционная зависимость была только в контрольной группе, где на 4-й день размеры ацетатных повреждений положительно зависели от экспрессии гена IFN, IL-2, IL-12 и TNF (табл. 5).
Таким образом, ацетатное язвообразование у контрольных и опытных животных сопровождается значительной активацией экспрессии генов IL-8, IL-10 и угнетением IL-6 в МНК периферической крови, а так же IL-2, IL-12 и TNF в клетках СОЖ у контрольных животных. Уменьшение язвообразования на фоне РGP и ускорение язвозаживления на фоне AcPGP сопровождается уменьшением транскрипции гена IL-10 в клетках крови. Таблица 5. Корреляционная зависимость экспрессии генов цитокинов в МНК периферической крови и в клетках СОЖ от площади ацетатных язв. S язвы (мм2) в группе Экспрессия генов цитокинов в МНК кровир 0,05 в СОЖр 0,05 Контроль 43,6±17,0; п=9 IL-10 (R=0,64) IFNa (R=0,60) IL-2 (R=0,63), IL-12 (R=0,71), TNFa (R=0,76) PGP9,4±3,4; п=9 IL-10(R=0,78) AcPGP22,4±9,2; п=8 IL-6 (R= - 0,59), IL-8 (R=0,65) Контроль 18,6±5,0;п=8 - PGP14,3±5,7; п=9 - AcPGP 6,4±1,2; п=9 IL-10(R=0,66) 64
Гистоморфологическое исследование формирования и заживления ацетатной язвы у крыс линии Wistar на фоне противоязвенного действия пептидов. Определение экспрессии гена и секреции GRO/CINC-1 эпителиоцитами СОЖ и в тканях желудка при ацетатном язвообразовании
Влияние PGP и AcPGP на ацетатное язвообразование у крыс линии Wistar. Гистоморфологическая оценка формирования и заживления ацетатной язвы
На 4-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка площадь повреждений в контрольной группе составила 92,4±5,5 мм2. PGP и АcPGP значительно уменьшали размер язвы до 21,8±5,1 мм2 и 21,8±4,9 мм2 соответственно (рис. 8). Противоязвенные эффекты PGP и AcPGP на 4-й день были равны 76,4 %.
Влияние PGP и AcPGP на формирование и заживление ацетатной язвы у крыс линии Wistar. Количество животных в группах: n=5, p 0,05 к каждому контролю. контроль PGP AcPGP На 7-й день площадь повреждений в контрольной группе была равна 36,8±9,5 мм2. PGP и АcPGP значительно уменьшали размер язвы до 5,0±3,4 мм2 (противоязвенный эффект - 76,4 %) и 12,5±2,9 мм2 (противоязвенный эффект - 65,9 %) соответственно (рис. 8).
Таким образом, полученные результаты показывают, что пептиды обладают протекторным и терапевтическим противоязвенными эффектами на ацетатной модели язвообразования у крыс линии Wistar.
В группе ложно-оперированных крыс, кроме небольшого отека в подслизистой некоторых животных не было отмечено никаких изменений на 4-й и 7-й дни после операции. Гистологическое наблюдение формирования ацетатных язв желудка у крыс линии Wistar в группе контроль показало развитие значительных повреждений СОЖ, часто с прободением, прилипанием к печени и селезенке в сравнении с ложно-оперированными крысами. На 4-й день после ульцерогенеза у них были выявлены: обширный отек, сильная инфильтрация лейкоцитов с преобладанием нейтрофилов в маргинальной зоне язвы (микрофото 2).
Влияние пептидов на экспрессию гена и секрецию GRO/CINC-1 эпителиальными клетками СОЖ
Целью настоящей работы было изучение влияния PGP и AcPGP при интраназальном введении на секрецию цитокинов иммунокомпетентными клетками крыс in vitro и in vivo при ацетатном язвообразовании. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи: определить протекторный и лечебный противоязвенные эффекты PGP и АсPGP при интраназальном введении; провести гистологическое исследование ткани желудка при развитии и заживлении ацетатной язвы; изучить экспрессию генов в мононуклеарных клетках периферической крови, в эпителиоцитах СОЖ и в тканях желудка; исследовать секрецию цитокинов в сыворотке, в клетках ln. gastricus caudalis крысы при ацетатном язвообразовании.
Ранее было показано, что глипролины (PGP, PG, GP, GPGPGP и др.) при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении повышают устойчивость слизистой оболочки желудка к действию различных ульцерогенных факторов [Бакаева и др., 2004; Багликова и др., 2007]. В настоящее время перспективным способом применения лекарственных препаратов считается интраназальное введение. Stockhorst et al. показали в своих экспериментах, что при подкожном введении инсулина его концентрация в крови достигает максимума лишь через 45-60 минут, а при интраназальном уже через 5-10 минут [Stockhorst et al., 2004]. Интраназальное введение имеет ряд преимуществ: прямое поступление лекарств в мозг и быстрое достижение терапевтического эффекта, удобство в использовании, высокая биодоступность, неинвазивность, безопасность (можно использовать препараты в комплексной терапии) [Привалова и др., 2012]. Например, семакс, используемый для лечения нейродегенеративных заболеваний ЦНС, проникает в мозг через обонятельные луковицы и начинает действовать уже через несколько минут после введения [Шевченко и др., 2006]. Кроме того, интраназальный способ введения препарат не теряет своей эффективности и при этом не сопровождается болевой стимуляцией, т.е. является менее стрессогенным для экспериментальных животных, чем внутрибрюшинный или внутрижелудочный. Известно, что PGP и его метаболиты (PG и GP) проходят через гематоэнцефалический барьер при различных способах введения, при этом оказывают высокую гастропротекцию на стрессорной модели язвообразования [Бадмаева и др., 2005]. Поэтому в представленной работе было проведено исследование гастропротекторных и лечебных противоязвенных эффектов PGP и АсPGP при интраназальном введении.
Язва желудка является многогранным и полиэтиологическим заболеванием, часто рецидивирующим и переходящим в хроническую форму [Glavin et al., 1992; Фадеев, 2009; Хендерсон, 2010; Ивашкин и др., 2014]. По литературным данным, важным патогенетическим звеном в образовании язвенного дефекта тканей желудочно-кишечного тракта является нарушение равновесия между интенсивностью ПОЛ и активацией ферментов антиоксидантной защиты: каталазы, супероксиддисмутазы и др. [Рогова и др., 2011], вследствие чего активно развивается воспалительный процесс. При воспалении активируются матриксные металлопротеиназы и происходит нарушение целостности соединительно-тканного матрикса [Рогова и др., 2011a]. К факторам, влияющим на механизм, лежащий в основе образования незаживающих язв желудка относятся: выраженный фиброз, непрерывная инфильтрация нейтрофилами, нарушение микроциркуляции и слабый ангиогенез в зоне язвы [Amagase et al., 2003].
Okabe et al. был предложен простой способ индукции хронических язв желудка (антральные и фундальные) или двенадцатиперстной кишки у крыс посредством аппликации ледяной уксусной кислоты на поверхность серозной оболочки [Okabe et al., 1971]. При этом развивается язва, которая по своим временным и гистоморфологическим характеристикам сходна с язвой человека. Максимальные ацетатные язвы по методу Окабе с модификациями [Бакаева и др., 2005] развиваются на 3-и сутки и заживают в течение 10 дней. Данная экспериментальная модель позволяет исследовать как протекторные, так и лечебные эффекты пептидов. Поэтому было актуально исследовать противоязвенную активность глипролинов при их интраназальном введении на развитие и заживление ацетатной язвы у крыс.
Впервые было показано, что PGP при интраназальном введении белым беспородным крысам значительно уменьшает развитие, а АсPGP существенно ускоряет заживление ацетатных язв. Однако, в эксперименте, в котором участвовали крысы линии Wistar из питомника Санкё (Фармацевтический университет, г. Сакадо, Япония) оба пептида проявили как протекторные, так и лечебные противоязвенные свойства. Стабильное проявление противоязвенных эффектов в данном случае мы связываем с линейными особенностями экспериментальных животных.
Проведенные исследования на белых беспородных крысах показали, что размеры ацетатных повреждений в контроле положительно коррелируют с экспрессией генов IFN, IL-2, IL-12 и TNF в клетках СОЖ, а в МНК крови с IL-10 и не коррелирует с другими цитокинами - IFN, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8. На 4-й день уменьшение язвенных повреждений коррелирует с угнетением экспрессии IL-10 в группе PGP, а в группе AcPGP с угнетением IL-8 и активацией экспрессии IL-6. Ускорение заживления ацетатной язвы на 7-й день в группе АсPGP также коррелирует с уменьшением экспрессии IL-10. Учитывая разнонаправленный характер процессов в группах, можно сказать, что у контрольных животных ацетатное язвообразование сопровождается активацией экспрессии гена IL-10 в МНК периферической крови, а у животных, получавших PGP, наоборот, уменьшение язвообразования происходит на фоне подавления транскрипции этого цитокина на 4-й день; аналогично у крыс на фоне лечебной терапии AcPGP – язвы на 7-й день заживали быстрее и уровень продукции мРНК IL-10 снижался.
Известно, что IL-10 является противоспалительным цитокином, который подавляет синтез провоспалительных цитокинов [Кетлинский и др., 2008]. У больных язвенной болезнью, ассоциированной H. pylori, были повышены уровни не только провоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-8, IFNy), но и противоспалительных цитокинов - IL-4, IL-10 в сыворотке [Степченко, 2010]. Скорее всего, снижение экспрессии гена IL-10 связано с уменьшением воспалительного процесса на фоне действия пептидов и снятием острой необходимости в противовоспалительном цитокине.
Интересно, что тенденция к уменьшению язв в группе AcPGP на 4-й день сопровождалось увеличением экспрессии гена IL-6. По данным литературы известно, что нарушение экспрессии IL-6 и его рецептора вовлечены в патогенез различных заболеваний. Считают, что регенераторная или противоспалительная активность (пролиферация эпителиальных клеток кишечника, подавление апоптоза эпителиальных клеток) IL-6 опосредуется классической сигнализацией JAK/STAT, в то время как провоспалительное действие (активация иммунной системы, накопление мононуклеарных клеток, угнетение апоптоза Т-клеток) опосредуется образованием растворимой формы рецептора IL-6, что в свою очередь расширяет спектр клеток-мишеней для IL-6 [Scheller et аі, 2011]. STAT3 играет центральную роль в врІЗО-опосредованной сигнальной трансдукции, регулирующей рост клеток, дифференцировку и выживание. JAK/STAT и Ras-MAPK активируются через SHP-2 или She. Эти сигнальные пути могут взаимодействовать друг с другом и вносить вклад в разнообразие биологической активности цитокина [Hirano, 1998]. Можно предположить, что АсPGP оказывает противоязвенное действие, повышая экспрессию IL-6 в МНК крови и активируя его противовоспалительный эффект через JAK/STAT сигнальный путь.