Влияние денервации и некоторых физико-химических факторов на сокращение скелетных мышечных волокон лягушки Ониани, Николай Тенгизович

Введение к работе

« < (SSI

уертдций

Актуальность темы. Интегратявная деятельность мозга среди многих функций Еклшает и регулирующее влияние на периферическое звено цвигательной системы. В последнее время появилось большое количество работ /Волков Е.М..Полетаев Г.И.,1988; ^{Quth L}«. 1969; Suthnann е., [976,1977;MeArdle J.J., IS83; Ocho 3., 1974 и др./, в которых анализируется влияние нервной системы на свойства и функции скелетных лышц. Нервная система на скелетные мышцы мохет влиять: через нервную імпульсацию, с помощью которой запускается и поддерживается деятель-joe состояние мышцы; через Еыделение из нервных окончаний квантового і некЕантоЕОГо медиатора ацеталхолина (АХ) и через Еыделение из нер-зных окончаний т.н. нейротрофическях веществ переносимых ортоградным шсоплазматическим транспортом /Волков Е.М..Полетаев Г.И.,1988/. Од-1НМ из путей изучения влияния нервной системы на мышечные волокна твляется применение метода дёнервации, которая осуществляется главным збразом перерезкой нервных волокон инерЕирутащих скелетные мышцы 'Outmonn Е., 1976/. Выяснено, что денервацяя изменяет как сеэйст-щ поверхностей плазматической мембраны(ППМ), так и сократительные зпособнзсти скелетной мышцы /Наследов Г.А.,1981,1988; Gutnann е., :Э76;1977; iCotsias В.A. et al. J984 а, б и др./. В настоящее время do-tee или менее полно установлено, что е изменении свойств ППМ мышеч-юго волокна в ходе денервацяя югсчевуто роль сыграет прекращение !лияния неиротрофических веществ /Волков Е.М.,Полетаев Г.И., I9G8/. [то касается не причин изменения сократительной способности скелет-шй мышцы лягушки, происходящих при дёнервации, определенного отве-'а на этот вопрос на данном этапе не имеется.

Для понимания денерЕацяонного синдрома Банное значение имеет інанле тонких механизмов мембрано-мнофябралярного взаимоотношения, іезащего Е основе функционирования электромеханического сопряжения SMC) е скелетной fsme. Это является необходимым и для выяснения [окализация тех изменений во внутриклеточной организации мышечных олокон, которые наступают в результате более или менее длительной .енервации. Немаловажным является и разграничение тех^изменени" юкратительной способности мышечных еолокон, которые могут разЕить-я, с одной стороны в результате бездеятельности, а, с другой, в іезультате прекращения влияния различных веществ, выделяемых из нер-ных окончаний на мышечные волокна.

Вместе с тем, за последнее время для понимания тонких механизмов ОЫС, а также для выяснения лабильности и резистентности различных звеньев этой сложной системы широко изучается елияниє различных факторов модифицирующих" сократительный процесс в мышцах /Ebaahi 8., I976;3andow A., I965;Zachar J.,1971 и др./. Одним из факторов модифицирующих сократительный процесс является именно денервация, о механизме воздействия которого до сих пор нет однозначного ответа /На-СЛЄДОЕ Г.А.,І98І,І988;Кіки-Ігі Т. I964;Kisby A.O.et alI973; Kotoiao B.A.ct al., 1934 a,6; Liudley B.D.et al.I973; Stuesse 3.0.,Liudley 3.D., 1975 а,б; я др/. Другим фактором модифицирующим сократительный процесс скелетной мышцы и широко применяемым в экспериментах, является повышение осмотического давления инкубационной среды о механизме влияния которого также нет однозначного ответа /Пак А.Д.,Есы-рев 0А,,1Ш^ Пак А.Д. и др. ,1982; Anderoon К.Е. , ig73;Ca?uto 0., 1966,1968; Gordon A.M. ,Godt R.E-I970; Потвпег E.et al.I974; LUnners-ren J.,tloth J., 1973; Miamoto П., Hubbard J. 1972 и др./. Примечательно и то, что по характеру еоздєйстеиє гипертонических растворов Ео многом схож на влияние денервации, так как оба фактора вызывают угнетение сокращения скелетной мышцы е ответ на деполяризации ППМ /Andcrnon К.Е. 1973; Gordon A.M.,Godt Н. 1970; Kiku-Iri ї., 1964; Kotaiaa B.A.ot al. 1984 а,б/. Следовательно, изучение влияния денер-Еации, а также некоторых физико-химических факторов модифицирующих сократительный процесс мышечных волокон является актуальным не только е свете выяснения характера регулирующего влияния нервной системы на периферическое звено нервного аппарата, но а в свете изучения организации и функционироЕашш внутриклеточных механизмов, обеспечиваїо-щих реализации ЭМС в мышечных Еолокнах. Актуальность этих исследований определяется и тем обстоятельством, что данные, полученные на мышечных волокнах, ео многом создают основу для общего представления о природе и функции механизмов внутриклеточной сигнализации в целом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение двух проблем:

1. Влияния нервной системы на скелетные мышцы лягушки (Используя для этой цели метод денервации);

2. Влияния некоторых факторов (в том числе а денервации) модифицирующих сократительный процесс на скелетные мышцы лягушки.

Для решения указанных проблем были поставлены следующие конкретные задачи:

- изучение продолжительности срока денервации на сокращения

5 скелетной (фазной) мышцы лягушки в отеєт как на электрическое раздражение, так и на воздействие кофеина;

изучение елияяяя продолжительности срока донерзацял на мокрый и сухой вес скелетной гяащч;

язучонпе влляння предварительного титанического раздражения ка одиночные сокращения янорвирэванпой а данорввровакиой скелетной мнит;

азучонао вллялая дэрхлорат-анвопа (СЮр на одиночные сокращения анервпроЕанной а денервлрованной глишіш;

изучение влияния различных доз кофейка на знорвированкые и донорвированныз мышцы;

изучение влияния продолядтелъностз срока денерзацил ка белковый состав, на АТФазиув активность а на скорость суперпрэщгаптшяп (СПП) киозпна В, полученного дз скелетних мышц лягушки;

дзученне влиянся гипертонических растворов но сокращение скелетной мышцы как в ответ'на электрическое раздражение, так и на воздействие кофеина;

изучение влияния СЮ^ на одиночные сокращения скелетной мышцы при воздействии на них гипертонических растворов.

Научная новизна результатов доследования. Полученные нами экспериментальные данные дают возможность болео глубоко вникнуть в знтямныо внутриклеточные механизмы, осуществляющие ЗУС е скелетных мышечных волокнах в определить механизмы регулирующего влияния на них нервной системы.

Нами было впервые показано, что угнетение одиночных сокращений зависит от истощения нервно-мышечной передача (HJ.H) в депортированной сколотной атце лягушки.

Высказано предположение, что причиной угнетения одиночных сокращений доляно являться прекращение влияния пеиротрофических веществ после дегенерации нервных волокон е донервирозанной скелетной мышце.

Нами били гпервые получены данные о том, что потопцлацин кофеиновой контрактуры денорвированной >,шшцы по сравнена^ с контрактурой акервированной мьищы но зависит от истощения КИП а что этот процесс начинается с 8 дня после денервадаи.

Высказано предполонение, что причиной потешшации кофеиновой контрактуры донорвярованиой мышцы является прекращение влияния нервной импульсацви а обусловленное этим бездеятельное состояние ІЖИ-цы после перерезки двигательного нерва.

ВперЕые было показано, что е определенных условиях могут изменяться сократительные способности (выявленные под воздействием кофея на) инерЕироЕанных мышц после денервадии симметричных им скелетных мышц. Предполагается, что причиной этого является процесс хроматолиза в мэтонейронах, которые контролировали денервированныв скелетные мышцы.

Было показано, что белковый состав, АТФазная активность и ССП миозина В не меняется даже после месячного срока денервации скелетных мышц лягушки.

Нами впервые было показано, что СЮ^ мояет частично или полностью предотвращать угнетающее влияние гипертонических растворов на одиночные сокращения скелетной мышцы лягуппи.

Нами было показано, что кофеиновые контрактуры скелетной мышцы в гипертонических растЕорах потенцируются по сравнения с контра* турами в нормальном растворе Рингера и что параметры кодеиновых not трактур зависят от продолжительности инкубации мышцы в гипертонических растворах.

На основе собственных экспериментальных данных Епервие однозначно было определено, что в гипертонических растворах причиной угнетения сокращения в отеєт на электрическое раздражение является нарушение ЭЫС в мышечных волокнах.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Денервация угнетает одиночные сокращения скелетной мышцы лягушки и этот процесс зависит от истощения НМЛ в денервированноР мышце. Тетанические сокращения инервированной и денервироЕанной мь шцы не отличаются друг от друга по амплитуде.

4. Предварительное тетаническое раздражение и СІ07 потении pj ют одиночные сокращения обеих мышц, причем степень потвнциации вы: в денерЕированкых, чем в инерЕироЕанных мышцах.

5. Денервация потенцирует кодеиновые контрактуры скелетных мышц и этот процесс не зависит от истощения НМЛ в денервированной мышце. Иотенциация кофеиновой контрактуры выявляется с 8 дня поел денервации.

6. Денервация скелетной мышцы в определенных условиях ЕЛИЯЄ на сократительный ответ симметричной ей инервированной мышцы при воздействии кофеина.

S3. При денервации происходит снижение мокрого Ееса скелетной мышцы, тогда как сухой вес остается неизменным.

6. Денервация не изменяет белковый состав, АТФазнуп активна и ССП миозина В, полученного из скелетной мышцы лягушки.

7. Гипертонические растворы угнетачт одиночные и тетанические сокращения скелетной мышцы лягушки.

8. СЮ^ частично или полностью предотвращает угнетающее рлия-иие гипертонических растворов на одиночные сокращения скелетної* мыш-ды.

9. Гипертонические растворы потрнцирутот кодеиновые контрактуры скелетной мыпщы относительно контрактуры в нормальном растворе 'ингера и характер потенциации зависит от продолжительности янкуба-іии мыпцы в гипертоническом растворе.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа относится к числу фундаментальных исследований. Полученные данные о влиянии іенернации и некоторых фактороЕ модифицирующих сократительный про-іесс на скелетных мышцах расширяет наши представления как о регулирующем влиянии нерЕной системы на скелетные мыпцы, так и об интим-шх механизмах, обеспечивающих ЭМС в скелетных мышечных волокнах, 'озульгати исследования могут быть включены в лекционные курсы по физиологии Е ВУЗах медико-биологического профиля.

Изучение механизмов денерЕационного синдрома в скелетных мыш-іах кроме теоретического, имеет и практическое значение для клини-:еской медицины. В частности, на основе анализа полученных экспери-:ентальных данных мо.т.но создать правильное представление о причинах лда клинических заболеваний нерЕно-мышечной системы, таких, как яостения, параличи двигательной системы различного характера и др. Апробация. Результаты исследования были доложены на: ГУ рсе-огазной межуниверситетской конференции по "Биологии клетки" (Тбили-я, 1985); Всесоюзной конференции, посвященной 100-летию со дня роя-ения акад. И.С.Беритаквили "Современные проблемы физиологии нервно!* мышечной систем" (Тбилиси, 1985); У конференции молодых физиологов акавказья (Баку, 1985); Всесоюзной конференции, посвященной 50-ле-й-о Института физиологии им. И.С.Бериташвили АН Грузии "Современные роблемы нейроблологид" (Тбилиси, 1986); УП Всесоюзном симпозиуме Биофизика а биохимия биологической подвизности" (Пущино-на-Оке, 387); на заседании общества физиологов Грузии (Тбилиси, 1987).

Публикации: Основные положения диссертации опубликованы в 14 зботах.

методі; исследования

Опыты проводились на скелетных мышцах лягушки B&na ridibunda Общее количество животных, использованных е опытах равнялось 216; из них были оперироЕаны 186. Лягушки хранились в бытовом холодильнике при температуре 2-5С (I группа), 8-ЮС (П группа) или при комнатной температуре 20-25С (Ш группа). Денервацию одной задней конечности лягушки проводили под легким збірним наркозом /К1гЪу A.O.ct al.,I973/. Опыты ставились на инервированных и денервирован-ных целых пзртняжних мышцах лягушки. Дли отого прорезалось поясничное сплетение на одной стороне. Мышцы второй конечности слудили контролем. Опыты на донервировашшх мышцах проводили через 3-47 дней после перерезка нерва. Угнєтепие норвно-шшочной передачи (НШ) пос-ле денерЕации мышцы определялось сокращением кввди в ответ на раздражение дистального конца перерозанного нерва перед изолированном тестируемой мышцы. Потом изолированную шину помещали в специальной камере.

Мышцу раздракали прямоугольными импульсами с помощью хлор-сорабряных электродов. Амплитуда импульсов, пригоняемых в експериментах в полтора раза превышала амплитуду импульсов, которые требовались для получения максимального одиночного сокращения мзгащы. Длительность импульсов равнялась 1-2 ко. Раздрааавдпе электроды прикладывались к дистальному концу портняаной шащы лягушки, которые фактически не содоркат окончаний нервного волокна /Лойова А., 1936/.

Регистрация сокращения проводилась в изотоническом реаиио. При регистрации сокращения мышца перемещала гранитовый стераень, пс груженный в ртуть, что меняло выходной сигнал датчика.

Обычно мышцы помещали в растворе Рингара, ко в отдельных сериях опытое, е зависимости от цели, приходилось менять концентрации того иле иного иона. В основном применялись следующие инкубационные растворы:

а) нормальный раствор Рингера: Ка 01- 115 кїі, КСІ - 2,5 r.il,
CaCI₂ - І,Є ДЙ /Adrian R.n.,I956/;

б) раствор Рднгера, в котором С1~ частично заменялся эквпмо-
ляряым количеством СЮ^;

в) гипертонические растворы, для получения которых в раеїво-
ре Рингера концентрация Na 01 увеличивалась в несколько раз.-0-
носительну» тоничность отих растворов определяли по формуле:

/ I + 0,008 (х - 115) / Т (I)

гдэ 1 - мшшшолярная концентрация NolG?. Например, при концентрации !fa 01 230 мМ относительная тоничность раствора равняется I.S2T / Baylor S.M.,Ootliker П., 1977/;

г) гипертонические растворы, где С1~ частично замещался эквимо-
лярным количеством СЮ7;

д) нормальний раствор Рянгера с добавлением 20$ раствора кофе
ина бензоата ігатрия или чистого кофеина. Коночная концентрация кодеи
на в этих растворах равнялась 4,6 а 8 \М;

К применяемым в опитах растворах, в некоторых случаях добавлялся дельта-туб окураріш в количестве 2 х ІО"^ьг/мл в целях блокирования нервио-кишечкой передачи. Раствора, применяемые в экспериментах, приготовлялись ала на буфере бикарбоната, или жа на буфере трис-НСІ так, что рН = 7,0 - 7,4. Опыты проводились при комлатной температуре (18-25С). Сырой sec ддервярованяых я деяервироваякых целых портняяяых мышц лягушка определяли взвешиванием этих мышц на торцпонннх весах. Для этой целя обе мшш в точение 10 млн инкубировались в растворе Рлпгора, поело чого перед взвешиванием мышцы капли раствора осторожно удаляли фильтровой бумагой. Для определения сухого веса эти же мышцы высушивали в течение часа в термостате при температуре 60С, а потом мышцы опять взвеаиЕаля.

Натуральный актомиознн (миозин 3) из инерЕированных и денер-вированных мышц задних конечностей лягушки получали по методу Сент-Дьордьи / Сеят-Дьердья А.,1947/. Для изучения скорости суперпреця-титации (СИЛ) я АТФазной активности миозина В использовали метод одновременной регистрации этих параметров /Гачечиладзе Н.Д.,Заали-швяли U.M..I970/. Белковый состав миозина В анализировали методом электрофореза в полиакряламидном геле в присутствии додецилсульфа-та натрия ДеЪвг К.,ОзЪогп и., 1964/. Сканирование полученных электрофореграмм проводили на денситометре.

Полученные данные обрабатывались статистически. Расчитывали средние арифметические и ах ошибки. Достоверность разницы указанных средних определялась по ^-критерию Стьюдекта /Лакин Г.в., 1973/.