Введение к работе
Актуальность исследования. Исследование модуляции синап-тической передачи является одной из актуальных областей нейрофизиологии, так как позволяет выявить механизмы, определяющие эффективность работы синапса.
Модуляция синаптической передачи может осуществляться при участии гуморальных агентов, присутствующих в самом организме, в частности, медиаторов, гормонов и продуктов их метаболизма (Кирзон, Каменская, 1969; Гусева, Пушкарев, 1970; Полетаев, 1972, 1974; Матюшкин, 1980, 1989; Зефиров, Шакирьянова, 1993). Вызванная квантовая секреция медиатора чрезвычайно чувствительна к изменениям мембранного потенциала нервного окончания во время распространяющегося нервного импульса (Gage, 1967; Katz, Miledy, 1967; Kusano et al.,1967; Molgo, Thesleff, 1982; Van der Kloot, Molgo, 1994), следовательно, модулируя характеристики потенциала действия нервной терминали, можно регулировать функции синапса. Действие физиологически активных веществ может осуществляться путем изменения этих характеристик.
Феномен облегчающего эффекта катехоламинов (адреналина и норадреналина) на синаптическую передачу давно привлекает внимание исследователей. Впервые заметное увеличение работоспособности предварительно утомленного нервно-мышечного препарата при раздражении симпатического нерва было показано Ор-бели и Гинецинским (Орбели, 1923; Гинецинский, 1926). Изучению механизмов влияния катехоламинов на нервно-мышечную передачу были посвящены работы ряда исследователей (Jenkinson et al., 1968; Hidaka, Kuriyama, 1969; Кирзон, Каменская, 1969; Kuba, 1970; Полетаев, 1974; Bergman et al., 1981; Van der Kloot, Van der Kloot, 1986; Wessler, Anschutz, 1988; Chen, Dryden, 1991; Zi, 1991), что послужило основанием для развития представлений об "адаптационно-трофической функции" симпатоадреналовой системы.
В то же время было обнаружено, что физиологической активностью обладают не только молекулы катехоламинов, но и их естественные метаболиты, относящиеся к классу фенольних соединений (Утевский, 1964, 1969; Матлина, Меньшиков, 1967; Полетаев, 1972, 1974; Халилов и др., 1993). В частности, было показано облегчающее действие фенолов на нервно-мышечную передачу в скелетных мышцах теплокровных и холоднокровных животных (Rothberger, 1902; Mogey, Young, 1949; Otsuka, Nonomura, 1963; Kuba, 1969; Blaber, Gallagcr, 1971; Полетаев, 1972, 1974; Флеров, 1977; Takashi, 1983; Koh-lclii, Takashi, 1985). Установлено, что фенол и его производные вызывают значительное усиление спонтан-
ного и вызванного освобождения медиатора путем воздействия на мембрану нервного окончания (Otsuka, Nonomura, 1963; Kuba, 1969; Blaber, Gallager, 1971; Полетаев, 1972, 1974; Anderson, Harvey, 1988; Халилов и др., 1993). Однако, пресинаптические механизмы модулирующего действия этих соединений остаются невыясненными. Не исследовано их влияние на электрогенез мембраны нервной терминали, неизвестны ионные механизмы облегчающего эффекта фенолов.
Изучение влияния фенолов на нервно-мышечную передачу представляет интерес еще и потому, что фенолы являются одними из наиболее опасных токсических веществ, содержащихся в стоках ряда производств (Грушко, 1982). Признаки отравления водных животных рядом фенольных соединений (состояние возбуждения и увеличение двигательной активности, переходящее в судороги и паралич) (Флеров, 1977; Лукьяненко, 1983; Лукьянов, Фролов, 1983) также свидетельствуют о нарушении синаптической передачи.
В связи с этим нам представлялось интересным изучить конкретные механизмы действия продуктов естественного метаболизма гормонов и медиаторов симпатоадреналовой системы на вызванную секрецию медиатора, а также механизмы нейротоксического действия экзогенных фенолов при отравлении организма.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение пресинаптических механизмов влияния фенольных веществ на нервно-мышечные соединения холоднокровных и теплокровных животных.
В соответствий с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать влияние группы фенольных соединений на спонтанную и вызванную квантовую секрецию медиатора.
-
Изучить влияние ряда фенольных веществ на электрические ответы в различных участках двигательного нервного окончания в нервно- мышечных соединениях кожно-грудинной мышцы лягушки и диафрагмальной мышцы мыши.
-
Исследовать тонкие механизмы действия фенолов на ионные токи двигательного нервного окончания лягушки.
Научная новизна. Исследовано действие ряда фенольных соединений (фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, орто-крезол, пирогаллол) на параметры ответа нервного окончания и секрецию медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. Установлено. что наибольшим а<|хрсктом на прссинаптнчсскос звено синаптической передачи среди исследовавшихся фенолов обладает нирока-
техин, имеющий две гидроксильные группы в орто-положении. В работе впервые проведено детальное исследование действия пирокатехина на ионные токи двигательного нервного окончания лягушки. Установлено, что причиной усиления секреции медиатора под действием фенольных веществ является увеличение длительности потенциала действия нервного окончания вследствие затягивания потенциалзависимого калиевого тока, что приводит к усилению входа кальция в нервігую терминаль. Получены новые данные о модулирующем влиянии фенолов на потенциалзависимый калиевый ток мембраны нервной терминали. Показано, что и в нервно-мышечном соединении мыши пирокатехин также изменяет калиевый ток двигательной нервной терминали.
Положения, выносимые да защиту
-
В нервно-мышечном соединении лягушки фенольные вещества изменяют кинетику развития потенциалзависимого калиевого тока мембраны нервного окончания.
-
Изменение кинетики развития потенциалзависимого калиевого тока является главной причиной усиления вызванной секреции медиатора.
-
В ряду фенольных соединений (фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, ортогкрезол, пирогаллол) наибольшим облегчающим эффектом на вызванную секрецию медиатора обладает пирокатехин.
Научио-практическая ценность. Проведенное исследование имеет важное теоретическое1 значение. Полученные результаты позволяют сделать вывод о механизмах модулирующего влияния фенольных соединений на нервно-мышечную передачу. В работе показано, что пирокатехин и другие фенолы оказывают модулирующий эффект на работу потенциалзависимых калиевых каналов, что проясняет причины усиления секреции медиатора при действии фенолов. Выявлено наиболее эффективное соединение в ряду фенолов, что дает возможность анализа структуры молекулярных компонентов потенциалзависимых калиевых каналов, ответственных за их активацию, а также могут явиться основой для целенаправленного синтеза веществ, модулирующих работу ионных каналов нервного окончания и усиливающих синаптическую передачу. Эти соединения могут быть использованы для лечения некоторых заболеваний нервно-мышечного аппарата. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о способах преси-наптичсской регуляции работы нервно-мышечного синапса, о ме-
ханизмах, лежащих в основе регуляции секреции медиатора из двигательного нервного окончания.
Результаты исследования имеют практическую ценность для физиологов, фармакологов и токсикологов при изучении влияния биологически активных и нейротоксических веществ на функции синапса.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991), на 1-ом съезде Физиологического общества России (Москва-Пущино, 1993), на Республиканской научной конференции физиологов, посвященной 95-летию со дня рождения М.В.Сергиевского (Самара, 1993), на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Казанского государственного университета и Казанского педагогического университета (Казань, 1995).
Реализзшм результатов ксследовалмп. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Результаты исследований включены в лекционный курс по физиологии человека и животных, в спецкурс по физиологии возбудимых систем, молекулярной биологии для студентов Казанского государственного университета и в лекционный курс по нормальной физиологии для студентов Казанского государственного медицинского университета.
Структура ц объем диссертации. Диссертация объемом 107 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 218 названий, из них 46 отечественных и 172 иностранных авторов. Диссертация содержит 17 рисунков и 5 таблиц.
Эксперименты проводили на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки Rana ridibunda в осенне-зимний период и диафрагмальной мышцы белых мышей.
Нервно-мышечный препарат выделяли и помещали в стеклянную ванночку с рабочим объемом 3 мл. Мышцу растягивали на 110-120% от первоначальной длины при помощи стальных крючков. Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата со скоростью 5 мл/мин.
Для работы с холоднокровными животными использовали стандартный раствор Рингера следующего состава (в ммоль/л): NaCl-118.0; KCl-2,5; СаС12-1,8; NaHC03-2,4, температура -20С, рН - 7,2-7,4. В экспериментах на мышах препарат перфузировали рас-
твором Кребса следующего состава (в ммоль/л): NaCl-154,0; КС1-5,0; NaH2PO4-l,0; СаС12-2,0; MgCl2-l,0; глюкоза-11, температура 22С, рН - 7,2. До начала опыта раствор Кребса насыщали карбогеном (02-95%, С02-5%) в течение 30-40 мин, а также аэрировали раствор во время эксперимента.
Для устранения потенциала действия (ПД) и сокращения мышечных волокон использовали раствор с пониженным содержанием ионов Са2+ (0,3-0,4 ммоль/л - для холоднокровных; 0,6-0,8 ммоль/л - для теплокровных) и повышенным содержанием ионов Mg2+ ( 2-4 ммоль/л для холоднокровных; 6-8 моль/л для теплокровных). В ряде опытов в раствор добавляли тубокурарин в концентрации 3x10-6 - 3x10-5 моль/л.
Электрические ответы нервного окончания и концевой пластинки отводили внеклеточно при помощи стеклянных микроэлектродов из стекла "Пирекс". Из-за маленького рабочего расстояния микроскопа (2 мм) вытянутый электрод изгибался нагреванием в двух местах. Микроэлектроды с внутренним диаметром кончика 1-3 мкм и сопротивлением 2-5 МОм заполняли раствором NaCl (2 моль/л).
Для визуализации поверхностно расположенных нервных окончаний и подведения к ним микроэлектродов использовали оптическую систему на базе поляризационно-интерференционного микроскопа "Биолар" (увеличение хЗОО, х400), позволяющего увидеть живые неокрашенные нервные терминали.
Раздражение двигательного нерва производили прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0,15-0,2 мс сверхпороговой амплитуды при помощи стимулятора ЭСЛ-2.
Для усиления биопотенциалов использовали двухканальный усилитель на интефальных микросхемах. После усиления сигналы усредняли и регистрировали с экрана осциллофафа С1-83 с использованием автоматизированной системы на базе IBM РС-АТ286. Усредненные ответы (30-50 реализаций, интервал измерения 25 мкс) выводились на печать или анализировались с экрана компьютера.
Квантовый состав тока, концевой пластинки (ТКП) - m -определяли по формуле: m= lnN/N|, где N - количество раздражений, Nt - количество раздражений, не вызвавших ТКП (Каменская, 1972).
Определяли следующие параметры ответа нервного окончания: длительности и амплитуды второй и третьей фаз ответа.
Экспериментальные данные обработаны общепринятыми статистическими методами (Лакин, 1990). Для оценки достоверности различий использовали t-критсрий Стьюдента.