Влияние гипотермии и осмотически активных веществ на спектральные характеристики электрической активности мозга крыс Рабаданова Зухра Гусейновна

Современные представления о механизмах электрической активности мозга

В 1987 г. было показано, что относительно небольшое понижение температуры мозга (3-5С) оказывает значительный, по сравнению с нормотермией, защитный эффект при глобальной ишемии мозга (Busto R. et al., 1987). Работа Бусто с сотрудниками привлекла значительный интерес к гипотермии как у врачей, так и у экспериментаторов (Ginsberg М. et al., 1992; Maher J., Hachinski V., 1993; Colbourne F., 1997; Baron F. et al, 1997; Wagner C., 1999; Bernard S. et al., 2002; Maier C., Steinberg G., 2004). Это дало основание считать возможным применение гипотермии в лечении последствий ограничения подачи крови и кислорода в центральную нервную систему. В дальнейшем умеренная гипотермия стала применяться при лечении ишемии мозга (Kollmar R. et al., 2007; van der Worp H. et al., 2010; Ginsberg M. et al, 1992; Baron F. et al, 1997), при травмах спинного и головного мозга (Sahuquillo J., Vilalta А., 2007: Zhao Q.-J. et al., 2011; Dietrich W. et al., 2009; Dietrich W., Bramlett H., 2010; Dietrich W. et al., 2011), а также при серьезных нарушениях других органов.

Охлаждение может благотворно повлиять на патофизиологический каскад, инициированный травмой головного мозга, который может привести к отеку, судорогам и апоптозу (Schmitt F. et al., 2006; Rossetti Lowenstein, 2011).

Применение гипотермии стало уже стандартной процедурой в практике реанимации взрослых после остановки сердца и новорожденных при перинатальной гипокси-ишемической энцефалопатии (Polderman К., Herold L, 2009).

Ограниченные клинические и более обширные экспериментальные данные на животных показали, что мягкая гипотермия (32-35С) может помочь в управлении над судорожными состояниями (Motamedi G. et al., 2013), а также может быть использована для торможения эпилептических припадков, причем с помощью применения имплантированных устройств, встроенных непосредственно в мозг животных (Rothman S., 2009; Fuji М. et al, 2012). Но вместе с тем, наблюдались и осложнения, вызванные гипотермией: фибрилляция желудочков сердца, понижение артериального давления, ацидоз, коагуляция, нарушение сенсорных структур, повышение чувствительности к инфекциям (Mallet М., 2002; Maier СМ., Steinberg G., 2004; Lyden P. et al, 2006). Причем эти патологические эффекты усиливаются при углублении и пролонгировании гипотермического состояния.

В настоящее время гипотермические состояния у млекопитающих классифицируют по глубине следующим образом: поверхностная (мягкая) - (32-35С), умеренная (28-32С), глубокая (20-28С), сверхглубокая (20-28С) (Polderman К., 2009; KufflerD., 2012).

В случае применения пролонгированной гипотермии, подавление уровня метаболизма является решающим фактором в тех случаях, когда необходимо приостановить кровоснабжение того или иного органа. В то же время, эксперименты in vitro по исследованию выживаемости нейронов спинного мозга под действием гипотермии показали, что охлаждение до 17С в течение 2-х часов и последующее согревание до 37С значительно увеличивали выживаемость пораженных клеток. Однако протекторный эффект гипотермии был утрачен после применения 6-ти часового охлаждения (Lucas Н. et al., 1994).

Такие процессы как проведение нервного импульса, возбудимость, способность к хранению и переработке поступающей информации, обновление и образование синаптических структур требуют значительных энергетических затрат. Основные энергетические затраты в головном мозге обеспечиваются за счет аэробных окислительных процессов, протекающих в митохондриях клеток. Кислород занимает особое место в этих процессах и является необходимым компонентом. По количеству поглощаемого кислорода головной мозг занимает ведущее место. Известно, что понижение температуры тела млекопитающего всего на один градус понижает уровень потребления кислорода мозгом на 5% (Erecinska М. et al., 2003). В подтверждение данного факта уже 2008 году немецкие ученые (Saur J. et al., 2008), исследуя пациентов с тяжелыми травмами головы, сообщили, что каждое понижение температуры тела на 1С приводило к сокращению потребления энергии на 5,9%. Тем самым они показали, что существует тесная линейная корреляция между температурой тела и основным обменом.

Хотя на долю мозга приходится всего лишь 2% от всей массы тела потребление кислорода в состоянии покоя составляет примерно 20% от общего (Schmidt-Nielsen К., 1997). А потребление энергии более чем в семь раз выше, чем у других органов (Ames А., 2000). Большая часть энергии расходуется на поддержание и восстановление мембранного потенциала нервных клеток. Биофизические измерения показывают, что- 104 молекул АТФ требуется для передачи сигнала по химическому синапсу и 106-107 молекул АТФ используется для кодирования информации (Lauglilin S. et. al., 1998). Активный транспорт ионов обусловлен в мозге, во-первых, генерацией потенциалов покоя, во-вторых, генерацией потенциалов действия. При нормотермии на генерацию потенциалов действия приходится примерно 50% энергии, расходуемой на электрогенез в целом (Sokoloff L., 1999). Однако не следует забывать о метаболически активных глиальных и эндотелиальных клетках, играющих важную роль в нейрональной миграции, построении слоев коры мозга и мозжечка, и число которых значительно выше, чем тех же нервных.

Многочисленные данные свидетельствуют о том что, повышенный метаболизм мозга сопровождается локальным увеличением циркуляции потока крови, оценка эффективности которого может послужить мерой функциональной активности мозга (Kiyatkin Е., 2010). Кияткин, изучая отношение локальной температуры мозга и интенсивности тока крови, предположил, что тепло, выделяемое мозгом, является «побочным продуктом» метаболической активности, который играет важную роль в интеграции, включая и объединяя многочисленные центральные нейроны мозга. Очевидно, что данный тип межнейронной связи является не главным и не самым эффективным, однако, он мог бы иметь адаптивное значение, так как большинство физических и химических процессов регулируется температурой и вычисляется коэффициентом Вант-Гоффа (Qio). Эксперименты, проводимые in vitro на клетках мозга, показали различные эффекты температурной зависимости пассивных свойств мембран и генерации одного или нескольких спайков, индуцированных электрическим стимулированием (Tryba A., Ramirez J-M., 2004; Lee J. et al., 2005).

Влияние гипотермии на электрическую активность мозга

В предыдущем подразделе был экспериментально подтвержден факт исчезновения электрической активности мозга крыс при температуре 18-20С. Возникает вопрос, почему именно при этой температуре прекращается электрическая активность мозга? Одной из причин может быть дефицит энергии при низких температурах тела. С другой стороны, сами электрофизиологические процессы (даже в отсутствии дефицита энергии) также температурозависимы. Поэтому снижение электрической активности может происходить и в отсутствие нехватки энергии. Недостаточность сведений в литературных источниках об электрогенезе температурной зависимости ЭЭГ при общем охлаждении животного побудили нас искать способы эффективного воздействия на метаболизм с целью его коррекции. В этом отношении наше внимание привлек ацетамид - молекулярный аналог мочевины. Одной из причин, по которой ацетамид был выбран в качестве модулятора электрической активности мозга при гипотермии, были результаты работ Кричевской с сотр. (Кричевская А. и др., 1983) и Абдурахманова (Абдурах-манов Р., 2002), в которых было показано, что внутрибрюшинное введение мочевины крысам перед охлаждением приводит к значительному увеличению выносливости крыс при глубокой гипотермии. Одним из возможных объяснений этого феномена может служить то, что мочевина действует как осмолитик, который предотвращает развитие отека мозга при низких температурах тела. В структурном отношении молекула ацетамида близка к мочевине, защитное действие которой было убедительно показано в предыдущих исследованиях. Поэтому представлялось интересным исследовать влияние введения ацетамида на электрическую активность мозга при гипотермии.

Вариант реакции №1 наркотизированной крысы на введение ацетамида при гипотермии. На рис. 13 приведены ЭЭГ и их спектральные мощности на фоне введения ацетамида в дозе 3 мМ на 100 г веса тела. Спектр мощности представляет типичную картину, при которой заметны колебания до 15 Гц. При охлаждении амплитуда колебаний постепенно возрастает, а при ректальной температуре 24С появляются колебания в области тета-ритма 4-6 Гц (рис. 15). В дальнейшем, по мере снижения температуры тела, этот пик смещается в область низких частот, и при температуре тела 15С частота тета-ритма составляет 1.2 Гц, при этом ЧСС 2уд/сек. При согревании электрическая активность мозга появляется уже при 22С, однако более или менее ритмические колебания появляются при температуре 24С. В дальнейшем, в спектре мощности, как и в предыдущих опытах, появляются другие частоты. В диапазоне температур 27-17С Qio равен 2,3.

Как и прежде, при введении ацетамида наблюдается гистерезис в цикле охлаждение-согревание, то есть доминирующая частота при охлаждении выше таковой при согревании (рис. 14А). Температурная зависимость Чээг в Аррениу-совских координатах удовлетворительно описывается двумя линейными участками, с характерными энергиями активаций 6 ккал/моль выше точки излома и 36 ккал/моль ниже точки излома. Точка пересечения линейных участков соответствует температуре тела 21С (рис. 14В).

С самого начала при температуре 36С распределение потенциалов на ЭЭГ близко к нормальному (рис. 15.) при этом коэффициенты А=0,02 и Е=0,15. Интересно отметить, что даже при 24С оно "подчиняется" нормальному закону распределения (А=0,2; Е=1,2). Такая же картина наблюдается и при согревании. Таким образом, введение ацетамида привело к снижению критической температуры, при которой ЭЭГ становится изоэлектрической, понизило температуру, при которой появляется доминирующая полоса, соответствующая тета-ритму, и устранило полимодальность в распределении биопотенциалов на ЭЭГ. tC

Гистограммы распределения биопотенциалов ЭЭГ крысы при гипотермии на фоне введения ацетамида. По оси абсцисс - разность потенциалов в мкВ, по оси ординат -частота встречаемости данного значения разности потенциалов в ЭЭГ. Сплошная линия соответствует ожидаемому нормальному распределению. (Справа) Отдельно приведены графики спектральной плотности при различных температурах тела животного. Вариант реакции №2 животного на введение ацетамида. На рис. 16 приведены данные опыта, в котором также вводился ацетамид. Начальная температура 36С. Спектр мощности представляет собой картину с некоторым набором частот, которые заметны в довольно широком диапазоне от 0 до 15Гц. Появление изолированного пика в области тета-ритма наблюдается примерно при 27С. Дальнейшее снижение температуры тела животного приводит к смещению пика в область низких частот. В диапазоне температур 29-19С Qio равен 2,1. ЭЭГ становится изоэлектрической при температуре тела 15С. При согревании вновь появляется полоса в низкочастотной области, частота которой смещается в область высоких частот по мере повышения температуры тела. Гистерезис существенный и составляет примерно 7С, что хорошо видно на рис. 17А. В Аррениусовских координатах температурная зависимость Чээг аппроксимируется двумя линейными участками, с эффективными энергиями активаций 8 ккал/моль выше точки излома и 40 ккал/моль ниже точки излома (рис. 17В). Точка пересечения линейных участков соответствует 21 С. Из рис. 18 видно (левая панель), что и в этом опыте распределение биопотенциалов близко к нормальному. При температуре 36С распределение потенциалов на ЭЭГ близко к нормальному и коэффициенты А=0,01 и Е=0,3. Интересно отметить, что даже при 25С оно подчиняется нормальному закону распределения (А=0,19; Е=0,7). Однако, все меняется при температуре 15С. Если при этой температуре коэффициент асимметрии равен 0,05, что допустимо для показателя нормальности, то для эксцесса наблюдается значительное отклонение и равняется 6. Такая же картина наблюдается и при согревании. В целом, изменения, вызванные введением ацетамида, хорошо воспроизводятся.

Влияние внутрибрюшинного введения сахарозы на электрическую активность мозга крыс при гипотермии и согревании

Как следует из вышеприведенных данных, при гипотермии введение ацетамида привело к существенному снижению температуры, при которой электроэнцефалограмма становилась плоской. Кроме того, в цикле гипотермия-согревание с введением ацетамида распределение биопотенциалов ЭЭГ оказалось близким к нормальному. Введение реополиглюкина при гипотермии также понизило критическую температуру исчезновения колебаний на ЭЭГ, но он не устранил гистерезиса, а, наоборот, увеличил его. Поскольку реополиглюкин в большей степени влияет на кровоснабжение мозга, улучшая, тем самым, его доступность, можно было бы ожидать, что совместное введение этих двух веществ усилит криопро-текторный эффект ацетамида на параметры электрической активности мозга при гипотермии и последующем согревании.

Вариант реакции №1. На рис. 40 приведены ЭЭГ и их спектральные мощности на фоне введения ацетамида с реополиглюкином. Исходная ЭЭГ имеет спектральную плотность, которая выражена пятью пиками, в диапазоне 2-8 Гц. По мере снижения температуры тела до 32С появляется уединенная доминирующая полоса с центром 3 Гц. В дальнейшем, этот пик смещается, но совершенно незначительно. При 20С это смещение составило всего 2 Гц. Qio в диапазоне 32-22С составил всего 1,25. Из рисунка видно, что при температуре тела 16С ЭЭГ регистрируется, причем электрическая активность довольно существенна. Тем не менее, дальнейшее охлаждение прекратили, опасаясь его пагубного эффекта на состояние животного. Согревание крысы привело к увеличению электрической активности. Доминирующая частота стала смещаться в область высоких частот. ЭЭГ при 36С после согревания довольно близка к исходной ЭЭГ до начала охлаждения. В данном случае обнаружились 2 важных факта: очень слабая зависимость тета-ритма от температуры (Qio=l,25) и отсутствие существенного гистерезиса в цикле охлаждение-согревание (рис. 41 А). Однако обращает на себя внимание еще и отсутствие точки излома на графике температурной зависимости Чээг в Аррениусовских координатах при гипотермии (рис. 41В). Температурная зависимость доминирующей частоты на ЭЭГ хорошо аппроксимируется прямой с эффективной энергией активации 11 ккал/моль.

Распределение биопотенциалов во всех состояниях очень близко к нормальному, как при охлаждении, так и при согревании (рис. 42). При температуре 36С до начала охлаждения и после согревания коэффициенты асимметрии и эксцесса близки к значениям нормального распределения. В то же время, промежуточным состояниям в цикле охлаждение-согревание характерны отклонения от нормальности, но не столь значительные относительно контроля. При этом ЧСС, когда ректальная температура 16С 2 уд/сек, что также свидетельствует о более эффективном протекторном свойстве ацетамида на фоне реополиглюкина при критических для организма температурах. С нашей точки зрения, это говорит о более высокой электрической активности нейронов при гипотермических состояниях в результате сочетанного введения ацетамида с реополиглюкином. tC

Слева) Электроэнцефалограммы крысы для различных температур тела при охлаждении и последующем согревании на фоне сочетанного воздействия ацетамида и реополиглю-кина. Масштаб по вертикали - 400 мкВ, по горизонтали - 1 с. (Справа) Частотная зависимость спектральной плотности ЭЭГ при различных температурах тела при охлаждении и согревании. По оси абсцисс - частота в Гц, по оси ординат - спектральная плотность в процентах от общей плотности в диапазоне от 0 до 15 Гц, принятой за 100%. Сверху вниз - охлаждение и затем согревание.

Гистограммы распределения биопотенциалов ЭЭГ крысы на фоне сочетан-ного воздействия ацетамида и реополиглюкина. По оси абсцисс - разность потенциалов в мкВ, по оси ординат - частота встречаемости данного значения разности потенциалов в ЭЭГ. Сплошная линия соответствует ожидаемому нормальному распределению. (Справа) Отдельно приведены графики спектральной плотности при различных температурах тела животного. Вариант реакции №2. На рис. 43 приведены данные следующего опыта введения ацетамида с реополиглюкином. Перед началом охлаждения на ЭЭГ присутствуют достаточно мощные колебания в диапазоне 2-9 Гц, распределение потенциалов близко к нормальному. Как и прежде, снижение температуры тела приводит к смещению центра тяжести в область низких частот. При температуре 15С ЭЭГ - практически изоэлектрическая. В ходе согревания электрическая активность уже при незначительном повышении температуры тела заметно возрастает. ЭЭГ полностью восстанавливается при 36С, хотя картина спектра мощности отличается от таковой перед началом охлаждения. Несмотря на то, что температура тела была понижена до 15С, заметно отсутствие гистерезиса (рис. 44А). Частота дыхательных движений при этой температуре составляет 18/мин и сердечных сокращений 2 уд/сек. Коэффициент Qio в диапазоне 34-24С составил всего 1,36. Как и в предыдущем опыте, график температурной зависимости доминирующей частоты в Аррениусовских координатах хорошо описывается прямой с эффективной энергией активации 15ккал/моль (рис. 44В). Отклонение от нормального распределения в динамике охлаждения-согревания незначительно (рис. 45).

Следуя логике наших рассуждений, отсутствие гистерезиса обусловлено отсутствием отека мозга, а снижение электрической активности обусловлено исключительно температурным фактором. Этот редкий случай - отсутствие гистерезиса - указывает на значительные потенциальные возможности организма крыс противостоять глубокому охлаждению, по крайней мере, в случае сочетанного действия ацетамида и реополиглюкина в качестве криопротекторов.

Влияние внутрибрюшинного введения ацетамида и реополиглюкина совместно на электрическую активность мозга крыс при гипотермии

Суммарная электрическая активность нейронов представлена различными частотными диапазонами и имеет характер нормального распределения, описываемого куполообразной гистограммой. Количественной мерой оценки отклонения от нормальности распределения разностей потенциалов являются коэффициенты асимметрии и эксцесса. Нормальность распределения, выраженная через эти коэффициенты, определяется значением, которое должно укладываться в диапазон (-1 до 1). Коэффициент асимметрии - это свойство распределения выборки, которое характеризует несимметричность распределения случайной величины и показатель островершинности - эксцесс.

В табл. 3 приведены средние значения асимметрии и эксцесса до начала охлаждения и после согревания, а также при температурах характерных промежуточным состояниям. Из таблицы, что внутрибрюшинное введение осмотически активных веществ по-разному повлияло на показатели островершинности и симметричности гистограмм распределения биопотенциалов ЭЭГ.

Введение ацетамида привело хотя и не статистически значимому, но все же близкому к показателям нормальности распределения при низких температурах относительно контроля. Статистически значимому приближению к показателям нормальности привело сочетанное введение ацетамида с реополиглюкином. Нормальное распределение наблюдается в тех случаях, когда случайная величина является суммой большого числа случайных величин, каждая из которых вносит малый вклад по сравнению с общей суммой. При уменьшении числа нейронов, вносящих свой вклад, уменьшается как объем выборки, так и соотношение числа разных групп нейронов, вносящих вклад в ЭЭГ.

Разные клетки могут обладать разной температурной зависимостью электрической активности, поэтому популяция нейронов, которая вносит вклад в ЭЭГ, неоднородна. Существенные изменения гистограмм распределения, наблюдаемые при низких температурах, говорят о том, что значительное число нейронов перестают вносить вклад в ЭЭГ.

При большом числе нейронов эта неоднородность сглаживается и распределение потенциалов близко к нормальному распределению. При уменьшении числа активных нейронов, эта гетерогенность проявляется. В конечном итоге, гистограмма может стать полимодальной, как в случае с введением сахарозы. При согревании тела животного, соответственно и мозга, все большее число нейронов активируется, и характер гистограмм распределения потенциалов вновь приближается к нормальному.

Ритмические колебания в сложных системах поддерживаются специальными механизмами (динамической сетью нейронов), математическое описание которых обычно проводится методами качественного анализа дифференциальных уравнений. С математической точки зрения, устойчивым колебаниям в динамической системе соответствует предельный цикл фазового пространства данной системы. При анализе механизмов генерации ритмической активности нервной системы было предложено два механизма возникновения предельных циклов (Ег-mentroutB.,2005): бифуркация Хопфа; появление на фазовом портрете особой точки типа седло-узел.

Считается, что первый механизм имеет локальный характер, то есть цикл рождается в точке бифуркации (фазовый портрет не меняется). А второй механизм имеет глобальный характер, так как является свойством фазового портрета, наличием особой точки седло-узел, вокруг которой и возникают колебания (Bori-syukA. etal.,2005).

Эти модели используются для описания спайковой активности нейронов. Между характером спайковой активности нейронов и тета-ритмом существует определенная взаимосвязь. Поэтому эти модели могут быть применены для анализа тета-ритма. Одним из управляющих параметров, который может влиять на частоту тета-ритма, является постоянный ток, текущий через мембрану. Температурная зависимость этого тока может определять температурную зависимость частоты тета-ритма.

Вместе с тем, согласно классификации пирамидальных нейронов, предложенной Ходжкиным еще в 1952 году, существует два класса нейронов. Первый класс может генерировать спайки с различной частотой при изменении входного тока, и он имеет гладкую зависимость частоты импульсации от входного тока, а второй класс нейронов может генерировать спайки, только начиная с некоторой критической частоты, и поэтому зависимость частоты импульсации от входного тока имеет ступенчатый характер. В соответствии с этими двумя механизмами ге 105 нерации спайков, первый класс нейронов называют сумматорами, а второй - резонаторами. Одни и те же нейроны могут в зависимости от условий функционировать как интеграторы, так и резонаторы или осцилляторы (Prescott S., et al., 2008; Borkowski L., 2012). Эти различия между нейронами обусловлены соотношением медленных и быстрых токов, текущих через мембрану. Причем входящие токи конкурируют с выходящими, а результат определяется как величинами этих токов, так и их кинетическими особенностями. Плавное смещение частоты тета-ритма при снижении температуры тела указывает на то, что генераторы этого ритма состоят из нейронов первого класса. По мере снижения температуры тела величина входных и выходных токов изменяется. Изменяются и кинетические характеристики этих токов. В конечном итоге частота уменьшается.

В настоящее время мы не можем сказать точно, каков механизм изменения спектра мощности ЭЭГ при гипотермии у крыс. Известно, что от температуры зависят все химические и физические процессы, в том числе и константы, которые используются при построении математических моделей колебаний в нервной системе. Резкое изменение спектра мощности при незначительном снижении температуры тела может быть связано с переходом нейронов, задающих ритм колебания, из класса один в класс два, то есть, из режима сумматора в режим резонатора. Смена механизма инициации спайков нейронов может произойти многими способами, как это следует из теоретического рассмотрения этих процессов Прескот-том и его сотрудниками (Prescott S. et al., 2008). Дальнейшие исследования должны прояснить функциональные и молекулярные механизмы изменения спектрального состава ЭЭГ при различных температурах мозга.