Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Общие представления о стрессе и тревожно-депрессивных расстройствах 9
1.2. Нейроэндокринная регуляция адаптивных функций организма 11
1.2.1. Паравентрикулярное ядро гипоталамуса 11
1.2.2. Гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система 15
1.2.3. Изменение работы других систем при стрессе 17
1.3. Окислительный стресс 19
1.3.1. Понятие об окислительном стрессе и активных формах кислорода (АФК) 19
1.3.2. Основные виды АФК – пути образования и механизмы действия 20
1.3.3. Антиоксидантная система организма 24
1.3.3.4. Ферментативные антиоксиданты 24
1.3.3.5. Неферментативные антиоксиданты 27
1.3.4. Влияние стресса на окислительные процессы в мозгу человека и животных 30
1.3.5. Методы определения уровня окислительного стресса 35
1.4. Влияние пренатального стресса на адаптивные функции потомства человека и животных 1.4.1. Нейроэндокринные механизмы и поведенческие проявления действия пренатального стресса 36
1.4.2. Биохимические проявления действия пренатального стресса 44
1.5. Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) 46
1.5.1. Общая клиническая картина 46
1.5.2. Нейроэндокринные нарушения при посттравматическом стрессовом расстройстве в клинике и эксперименте 49
1.5.3. Поиск биомаркеров посттравматического стрессового расстройства 50
1.5.4. Моделирование посттравматического стрессового расстройства в эксперименте 55
2. Материалы и методы исследований 57
2.1. Характеристика используемых животных и экспериментальные манипуляции с ними 57
2.2. Методы исследования психоэмоционального состояния крыс 58
2.2.1. Приподнятый крестообразный лабиринт 58
2.3. Методы оценки активности гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы у крыс 2.3.1. Забор образцов крови крыс для оценки отрицательной обратной связи в гипоталамо гипофизарно-адренокортикальной системе 59
2.3.2. Определение концентрации кортикостерона в плазме крови методом радиоиммунного анализа 58
2.4. Иммуногистохимические исследования структур головного мозга 61
2.4.1. Гистологическая обработка материала 61
2.4.2. Количественный анализ иммунореактивности 63
2.5. Биохимические методы оценки уровня окислительного стресса в плазме крови и структурах головного мозга. 64
2.5.1. Биохимический анализ окислительной модификации белков 64
2.5.2. Биохимический анализ активности антиоксидантной системы 65
2.6. Статистическая обработка данных 66
3. Результаты исследований 67
3.1. Влияние пренатального стресса на психоэмоциональное состояние самцов крыс до и после моделирования ПТСР. 67
3.2. Влияние пренатального стресса на активность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАС) самцов крыс до и после моделирования ПТСР 69
3.3. Влияние пренатального стресса на содержание кортиколиберина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса до и после моделирования ПТСР 71
3.4. Влияние пренатального стресса на содержание вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса до и после моделирования ПТСР . 72
3.5. Влияние пренатального стресса на плотность глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов в гиппокампе до и после моделирования ПТСР 75
3.6. Влияние пренатального стресса на процессы окислительных модификаций белков (ОМБ) в плазме крови и структурах головного мозга до и после моделирования ПТСР. 76
3.7. Влияние пренатального стресса на активность антиоксидантной системы в плазме крови и структурах головного мозга до и после моделирования ПТСР 78
4. Обсуждение результатов 88
Заключение 100
Выводы 102
Список используемых сокращений 103
Список литературы 104
- Паравентрикулярное ядро гипоталамуса
- Поиск биомаркеров посттравматического стрессового расстройства
- Влияние пренатального стресса на содержание вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса до и после моделирования ПТСР
- Обсуждение результатов
Паравентрикулярное ядро гипоталамуса
Согласно современной теории стресса гипоталамус является первым из ключевых звеньев так называемой стресс-системы – сложного регуляторного комплекса, который координирует гомеостазис в обычных условиях и играет ключевую роль в активации и координировании всех изменений в организме, составляющих адаптивную реакцию на стрессоры (Поленов и др., 1993; Pack и Palkovits, 2001). Центральное звено стресс-системы включает кортиколиберин- и вазопрессинергические нейроны паравентрикулярного ядра (ПВЯ) гипоталамуса, катехоламинегрические нейроны ствола головного мозга (голубое пятно, locus coeruleus, LC) и их гипоталамические проекции (Tsigos и Chrousos, 2002). В роли «пускового фактора» при стрессе выступает кортиколиберин. Стрессорные факторы, как физические, так и психологические, через различные мозговые структуры (прежде всего амигдалу и префронтальную кору (Jankord и Herman, 2008)) стимулируют продукцию и выделение кортиколиберина из мелкоклеточных нейронов ПВЯ гипоталамуса. Кортиколиберин, в свою очередь, далее активирует как САС (через норадренергические нейроны голубого пятна Locus coeruleus), так и гипоталамо-гипофизарную систему (Owens и Nemeroff, 1991).
Самое значительное скопление кортиколиберинергических нейронов описано в мелкоклеточной части паравентрикулярного ядра (мПВЯ) гипоталамуса (Sawchenko и Swanson, 1985). Основной мишенью эфферентных проекций этих нейронов является срединное возвышение (СВ), где происходит секреция кортиколиберина в портальный кровоток гипофиза, посредством чего гипоталамический нейрогормон осуществляет регуляцию секреции ПОМК-клетками аденогипофиза АКТГ и других гормонов – производных проопиомеланокортина.. Однако часть волокон из мелкоклеточной части ПВЯ направляется в другие гипоталамические ядра, а также в экстрагипоталамические области мозга (Swanson и Kuypers, 1980). Также кортиколиберин-иммунореактивные клетки описаны в крупноклеточной части ПВЯ, супраоптическом, супрахиазматическом, преоптическом, премаммилярном, аркуатном, дорсомедиальном ядрах, а также в латеральном гипоталамусе (Stolp и др., 1987). Центральное введение умеренных доз кортиколиберин вызывает не только активацию ГАС и САС, увеличение глюкозы в крови, ЧСС и артериального давления, но также усиливает тревогу и запускает реакцию затаивания (Sutton и др., 1982), при этом угнетая вегетативные функции пищеварительной и репродуктивной систем (Sirinathsinghji и др., 1983). При этом трансгенные мыши с гиперэкспрессией кортиколиберина обладали сниженной памятью и способностью к обучению (Heinrichs и др., 1996). Благодаря тому, что кортиколибериновая система включает различные отделы мозга, от высших центров регуляции поведения до автономных центров ствола, тесно связанные между собой обширными связями, кортиколиберин осуществляет функцию интеграции всех компонентов стрессорной реакции. Функционально кортиколибериновая и LC-NE/-симпатическая (LC-NE - «Locus coeruleus/norepinephrine», голубое пятно/норадреналин) системы связаны положительными связями, таким образом, активация одной системы ведет к активации другой. Так, введение кортиколиберина в нейроны L. coeruleus значительно увеличивает их частоту спайков (firing rate) (Valentino и др., 1983), в свою очередь, норадреналин стимулирует секрецию кортиколиберина клетками ПВЯ гипоталамуса (Calogero и др., 1988b). Наоборот, антагонисты кортиколиберина снижают ответы НА-нейронов L. coeruleus на стрессорные воздействия, а -блокаторы адренорецепторов ослабляют возбуждающие эффекты введения кортиколиберина (Dunn и Berridge, 1990). Взаимное влияние кортиколибериновой и норадреналиновой систем обусловлено обширными нервными связями между кортиколиберинергическими нейронами ПВЯ гипоталамуса и НА-ергическими нейронами L.coeruleus (Sawchenko и Swanson, 1982a). Кроме того на нейроны обеих систем оказывают сходное влияние целый ряд химических агентов - серотонин (Bagdy и др., 1989) и ацетилхолин (Calogero и др., 1988a) активируют кортиколибериновые и норадренергические нейроны, тогда как ГАМК (Calogero и др., 1988c), опиоиды (Yajima и др., 1986)и глюкокортикоиды (Calogero и др., 1988d; Szemeredi и др., 1988) тормозят.
Свои эффекты кортиколиберин опосредует через два типа рецепторов – CRH-R1 и CRH-R2, оба являются рецепторами серпентинового типа, сопряженными с G-белками. CRH-R1 имеет не менее 7 альтернативных сплайсинговых изоформ, экспрессирующихся в основном в головном мозге, а также в коже и гонадах (Pisarchik и Slominski, 2001; Eckart и др., 2002). CRH-R2 имеет 3 изоформы в ЦНС и на периферии (Karteris и др., 2004; Slominski и др., 2006). В мозге CRH-R1 экспрессируется преимущественно в неокортексе, гиппокампе, амигдале, обонятельном мозге мозжечке и гипофизе, а CRH-R2 больше в подкорковых структурах – гипоталамусе и латеральном септуме, а также в амигдале и неостриатуме (Chalmers и др., 1995; Van Pett и др., 2000).
Кроме кортиколиберина и катехоламинов важную роль в стрессорном ответе играет ряд других нейропептидов, в первую очередь, аргинин-вазопрессин и опиоиды (-эндорфин, динорфин, энкефалины). Вазопрессин выступает функциональным синергистом кортиколиберина в стимуляции секреции АКТГ и -эндорфина ПОМК-клетками аденогипофиза (Aguilera и Rabadan-Diehl, 2000), активирует LC-NE/симпатическую систему (Olpe и Baltzer, 1981) и усиливает ряд поведенческих эффектов кортиколиберина (Elkabir и др., 1990). Динорфин и кортиколиберин имеют реципрокные связи, кортиколиберин усиливает секрецию динорфина (Nikolarakis и др., 1986), тогда как динорфин снижает выброс кортиколиберина (Plotsky, 1986).
ПВЯ отличается среди нейроэндокринных формаций гипоталамуса наибольшим разнообразием регуляторных пептидов, синтезируемых в клетках, и широким кругом иннервируемых нейрогемальных органов и структур ЦНС. Эта особенность позволила отнести ядро к центрам интеграции защитных реакций организма, включающим регуляцию осмотического давления и иммунных реакций, оборонительное поведение, ноцицепцию и анальгезию, эмоциогенез, висцеральный гомеостазис (Swanson и Sawchenko, 1980).
Аксоны мелкоклеточных нейронов оканчиваются в наружной зоне срединного возвышения (НЗСВ), а крупноклеточных – во внутренней зоне СВ. Некоторые волокна прорастают из внутренней зоны СВ в стебель гипофиза и оканчиваются в задней доле гипофиза на сосудах общей системы циркуляции (Diakoku и Hisano, 1992). Меньшая часть аксонов этих клеток образует экстрагипоталамические пути, в составе которых они направляются в различные структуры переднего, среднего, продолговатого и спинного мозга (Поленов и др., 1993).
Эфферентные связи. Полифункциональность ПВЯ во многом обусловлена тем, что его разные подъядра образуют разнонаправленные пути к определённым комплексам структур ЦНС. Проекции крупноклеточных групп описаны преимущественно в энторинальной коре, а мелкоклеточных – в переднем гиппокампе, пириформной коре и во фронтальном неокортексе (Conrad и Pfaff, 1976). Обширные связи ПВЯ со многими структурами пирамидной и экстрапирамидной систем указывают на участие ядра в регуляции двигательной активности в целом. Так, описаны проекции мПВЯ к таламусу (Ferguson и др., 1984), стрио-паллидарному комплексу, чёрной субстанции, а также ядрам мозжечка (Dietrichs и Haines, 1986). Висцеральное «обеспечение» эмоциональных и локомоторных реакций возможно благодаря проекциям клеток обеих зон ПВЯ к висцеральным центрам ствола мозга – к парабрахиальным ядрам и ядру солитарного тракта (Swanson и Kuypers, 1980; van der Kooy и др., 1984; Moga и др., 1990). Основой отрицательных эмоций, сопряжённых с болью и оборонительным поведением, могут быть эфферентные проекции мПВЯ к L. coeruleus (Swanson и Sawchenko, 1980).
Афферентные связи. мПВЯ получает проекции из всех областей гипоталамуса (кроме супраоптического ядра), маммиллярных тел, из субфорникального органа, ядра ложа конечной полоски (bed nucleus of the stria terminalis, BNST), в то время как кПВЯ получает сравнительно мало входов из выше обозначенных структур (Sawchenko и Swanson, 1983). Амигдала и вентральный субикулум посылают проекции в ПВЯ и области гипоталамуса, непосредственно примыкающие к ядру, причём переключение их происходит в BNST (Gray и др., 1989). ПВЯ также обширно иннервируется катехоламинергическими и пептидергическими терминалями аксонов клеток ствола головного мозга. Основная часть норадренергической иннервации ПВЯ (как крупно-, так и мелкоклеточной частей) берёт начало от клеток ядра солитарного тракта ствола головного мозга и от нейронов голубого пятна, которые могут регулировать секрецию кортиколиберина разных групп нейронов в пределах ПВЯ (Cunningham и Sawchenko, 1988).
Основная тормозная иннервация мелкоклеточной части ПВЯ, обеспечивающая угнетение секреции кортиколиберина по механизму отрицательной обратной связи, приходит из гиппокампа, содержащего максимальное количество ГР среди всех структур головного мозга (Reul и Kloet, 1985). ГАМК-ергические нейроны гиппокампа тормозят активность ПВЯ гипоталамуса не напрямую, а через BNST. При увеличении концентрации глюкокортикоидов в плазме крови, усиливается их связывание с рецепторами в гиппокампе, что приводит к усилению его тормозного влияния на ГГАС (Herman и др., 1989b).
Вазопрессин, или антидиуретический гормон (АДГ), тесно связан с функционированием кортиколибериновой системы мозга, будучи колокализован с кортиколиберином в телах нейросекреторных клеток и их терминалях, и регулируя аффинность кортиколибериновых рецепторов (Scott и Dinan, 1998). Известно, что вазопрессин оказывает потенцирующий эффект на опосредованную кортиколиберином секрецию АКТГ аденогипофизарными ПОМК-клетками (Aguilera и Rabadan-Diehl, 2000). Синергизм кортиколиберина и вазопрессина в отношении регуляции и стрессорной активации ГГАС необходимо учитывать при исследовании кортиколиберин-зависимых механизмов тех или иных процессов, обращая пристальное внимание не только непосредственно на сам кортиколиберин, но и на его синергиста – вазопрессина.
К настоящему времени сформировалось представление о двух функционально и анатомически различных вазопрессинергических системах – так называемых «периферической» и «центральной» (Ring, 2005). В рамках периферической системы вазопрессин рассматривается как гормон, обладающий антидиуретическим и вазопрессорным эффектами (Goldsmith, 1987). Анатомически система включает крупноклеточные нейроны супраоптического ядра (СОЯ) гипоталамуса, по аксонам которых происходит транспорт вазопрессина в нейрогипофиз с последующим выделением гормона в общую систему циркуляции (Falke, 1991). В центральной системе вазопрессин функционирует как нейромодулятор и, подобно кортиколиберину, оказывает собственные поведенческие, нейроэндокринные и висцеральные эффекты. В ЦНС вазопрессин синтезируется двумя типами нейронов – крупно- и мелкоклеточными (Sofroniew, 1983).
Поиск биомаркеров посттравматического стрессового расстройства
Симптомы ПТСР не всегда проявляются достаточно явно для того, что бы их могли заметить как сами пациенты, так и врачи, из-за чего расстройство не всегда удается диагностировать. Симптомов, отмечаемых пациентами, может не хватать для постановки правильного диагноза (Lehrner и Yehuda, 2014). Эта проблема заставляет ученых и врачей искать более объективные биомаркеры, которые позволят объективно подтвердить диагноз ПТСР, в том числе у пациентов, которые не могут обнаружить или описать симптомы расстройства. Следующим шагом может стать усовершенствование методик диагностики не только самого ПТСР, но и установление конкретной формы данной патологии (Kang и др., 2015). Биомаркеры определяются как «объективные и измеряемые параметры нормальных и патологических биологических процессов, а также фармакологических реакций на терапевтическое воздействие» и служат с одной стороны для диагностики заболеваний, с другой для предсказывания предрасположенности к ним (Colburn и др., 2001). Молекулярные, энзиматические, визуальные, электрофизиологические и генетические показатели широко используются в качестве биомаркеров. Хотя к настоящему времени накоплен большой объем данных о нарушениях, сопровождающих развитие ПТСР, специфических и надёжных биомаркеров, которые позволят предсказывать и диагностировать это расстройство, до сих пор не установлено. В первую очередь, это связано с сильной гетерогенностью в проявлении симптомов и высокой коморбидностью (сопутствующими заболеваниями). Другая важная причина - гетерогенность патофизиологических механизмов развития ПТСР, что сильно усложняет задачу обнаружения одного биомаркера, позволившего бы предсказывать и диагностировать как развитие расстройства, так и вероятность восстановления (Zoladz и Diamond, 2013). Стоит отметить, что еще одним фактом, затрудняющим поиск биомаркеров ПТСР (особенно связанных с нарушением работы ЦНС), является недостаточная выборка postmortem материала умерших пациентов с ПТСР, не позволяющая статистически доказать связь структурно-функциональных изменений в мозге с развитием ПТСР.
Основными вегетативными проявлениями ПТСР является нарушение работы ГГАС, не удивительно, что поиск потенциальных биомаркеров ПТСР сосредоточен в первую очередь в характеристиках работы этой гормональной системы. Так, показано, что пациенты с ПТСР обладают сниженной экспрессией FK506-binding protein 5 – кошаперона ГР, играющего ключевую роль в снижении лиганд-рецепторного связывания и транслокации ГР в ядро, что приводит к подавлению ГР-сигналинга (Michopoulos и др., 2015). Авторы исследования полагают, что анализ полиморфизма гена FK506ВР может помочь в установлении точного типа нарушения работы ГГАС и диагностики конкретной формы ПТСР. Снижение экспрессии FK506BP, связанное с усилением чувствительности ГР, было также обнаружено у пациентов с ПТСР, переживших террористическую атаку на Всемирный Торговый Центр 11 сентября 2001 года (Matsuoka и др., 2015). По-видимому, основные кандидатами на роль претравматических факторов риска развития ПТСР должны быть связаны с активностью ГР-сигналинга. Одним из установленных факторов риска является повышенный уровень ГР в агранулоцитах (в них же при ПТСР увеличивается уровень белка р11) (van Zuiden и др., 2011). Есть данные о связи полиморфизма гена рецептора кортиколиберина 1 типа (CRH-R1) с проявлением острых симптомов ПТСР и их дальнейшим развитием у педиатрических пациентов, переживших травмирующий опыт (Amstadter и др., 2011). Полиморфизм гена CRH-R2 также связан с риском развития ПТСР, вероятно через модуляцию стрессорного ответа (Wolf и др., 2013). Однако развитие ПТСР нарушает работу и других физиологических систем организма, в первую очередь нейроэндокринных и медиаторных. Известно, что окситоцин обладает сильным анксиолитическим эффектом, в то время как другой нейрогормон нейрогипофиза вазопрессин усиливает тревожность и страх (Neumann и Landgraf, 2012). Хотя единой картины изменений окситоцина и вазопрессина, сопровождающих развитие ПТСР пока нет, у женщин, переживших автомобильную аварию без дальнейшего развития ПТСР, обнаружен повышенный уровень окситоцина (Nishi и др., 2015). В другом исследовании у мужчин-полицейских с ПТСР уровень окситоцина был снижен по сравнению со здоровыми полицейскими, при этом различий в уровне вазопрессина авторы не обнаружили (Frijling и др., 2015). Уровень нейротрофического фактора BDNF у пациентов с ПТСР снижался как в плазме крови (Matsuoka и др., 2013), так и в зубчатой извилине (Rasmusson и др., 2002). Затрагивает ПТСР и работу основных медиаторных систем мозга, в первую очередь моноаминергических. У людей, переживших травматический опыт в детстве, наблюдалась усиленная норадренергическая реакция на аверсивные визуальные стимулы, оцениваемая по повышенному уровню основного метаболита норадреналина 3-метокси-4-гидроксифенилгликоля (Otte и др., 2005). Установлен ряд генетических показателей, характерных для пациентов с ПТСР. В мета-анализе (Li и др., 2016) у пациентов с ПТСР обнаружен полиморфизм в генах рецептора дофамина D2 (DRD2) и транспортера дофамина DAT1. Также выявлена связь между SNP (single nucleotide polymorphism) в промоторе гена транспортера норадреналина и выраженностью тревожных симптомов ПТСР (Pietrzak и др., 2015). Пациенты с низкофункциональным коротким аллелем (S) в промоторе гена транспортера серотонина (5-HTTLPR) обладали как более сильной выраженностью симптомов, так и более высоким риском развития ПТСР по сравнению с гомозитотами по высокофункциональному длинному аллелю (L), обладающему большей транскрипционной активностью (Telch и др., 2015). Перспективным биомаркером ПТСР может стать белок мононуклеарных лейкоцитов (агранулоцитов) р11 из семейства белка S-100 - его уровень повышался у пациентов с ПТСР, но снижался при большом депрессивном расстройстве, биполярном аффективном расстройстве и шизофрении (Su и др., 2009). В другом исследовании (Zhang и др., 2011) низкий уровень мРНК р11 в агранулоцитах коррелировал с попытками суицида у больных как ПТСР, так и большим депрессивным расстройством.
Не менее важной задачей является поиск прогностических биомаркеров, позволяющих предсказать развитие ПТСР и оценить степень предрасположенности к нему. Причем, это должны быть две группы факторов - претравматические (позволяющие до травмы оценить риск развития ПТСР в случае травмирующего события) и посттравматические (измеряемые после травмы для оценки риска последующего развития расстройства). Для точного установления таких факторов необходимо провести масштабные и долгосрочные проспективные исследования (Lehrner и Yehuda, 2014).
Поиск факторов риска развития ПТСР, также как и биомаркеров для его диагностики, ведется в первую очередь среди показателей работы ГГАС. Но обнаружен и ряд изменений в других гормональных и нейромедиаторных системах, которые могут выступать как пре-, так и посттравматическими факторами риска развития ПТСР. Обнаружено, что с претравматическим риском развития ПТСР может быть связан пониженный уровень как эстрадиола (Glover и др., 2012), так и тестостерона (Reijnen и др., 2015). Уже упомянутый короткий (S) аллель в промоторе гена транспортера серотонина (5-HTTLPR) связан с повышенной вероятностью формирования ПТСР после травмы (Wolf и др., 2013). Активность катехол-О-метилтрансферазы (СОМТ) -фермента, инактивирующего дофамин, адреналин и норадреналин - еще один маркер риска ПТСР. Ветераны с гетерозиготным генотипом по валин/метионин полиморфизму rs4680 были менее склонны к появлению симптомов ПТСР, чем ветераны с гомозиготным генотипом (Clark и др., 2013). Также частично упомянутые выше полиморфизмы генов транспортера дофамина DAT1 и рецепторов дофамина DRD2 и DRD4 является не только биомаркерами для диагностики ПТСР, но и факторами риска.
Влияние пренатального стресса на содержание вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса до и после моделирования ПТСР
У ПС крыс до моделирования ПТСР повышено содержание вазопрессина как в крупноклеточной (кПВЯ), так и в мелкоклеточной (мПВЯ) частях паравентрикулярного ядра гипоталамуса (Таблицы 4,5, рис. 11). Это проявляется как в увеличении средней оптической плотности вазопрессина в вазопрессин-позитивных нейронах (кПВЯ: F2,106=10,2, p 0,001, критерий Тьюки р 0,001, рис. 12, А; мПВЯ: F2,87=8,8, p 0,01, критерий Тьюки р 0,001, рис. 13, А), так и в увеличении доли сильноокрашенных клеток (кПВЯ: F6,208=5,1, p 0,001, критерий Тьюки р 0,001, рис. 12, В; мПВЯ: F6,170=4,2, p 0,001, критерий Тьюки р 0,001, рис. 13, В). Общее количество вазопрессин-позитивных клеток не отличается (рис. 12, Б и 13, Б). Это свидетельствует об увеличении содержании вазопрессина в ПВЯ гипоталамуса пренатально стрессированных крыс по сравнению с контрольными.
Снижение оптической плотности (ОП) вазопрессина (рис. 12-13, А) и доли сильноокрашенных клеток (рис. 12-13, В), но не количества (рис. 12-13, Б) вазопрессин-позитивных нейронов после моделирования ПТСР наблюдалось в обеих частях ПВЯ только у ПС крыс спустя 10 дней (кПВЯ: ОП р 0,01 (критерий Тьюки), % сильноокрашенных р 0,01; мПВЯ: ОП р 0,001, % сильноокрашенных р 0,001) и спустя 30 дней (кПВЯ: ОП р 0,001, % сильноокрашенных р 0,001; мПВЯ: ОП р 0,001, % сильноокрашенных р 0,01). У контрольных крыс формирование расстройства в модели ПТСР не сопровождалось изменением концентрации вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса.
Таким образом, у контрольных самцов крыс формирование патологического состояния в модели ПТСР сопровождается увеличением содержания кортиколиберина в ПВЯ гипоталамуса спустя 1, 10 и 30 суток после рестресса, при этом содержание вазопрессина не изменяется. В то же время у ПС самцов крыс заметное увеличение содержания кортиколиберина на 1 день сменяется резким снижением на 10 и 30 дни, сопровождаясь снижением содержания вазопрессина в обеих частях ПВЯ гипоталамуса.
Различий между контрольными и ПС стрессированными крысами по плотности как глюкокортикоидных, так и минералокортикоидных рецепторов не обнаружено в полях СА1 (рис. 14, 18), СА3 (рис. 15, 19) и СА4 (рис. 16, 20) гиппокампа. В зубчатой извилине ПС крыс снижена как оптическая плотность (F1,27=30, p 0,001; контроль 0,07±0,0005, ПС 0,05±0,003, критерий Тьюки р 0,05, рис. 17, А, Г, Д), так и доля ГР-позитивных клеток (F(1,27)=27,9, p 0,001; контроль 82±5%, ПС 50±6%, критерий Тьюки р 0,05, рис. 17, Б) и доля сильноокрашенных клеток (контроль 10±3%, ПС 2±1%, р 0,01, рис. 17, В). Это говорит о снижении содержания глюкокортикоидных рецепторов в зубчатой извилине самцов крыс после пренатального стресса. Изменения уровня рецепторов в ходе моделирования ПТСР имеют разный характер в зависимости от структуры. По доле сильноокрашенных клеток различий не обнаружено ни в одной структуре ни для ГР, ни для МР (рис. 14-21, В).
Поле СА1 гиппокампа. Через 10 дней после моделирования ПТСР в поле СА1 гиппокампа у контрольных крыс наблюдается увеличение содержания только глюкокортикоидных рецепторов (по доле ГР-позитивных клеток, F2,28=11,8, p 0,05; с 86±6% до 100±0%, р 0,05, рис. 14Б, Г, Д). У ПС крыс, в то же время, через 10 дней после рестресса увеличивается содержание только минералокортикоидных рецепторов (по ОП (F2,41=27,1, p 0,001) с 0,06±0,004 до 0,10±0,003, критерий Тьюки р 0,001, рис. 18, А и по доле сильноокрашенных клеток (F2,41=31,2, критерий Тьюки p 0,001) с 9±3% до 50±4%, критерий Тьюки р 0,001, рис. 18, В).
Через 30 дней после моделирования ПТСР у контрольных крыс доля ГР-позитивных клеток доходит до 100% (по сравнению с 86±6% у группы «Контроль без ПТСР», критерий Тьюки р 0,05, рис. 14, Б), однако других изменений ГР-иммунореактивности в поле СА1 гиппокампа не обнаружено ни в одной группе. Уровень минералокортикоидных рецепторов также возрастал в группе «Контроль ПТСР 30 дней» по доле сильноокрашенных клеток (с 8±3% до 26±7%, критерий Тьюки р 0,05, рис. 18, В). У ПС крыс через 30 дней, содержание МР, напротив, значительно снижалось относительно группы «ПС без ПТСР» (ОП с 0,06±0,0004 до 0,04±0,0005, критерий Тьюки р 0,001; рис. 18, А; доля МР-позитивных клеток (F2,41=18,2, p 0,001) с 80±5% до 39±10%, критерий Тьюки р 0,001; рис. 18, Б).
Поля СА3 и СА4 гиппокампа. В полях СА3 (рис. 15, 19) СА4 гиппокампа (рис. 16, 20) изменения уровня как глюкокортикоидных, так и минералокортикоидных рецепторов в ходе моделирования ПТСР не обнаружено ни у контрольных, ни у пренатально стрессированных крыс. Зубчатая извилина. Исходно в зубчатой извилине ПС крыс снижен уровень глюкокортикоидных рецепторов (см. выше). При этом моделирование ПТСР у ПС крыс (но не у контрольных) приводит к увеличению уровня минералокортикоидных (рис. 21, Г-Д), а не глюкокортикоидных рецепторов в нейронах зубчатой извилины через 10 суток по оптической плотности рецепторов (F2,35=6,9, p 0,001) с 0,06±0,004 до 0,09±0,006, (критерий Тьюки, р 0,001; рис. 21, А) и по доле сильноокрашенных клеток (F2,35=8,4, p 0,01) с 5±2% до 35±9%, критерий Тьюки, р 0,001, рис. 21, В). Через 30 дней содержание обоих типов кортикостероидных рецепторов не отличается от такового в группах без моделирования ПТСР.
По соотношению уровня глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов (рис. 22) никаких различий между группами не обнаружено ни в одной структуре.
Обсуждение результатов
Так как основной механизм действия пренатального стресса – проникновение стрессорных гормонов матери через плаценту в организм плода, то и важнейшим фактором различных гормональных, поведенческих и метаболических нарушений у потомков является активация гипоталамо-гипофизарной-адренокортикальной системы (ГГАС). Экспрессия кортикостероидных рецепторов в гиппокампе начинается в последнюю треть беременности – ГР c 13, МР с 16-17 дня гестации (Matthews и др., 2002), поэтому именно этот период является наиболее опасным для действия стрессорных факторов.
В данном исследовании у ПС животных базальная концентрация кортикостерона в плазме крови вдвое превышает таковую у контрольных. Подобные изменения активности ГГАС у пренатально стрессированных крыс были выявлены и в исследованиях других авторов (Weinstock, 2001), хотя в данном случае использовали более интенсивное стрессирование беременных самок (60-минутная иммобилизация трижды в день на протяжении всей последней недели беременности), чем в наших экспериментах (однократная 60-минутная иммобилизация при повышенной освещенности в 15-19 дни беременности). Полагают, что причиной увеличения базального уровня глюкокортикоидных гормонов, вероятно, является усиленное поступление глюкокортикоидов в плод вследствие материнского стресса и активации ГГАС матери. В организме плода глюкокортикоиды, в свою очередь, вызывают активацию его ГГАС, что впоследствии проявляется в повышенном базальном уровне кортикостерона (Weinstock, 2001; Seckl и Meaney, 2006).
Активация ГГАС у ПС крыс проявлялась не только на периферии в виде повышенного уровня кортикостерона, но и в ее центральном звене – паравентрикулярном ядре (ПВЯ) гипоталамуса. Как в мелкоклеточных, так и в крупноклеточных нейронах ПВЯ отмечено повышение содержания как кортиколиберина, так и вазопрессина – ключевых гормонов системы стрессорной реакции организма. Кортиколиберин (КРГ) называют «первым медиатором стресса», а вазопрессин кроме ряда периферических висцеральных и психотропных эффектов играет роль функционального синергиста кортиколиберина в ГГАС. Из нейронов мПВЯ кортиколиберина вместе с вазопрессином выбрасываются в портальную гипоталамо-гипофизарную систему, достигают ПОМК-клеток аденогипофиза и стимулируют секрецию АКТГ, запуская работу ГГАС. По аксонам нейронов кПВЯ вазопрессин и кортиколиберин транспортируется в нейрогипофиз, где они выбрасывается в системный кровоток. Таким образом, пренатальный стресс, увеличивая концентрацию кортиколиберина и вазопрессина в обеих частях ПВЯ, усиливает как аденогипофизарное, так и системное их действие.
Важнейший механизм ослабления отрицательной обратной связи в ГГАС, неоднократно показанного у ПС крыс – снижение количества кортикостероидных рецепторах в гиппокампе – ключевой структуре, посылающей тормозные входы в ПВЯ и подавляющей активность ГГАС (Herman и др., 1989b). В литературе накоплен большой объем данных о различиях в количестве МР и ГР в разных областях головного мозга. Так, в работе Reul и коллег (Reul и Kloet, 1985) сообщается о максимальной концентрации МР в поле СА1 гиппокампа, субикулюме и зубчатой извилине, ГР же преимущественно обнаруживается в латеральном септуме, амигдале и также в зубчатой извилине, но почти отсутствует в поле СА1. В другом исследовании (Herman и др., 1989a) мРНК ГР обнаружена во всех полях гиппокампа и зубчатой извилине с максимальным содержанием в поле СА1-2, а минимальном в поле СА3, причем количество рецепторов достоверно различалось между полями. мРНК МР также обнаружена во всех полях гиппокампа, однако максимальное количество наблюдалось в проксимальной (граничащей с СА1-СА2 полями) зоне поля СА3, достоверно отличаясь от количества в поле СА1-2, дистальной зоны СА3 (где количество было минимально) и зубчатой извилины. В данном исследовании, возможно в силу большого количества сравниваемых выборок с одной стороны и их небольшого объема с другой, не обнаружено никаких различий между различными структурами гиппокампа ни по уровню МР и ГР, ни по их соотношению, равно как и влияния пренатального стресса на эти показатели. Однако, хотя в полях гиппокампа не обнаружено различий по уровню МР или ГР, в зубчатой извилине пренатальный стресс приводит к уменьшению количества глюкокортикоидных рецепторов (ГР), что и является основной причиной сниженной обратной связи в ГГАС крыс после пренатального стресса.
Неоднократно показано, что гиперактивация ГГАС плода глюкокортикоидами и другими гормонами матери, проникающими в плаценту, приводит не только к нарушению работы гормональной системы, но и влияет на поведение потомства в детском и взрослом возрасте. Хотя во многих работах показано увеличение уровня тревожности у ПС крыс обоих полов (Wakshlak и Weinstock, 1990), в данной работе, так же как и в предыдущих исследованиях нашей лаборатории (Ордян и Пивина, 2003a) ПС самцы крыс проводили больше времени в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта, чем контрольные. При этом по выраженности депрессивноподобного поведения в тесте вынужденного плавания контрольные и ПС крысы не различались. В исследованиях нашей лаборатории так же показано, что у ПС самцов крыс нарушена возрастная динамика уровня тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте. У контрольных самцов время пребывания в открытых рукавах с возрастом снижается, и, соответственно, увеличивается уровень тревожности, тогда как у ПС самцов этот показатель не меняется. В результате оказывается, что в 1,5-месячном возрасте ПС самцы более тревожны, чем контрольные, в то время как в 3-месячном, наоборот, они оказались менее тревожны (Пивина и др., 2010). Возможный механизм снижения, а не увеличения тревожности ПС самцов крыс, наблюдаемого в экспериментах нашей лаборатории – нарушение метаболизма мужских половых гормонов, вызванного увеличением активности фермента ароматазы, превращающего тестостерон в эстрадиол в мозге ПС самцов крыс. Таким образом пренатальный стресс стирает межполовые различия в уровне тревожности, приближая более тревожных самцов к менее тревожным самкам (Ордян и др., 2006).
В настоящее время известно, что особенность метаболизма мозга – интенсивный окислительный обмен (Halliwell и Gutteridge, 2015), следствием которого является повышенная концентрация активных форм кислорода и продуктов их взаимодействия с биомолекулами. Высокая концентрация полиненасыщенных жирных кислот в мембранах клеток нервной ткани является еще одним фактором ее высокой чувствительности к действию окислительного стресса (Farooqui и др., 2004). При этом активность антиоксидантных ферментов мозга довольно низка (Строев и Самойлов, 2006). Данный парадокс связан с тем, что в процессе эволюции побочные продукты аэробного дыхания, обладающие рядом специфических свойств, нашли применение в регуляции функциональной активности головного мозга. Одно из центральных мест в работе сигнальных систем клетки принадлежит белкам и продуктам их метаболизма, в частности продуктам свободнорадикального окисления белков. Свободнорадикальное окисление белков можно рассматривать как систему внутренней модуляции и передачи информации как от внешней среды к внутриклеточным системам, так и наоборот. Вполне вероятно, что одним из возможных молекулярных механизмов реализации последствий ПС может быть свободнорадикальное окисление белков в структурах, осуществляющих контроль интегративных функций мозга – неокортексе, гиппокампе и гипоталамусе.
Именно в гипоталамусе – центральном звене системы стрессорного ответа, наиболее сильно вовлеченной в патогенез постстрессорных тревожно-депрессивных расстройств, обнаружено усиление окислительных модификаций белков (ОМБ). При этом в исследовании Zhu и коллег говорится, что наиболее предрасположенной к ОМБ в результате пренатального стресса структурой мозга является не гипоталамус, а гиппокамп из-за большого количества кортикостероидных рецепторов (Zhu и др., 2004). Хотя по уровню спонтанных ОМБ (СОМБ) в гиппокампе контрольные и ПС крысы не различались, в этой области мозга, также как и в гипоталамусе, было повышена интенсивность индуцированных реактивом Фентона ОМБ (ФОМБ) – показатель устойчивости и запаса прочности клеток к действию окислителей. В нашей лаборатории до этого уже проводились исследования влияния пренатального стресса на окислительные процессы в структурах головного мозга.