Введение к работе
Актуальность темы. Влияние физиологически активных соединений на структурно-функциональную целостность биологических мембран остается нсгуальной проблемой экспериментальной биологии и физиологии. С ней напрямую аязаны особенности функционирования клеток крови и, в частности, эритроцитов в дорме, а также при действии различных факторов. (Владимиров ЮЛ, 1972; Каган В.Е., 1986; Бароненко В.А., 1988; Савич А.В., 1993). Несомненно, что в условиях экислительного стресса, развивающегося при ультрафиолетовом облучении, воздействии радиации, старении несомненное значение имеет активация или угнетение процессов свободнорадикального окисления (Harris М, 1992;Барабой В.И., 1993; Венков И.К., 1993; Гамалей И.А., 1999).
В норме окислительные процессы строго контролируются, причем важную роль в регуляции перекисного окисления выполняют различные ферментативные и неферментативные системы, значительное место среди которых занимают антиоксиданты (Кения М.В., 1993; Параннч В.А., 1999)
Избыточное образование перекисей липидов, в условиях окислительного стресса, приводит к серьезным нарушениям в биомембранах: полному окислению ненасыщенных жирных кислот, нарушению структуры и функции белков, нуклеиновых кислот, мембраносвязанных ферментов и, в конечном счете, к гибели клеток (Деев А.И., 1989; Зенков И.К., 1993; Бышевский А.Ш., 1994). Важно, что повреждающей эффект имеет не столько усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ), сколько истощение и срыв собственной защитной антиоксидантной системы клетки. Поэтому, в последние годы широко изучаются природные и синтетические антиоксиданты, а также их вклад в защиту мембран клеток от повреждающего действия свободнорадикального окисления (Меньщикова Е.Б., 1993; Kramer К., 1994; Трубников Г.А., 1997; Орлова СВ., 1999).
Таким образом, исследование факторов, которые вызывают изменение скорости ПОЛ, а также изучение механизмов действия веществ, способных снимать эти изменения, является актуальным. Возникает необходимость поиска и скрининга физиологически активных соединений антиокислительного действия, выявление их
специфических свойств, которые и позволяют регулировать свободнорадикальные реакции.
Цель и задачи исследования
Цель работы - оценить влияние природных и синтетических антиоксидантных препаратов на структурно - функциональное состояние эритроцитов крови собак в условиях моделирования окислительного стресса озоном. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Изучить структурно - функциональные изменения в эритроцитах крови собак, вызванные окислительным стрессом. Создать в условиях in vitro модель окислительного стресса посредством воздействия озона на эритроциты.
-
Провести скрининг биологически активных соединений буфатина, гутимина, мочевины, роданитов (тиоционатов) по механизмам антиоксидантного действия
-
Оценить характер действия антиоксидантов на эритроциты в условиях экспериментального окислительного стресса, вызванного озоном.
Научная новизна.Показаны изменения структурно - функциональных. свойств эритроцитов in vitro при моделировании окислительного стресса путем воздействия озоном в концентрации 1500 мкг\л.
Разработан новый метод для изучения антирадикальной активности в системе с озонированным физиологическим раствором.
Впервые исследованы антирадикальные и антиоксидантные свойства таких препаратов как: буфатин, роданистый гуанидин, роданистый аммоний, роданистый натрий. Изучены механизмы антиоксидантаого действия выше перечисленных веществ на клеточном уровне. Показана эффективность использования этих препаратов для сохранения структурно-функциональной целостности эритроцитов в условиях экспериментального окислительного стресса.
Выяснено, что восстановление структурно - функциональных свойств эритроцитов, вызванных воздействием озона, присуще всем изученным веществам. Буфатин наиболее активно проявлял свои антиоксидантные свойства. Данный препарат был эффективен в более низкой концентрации, чем другие исследованные вещества. Из группы роданитов наибольшую антиоксидантную активность проявлял
эоданистый гуанидин. Показано, что наиболее выраженными антирадикальными
жойствами обладает синтетический препарат гутимин, который был намного )ффективнее природных роданитов в условиях модельных экспериментов.
Пуактическая значимость паботы. Полученные в работе данные вносят :уществениый вклад в понимание механизма действия озона на эритроциты. 'азработанный нами метод позволяет провести обоснованный скрининг и оценку штиоксидантных свойств препаратов, которые могут использоваться, как лабилйзаторы свободнорадикалышх процессов. Результаты исследования могут ^айти свое применение в ветеринарии и медицине. Предлагаемый нами методический подход открывает перспективное направление поиска новых средств штиокислительного действия, эффективных при регуляции окислительных состояний, а также расширяет представления о механизмах их действия на шеточном уровне. Практическая ценность работы закреплена авторским :видетельством (N 2020945 от 23.11.89 г.) «Способ активации систем штиоксидантной защиты организма» и патентом на изобретение (N 2112982 от 10.06.98 г.) "Способ оценки антиокислительной активности химических и эиохимических соединений». Результаты исследования и разработанный метод используются при выполнении научно-исследовательских работ и ЦНИЛ НГМА.
Положения, выносимые на защиту.
І.Озон, в концентрации 1500 мкг/л озоно-кислородной смеси, воздействуя на этмытые от плазмы эритроциты собак, вызывает деструктивные изменения в мембране, нарушает структурно - функциональные свойства эритроцитов и ведет к разрушению 50 % клеток.
2.Препараты; буфатнн (10_9M), гутимин, роданистый аммоний, роданистый
"уанидин и роданистый натрий (10"^М) являются антиоксидантами. Данные
зещества проявляют антирадикальные и антиоксидантные свойства.
\нтирадикалъные свойства наиболее выражены у гутимина, антиоксидантные - у зуфатина.
3. Использование буфатина, гутимина, мочевины, роданистого аммония, роданистого гуанидина и роданистого натрия непосредственно перед воздействием эзоном приводит к снижению внеклеточного гемоглобина, увеличению количества
б
неразрушенных эритроцитов, снижению конечных продуктов перекисного
окисления липидов, уменьшению люофосфатидилхолина, увеличению количества холестерина и восстановлению структурно-функциональных свойств эритроцитов.
Апробаиия уаботы. Основные результаты диссертации докладывались на: Республиканской научно-практической конференции "Актуальные проблемы физико-химической медицины". Конаково,!988 год; Всесоюзном совещании "Люминесцннтный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение". Рига,1989 год; 3-й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант". Москва, 1989 год; Intercooference on "Regulation free radical reac". Varna, 1989 год; Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний. Горький, 1989 год; Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений принципы и подходы". Москва, 1989 год; Ppoceedings of 12 Osone World congress. Lille, 1995 год; 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Озон в биологии и медицине". Н. Новгород, 1995 год; 2 International Simposnim on Ozone Applications, Havana 1997 год; 3 Всероссийской научно - практической конференции "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" Н. Новгород, 1998 год.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация язложена ан а27 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 180 источников (113 отечественных и 67 зарубежных). Работа содержит 16 рисунков и 19 таблиц.