Введение к работе
Актуальность проблэиы. Холинергическая система, главтш элемонтом которой является ацетилхолин, контролирует огромное число функций организма. Свое действие ацетилхолин оказывает связываясь с никотиновыми и мускариновнми рецепторами клеток-мишеней. В настоящее время не вызывает сомноний, что мускаршювые холинорецеп-торы (М-ХР) присутствуют в клетках АДГ чувствительного эпителия собирательных трубок млекопитающих, мочевого пузыря и кожи амфибий. Однако, сведения о роли холинергаческой системы в регуляции стимулированного водного транспорта (СВТ) в АДГ-чувствительном эпителии единичны и получены без использования селективных лиган-дов М-ХР. На мочевом пузыре кабы было показано, что карбахолин (0.1-1 мМ) угнетает водный транспорт, стимулированный аргинин-ва-зопрессином (Arruda, Sabatlnl.1980). Авторы связывали этот эффект с активацией М-ХР и с усилением входа кальция в эпителиальные клетки. Это было подтверждено исследованиями Snyder et al (1991), показавшего роль фосфоинозитидов в торможении карбахо-лином АДГ-стимулированного водного транспорта. Ранее в нашей лаборатории было установлено, что высокие дозы ацетилхолина (1 Ш) угнетают СВТ через стенку мочєеого пузыря лягушки (Багров,Манусо-ва,1978; Багров и соавт,1991). Этот эффект ацетилхолина не снимался ни атропином, ни кальциевыми блокагорами,. как в опытах Аггийа, Sabatlni,1980, но парадоксально торлозился ингибиторами ацетилхолинэстеразы, что позволило объяснить его взаимодействием ацетилхолина с ацетилхолинэстеразой и предположить ее наличие в эпителии мочевого пузыря лягушки.
Помимо большого научного интереса, который представляют- механизмы действия хсшшергических средств на СВТ в эпителии мочевого пузыря амфибий, широко используемого в экспериментах функционального аналога собирательных трубок, изучение этих механизмов должно внести вклад в решение фундаментального вопроса о принципах и механизмах взаимодействия нервной и эндокринной сие-' темы в процессе контроля за конкретной Физиологической функцией (здесь - гидроосмотический транспорт вода и поддержание водно -солевого баланса). В настоящее время решение этой проблемы выходит на новый уровень. Для многих гормонов и биологически активных веществ активно исследуются внутриклеточные механизмы, которые обеспечивают возможность воздействия на них. После обнаружения в конце 80-х годов пяти подтипов М-ХР, началось бурное изуче-
ниє способов сопряжения различных М-ХР с внутриклеточными системами передачи сигнала. Эти работы проводятся в основном на культурах клеток различных тканей или на клетках с экспрессиро-ванными в них М-ХР определенного тина. К настоящему моменту назрела необходимость проверки того, как реализуются обнаруженные на культурах клеток закономерности при обеспечении конкретных функций.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является определение типов М-ХР эпителия мочевого пузыря лягушки Rana temporarla, характера их регулирующего влияния на стимулированный вазопрессином водный транспорт, а также способов сопряжения этих рецепторов с компонентами внутриклеточной системы передачи сигнала, которые участвуют в осуществлении антидиуретической реакции. Были поставлены следующие задачи:
-
Определение характера влияния различных подтипов М-ХР на стимулированный /що водный транспорт прт использовании селективных агонистов и антагонистов Ml и М2 холинорецепторов;
-
Анализ внутриклеточных механизмов, которые обеспечивают модуляцию СВТ холиномиметиками, при помощи ингибиторов и активаторов внутриклеточных ферментов, задействованных в гидроосмотическом эффекте АДГ: еденилатциклазы, фосфодиэстеразы цАМФ, фосфолипазы С, фосфолипазы А2, протеинкиназы С, кальмодулина. тирозинкиназы.
-
Характеристика эндогенной холинергической системы мочевого пузыря лягушки: проверка эпителия на наличие в нем ацотилхолинэсте-разы, а также способности эндогенного ацетилхолина модулировать СВТ через разные типы М-ХР.
Научная новизаа работы. Впервые охарактеризованы компоненты холинергической системы АДГ-чувствительного эпителия и проведено всестороннее исследование роли различных типов М-ХР в регуляции стимулированного водного транспорта и внутриклеточных механизмов, с помощью которых эта регуляция осуществляется. Так, никогда ранее не было показано наличие ацетилхолинэстеразы в эпителиальных тканях. Вперше обнаружено и проанализировано стимулирувшее действие хажь<ургичэсккх средств на СНГ. На эпителии мочевого пузыря впервые обнаружено стимулирующее действие протеинкиназы С на заключительных этапах внутриклеточного каскада антидиуретической реакции. Абсолютно новыми являются данные об участии тирозинкиназ в передаче сигнала с рецепторов вазоирессина.
Научно-практическая цєііяость. Мочевой пузырь амфибии является функциональным аналогом дистального сегмента нефрона млекопитающих и широко используется в качестве тест-объекта для исследования механизмов действия антидиурэтического гормона (АДГ), альдостероне и ряда других биологически активных веществ. Получешше в работе результаты расширяют современные представления о механизмах развития и регуляции гидроосмотического действия вазопресси-на, о роли нервной системы в этой регуляции. Это дает дополнительные сведения о возможных механизмах нарушения водно-солевого равновесия и способах их фармакологической коррекции. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на XII Международном конгрессе по фармакологии (Монреаль, 1994); Симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994); IV Всероссийской конференции "Нейроэн-докринология-95" (Санкт-Петербург, 1995); Международной школе по обработке информации в клетках и тканях (Ливерпуль.1995). По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых научных журналах.
Структура и объеы диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет /3^2. страниц. Диссертация содержит 31 рисунок на 31 странице. Список цитируемой литературы содержит /<Г/ наименований.